生物制药PPT教学课件-第二章 生物制药工程.ppt

1,第二章：生物制药工程基础,第一节培养基制备 第二节空气净化除菌 第三节微生物发酵与酶催化基本理论 第四节产物的提取与纯化,2,第一节 培养基制备,3,一、培养基主要成分及常用原料,培养基(media)用以培养各种生物的基质或营养液。其中含有生物生长发育所需要的营养物质、足够的能源和适宜的ph等。不同的生物所需要的营养成分各不一样,而且由于培养目的的不同,培养基的成分也不相同。培养基的种类很多，有液体也有固体培养基。但万变不离其宗，培养基的主要营养成分有：,1.碳源:是构成微生物细胞及代谢产物的碳架及所需的能量来源。直接作培养基的常用碳源物质有葡萄糖、蔗糖以及淀粉、糖蜜等。,4,2.氮源：是构成生物细胞蛋白质（包括酶）和某些代谢产物的主要成分。没有氮源，微生物发酵就不可能进行。氮源可分为有机氮和无机氮两大类。有机氮如：酵母抽提物、蛋白胨、玉米浆等，无机氮如：硫酸铵、硝酸钾、氨水等。 3.无机盐：钾、钠、镁、钙、锌、磷、硫等矿物质元素是构成微生物细胞的重要成分。还有锰、钼、铜、钴等微量矿物质元素对微生物的生长、代谢往往都是必不可少的。它们除与细胞质成分有关外，还可影响和调节细胞膜的通透性和渗透压等。,5,4.生长因子(是使生物细胞维持正常生长代谢必需的系列微量有机化合物)：如氨基酸维生素及生长激素等, 它可以纯化合物形式加入到培养基中，但生产上经常以富含生长因子的动植物组织抽提物(牛肉膏麦芽汁蛋白胨等)酵母等微生物菌体抽提物和糖蜜、玉米浆等作原料加入。 5.前体物质和促进剂：前体是指能直接被微生物细胞利用合成目的代谢产物，如红发夫酵母细胞可利用-蒎烯作前体物质合成虾青素。促进剂是对酶反应或微生物发酵起着重要促进和帮助的作用的试剂。如：纤维素酶生产时需加入麸皮等纤维素物质作诱导促进剂，可大大提高酶产量。,6,二、培养基的类型,在实验室中配制的适合微生物生长繁殖或累积代谢产物的任何营养基质，都叫做培养基(media)。由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型:,1、根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分，可以将培养基分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。,7,）天然培养基 ：天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料，其成分难以确切知道。用作这种培养基的主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。用这些物质配成的培养基虽然不能确切知道它的化学成分，但一般来讲，营养是比较丰富的，微生物生长旺盛，而且来源广泛，配制方便，所以较为常用，尤其适合于配制实验室常用的培养基。这种培养基的稳定性常受生产厂或批号等因素的影响。 ）合成培养基 ：合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养基，它是用已知化学成分的化学药品配制而成。这类培养基化学成分精确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。,8,）半合成培养基 ：在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。这种培养基在生产实践和实验室中使用最多。,、根据培养基的物理状态来区分，可以分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。 ）液体培养基 所配制的培养基是液态的，其中的成分基本上溶于水，没有明显的固形物，液体培养基营养成分分布均匀，易于控制微生物的生长代谢状态。,9,）固体培养基 在液体培养基中加入适量的凝固剂即成固体培养基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最为常用。固体培养基在实际中用得十分广泛。在实验室中，它被用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等。 ）半固体培养基 如果把少量的凝固剂加入到液体培养基中，就制成了半固体培养基。以琼脂为例，它的用量在0.21%之间。这种培养基有时可用来观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。,10,、根据培养基的用途来区分，可分为选择培养基、增殖培养基、鉴别培养基等。 ）选择培养基 在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。如链霉素、氯霉素等抑制原核微生物的生长；而制霉菌素、灰黄霉素等能抑制真核微生物的生长；结晶紫能抑制革兰氏阳性细菌的生长等。,11,）增殖培养基 在自然界中，不同种的微生物常生活在一起，为了分离我们所需要的微生物，在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基，这种培养基常用于菌种筛选和选择增菌中。在某种程度上讲，增殖培养基也是一种选择培养基。 ）鉴别培养基 在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助开快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基就是一种常用的鉴别性培养基。,12,有些培养基是具有选择和鉴别双重作用。例如食品检验中常用的麦康凯培养基是一例。它含有胆盐、乳糖和中性红。胆盐具有抑制肠道菌以外的细菌的作用（选择性），乳糖和中性红（指示剂）能帮助区别乳糖发酵肠道菌（如大肠杆菌）和不能发酵乳糖的肠道致病菌（如沙门氏菌和志贺氏菌）。 另外，根据培养基的营养成分是否“完全”，可以分为基本培养基、完全培养基和补充培养基，这类术语主要是用在微生物遗传学中。根据培养基用于生产的目的来区分，可以分为种子培养基和发酵培养基。还有专门用于培养病毒等寄生微生物的活组织培养基，如鸡胚等；专门用于培养自养微生物的无机盐培养基等。,13,三、培养基制备,（一）、培养基制备的基本方法和注意事项 、培养基配方的选定 同一种培养基的配方在不同著作中常会有某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严格按其规定进行配制外，一般均应尽量收集有关资料，加以比较核对，再依据自己的使用目的，加以选用，记录其来源。 、培养基的制备记录 每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终ph值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。,14,、培养基成分的称取 培养基的各种成分必须精确称取,并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上面钩做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧; 每种称取完毕后，即移放于右侧。 完全称取完毕后，还应进行一次检查。,15,4、培养基ph的初步调正 因培养基在加热消毒过程中、ph会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应进行ph的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低ph0.2，而肠浸液ph却会有显著的升高。 因此，对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的最终ph，保证培养基的质量。 ph调整后，还应将培养基煮沸数分钟，以利培养基沉淀物的析出。,16,5、培养基各成份的混合和溶化 培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最好使用不锈钢莴加热溶化，可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。 在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动、以防焦化、如发现有焦化现象、该培养基即不能使用，应重新制备。待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。如为琼脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后将两溶液充分混合。 在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的水分，最后必须加以补足。,17,、培养基的过滤澄清 液体培养基必须绝对澄清，琼脂培养基也应透明无显著沉淀，因此，须要采用过滤或其它澄清方法以达到此项要求。一般液体培养基可用滤纸过滤法，滤纸应折叠成折扇或漏斗形，以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂。 琼脂培养基可用清洁的白色薄绒布趁热过滤。亦可用中间夹有薄层吸水棉双层纱布过滤。新制肉、肝、血和土豆等浸液时、须先用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过滤。如过滤法不能达到澄清要求、则用蛋清澄清法(冷却至5560c的培养基放入大的三角烧瓶内，装入量不得超过烧瓶容量的1/2，每1000ml培养基加入12个鸡蛋的蛋白，强力振摇35分钟，置高压蒸汽灭菌器中、121c加热20分钟、取出趁热以绒布过滤即可)。,18,、培养基的分装 培养基的分装，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内。分装量不得超过容器装盛量的2/3。容器口可用垫有防湿纸的棉塞封堵，其外还须用防水纸包扎（现试管一般多有用螺旋盖者）。 分装时最好能使用半自动或电动的定量分装器。 分装琼脂斜面培养基时，分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面的量为洽当。 分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。每批培养基应另外分装20ml培养基于一小玻璃瓶中，随该批培养基同时灭菌，以为测定该批培养基最终ph之用。,19,、培养基的灭菌 一般培养基可采用121c高压蒸汽灭菌15分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。 某些畏热成分，如糖类，应另行配成20%或更高的浓液，以过滤或间歇灭菌法消毒，以后再用无菌操作技术、定量加于培养基。明胶培养基亦应用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入于经冷却约50c左右的培养基中。 琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷至55-60时，摆置成适当斜面，待其自然凝固。,20,、培养基的质量测试 每批培养基制备好以后，应仔细检查一遍，如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终ph。 将全部培养基放入361c恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。 用有关的标准菌株接种12管或瓶培养基，培养2448小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。,21,10、培养基的保存 培养基应存放于冷暗处，最好能放于普通冰箱内。放置时间不宜超过一周，倾注的平板培养基不宜超过3天。每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。,伊红美蓝琼脂培养基,羊血琼脂培养基,麦康凯琼脂培养基,gc琼脂培养基,22,（二）、培养基制备的实例,a.、淀粉原料的处理和糖化 1.淀粉原料筛选除杂 2.淀粉原料的粉碎 3.淀粉原料的糖化,23,b、糖蜜的处理,1.糖蜜的主要成分 （1）糖，4950%，因不同的原料和生产方法不同而异，主要是蔗糖 （2）胶体物质，510%，来自于原料 （3）灰分，1012% （4）生物素，110mg/kg(甘蔗)，0.040.06 mg/kg(甜菜) （5）ph值6.2(甘蔗)，7.4（甜菜） 对于发酵工业可以利用得的主要成分是：糖和生物素,24,2.用途 （1）发酵工业用原料，国内发酵生产的有：味精、酵母目前，国内酵母工业使用进口糖蜜为原料，带来了较大的工业污染， （2）使用糖蜜生产酒精 （3）使用糖蜜生产蒸馏酒姥姆酒，世界名酒，牙买加的国酒，在西方国家主要用于鸡尾酒的勾兑上。 （4）作为添加剂使用，柠檬酸发酵，作为添加剂使用。 （5）使用糖蜜发酵生产黄源胶，已有研究报道。,25,3.处理方法 处理目的： a.除去胶体性物质，降低糖蜜的粘度，提高发酵液的流动性， 有利于改善发酵过程中氧的传递。 b.脱色，除去有色物质,对产品的质量有影响，对微生物的生长和代谢有影响。 c.中和过量的酸碱性物质，除去部分对ph值有影响的缓冲性物质。,26,处理方法： a.冷酸通风沉淀法，即加酸后，通风， 使之 沉淀. 糖蜜经酸化后主要是除去 糖蜜中胶体性物 质，通风的目的 是除去一些挥发性物质。 b.加絮凝剂（pam） 聚丙烯酰胺（ pam）作为絮凝剂，可以促进 大分子物质的沉降，有利于糖蜜的澄清。,27,工艺过程：,原溶液（稀释） 40bx 调ph值(33.8) 絮凝 静置,絮凝剂的用量：8mg/l，静置时间：1小时,加热到90,c.活性炭吸附法 可以除去糖蜜中的有色物质，明显的降低糖蜜的色泽， 对发酵的产品的提出和产品质量有益。 缺点：活性炭的使用量较大，处理成本较高。,28,消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体 灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。,方法： 物理的方法：加热、过滤、辐射 化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭 微生物。主要破坏细菌 代谢机能。如重金属离 子，磺胺类药物及抗生 素等。,四、培养基的消毒与灭菌,1 灭菌的方法,29,（1）干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。 1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。 2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160170c）加热灭菌12h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。,（一）、加热法干热法和湿热法,30,3、注意事项： 1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法； 2）温度控制在180； 3）物品不能太挤； 4）温度降至70时才开箱门。 （2）湿热法 ：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。 湿热与干热灭菌效果的比较,热型 温度（）时间 布层内的温度（）灭菌效果 （h） 20层 40层 100层 湿热 90-105.3 3 101 101 101.5 完 全 干热 130-140 4 86 72 70.5 不 完 全,31,1、设备：高压灭菌锅 2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。 3、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。,（二）、高压蒸汽灭菌法,4、注意事项： 1）冷空气彻底排除； 2）加水； 3）压力降为“0”时方可打开。,32,原理：介质在有压力时阻隔微生物。 适用范围：许多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。 设备：蔡氏过滤器，滤膜过滤器。 优缺点：不破坏培养基成分，只适用少量滤液。需 大量无菌空气以及净化工作台。 注意事项： 1、压力适当； 2、无菌条件下进行； 3、防止渗透现象。,（三）、过滤除菌法,33,原理：紫外线波长在200300nm，具有杀菌作用，以265-266杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收；可产生臭氧和过氧化氢。杀菌效力与强度和时间的乘积成正比。 缺点：穿透力不大。距照射物1.2m为宜。 应用：无菌室，医院。 注意事项：对眼睛和皮肤有刺激作用。,（四）、辐射灭菌法,34,（五）、化学药品灭菌法,原理：应用化学制剂破坏细菌代谢机能。 杀菌剂如重金属离子； 抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。 注意：与药品的浓度高低，时间长短，微生物种类以及微生物所处的环境有关。 常用化学杀菌剂有：乙醇、醋酸、石碳酸 、福尔马林、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等,35,（六）、其他的灭菌法,1.常压蒸汽灭菌：对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基，含糖培养基等可采用此法。彻底灭菌则采用间歇灭菌方法。,2.煮沸灭菌法：适用注射器和解剖器皿，时间1015min。 3.超高温杀菌:135-150c和2-8s对牛乳和其它液态食品。优点 ：保持食品价值和营养成分。,4.射线灭菌：r射线，穿透力强，适用于堆积物品的灭菌。,36,2 影响消毒灭菌的因素,消毒剂的性质、浓度与作用时间 微生物的种类与数量 温度 酸碱度 有机物,37,第二节 空气净化除菌,在发酵工业中，绝大多数是利用好气性微生物进行纯种培养，空气则是微生物生长和代谢必不可少的条件。但空气中含有各种各样的微生物，这些微生物随着空气进入培养液，在适宜的条件下，它们会迅速大量繁殖，消耗大量的营养物质并产生各种代谢产物；干扰甚至破坏预定发酵的正常进行，使发酵产率下降，甚至彻底失败。因此，无菌空气的制备就成为发酵工程中的一个重要环节。,38,一、无菌空气的概念：发酵工业应用的“无菌空气”是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。,二、空气净化除菌方法：a.热杀菌 b.辐射杀菌 c.静电除菌 d.过滤除菌法（目前最常用的方法）,39,三、空气过滤除菌机理： 空气溶胶的过滤除菌原理与通常的过滤原理不一样，一方面是由于空气溶胶中气体引力较小，且微粒很小，常见悬浮于空气中的微生物粒子在052m之间，深层过滤所用的过滤介质-棉花的纤维直径一般为16 20m，填充系数为8时，棉花纤维所形成的孔隙为2050m；超细玻璃纤维滤板因纤维直径很小，为115m，湿法抄制紧密度较大，所形成的网格孔隙为055m。微粒随气流通过滤层时，滤层纤维所形成的网格阻碍气流直线前进，使气流无数次改变运动速度和运动方向，绕过纤维前进。这些改变引起微粒对滤层纤维产生惯性冲击、重力沉降、阻拦、布朗扩散、静电吸引等作用而将微粒滞留在纤维表面上。 包括以下作用：（1）惯性捕集作用；（2）拦截捕集作用；（3）扩散捕集作用；（4）重力沉降作用；（5）静电吸附作用,40,四、空气过滤除菌的流程 空气过滤除菌一般是把吸气口吸入的空气先进行压缩前过滤，然后进入空气压缩机。从空气压缩机出来的空气(一般压力在0.2mpa以上，温度120160c)，先冷却至适当温度(2025c)除去油和水，再加热至3035c，最后通过总空气过滤器和分过滤器(有的不用分过滤器)除菌，从而获得洁净度、压力、温度和流量都符合工艺要求的灭菌空气。一般，空气净化采取如图所示的工艺流程。,41,42,43,jpf多滤芯膜折叠空气过滤器）,44,第三节 微生物发酵与酶催化基本理论,基因(gene)这个名词是1909年由遗传学家约翰(w.johamsen)提出来的。基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、重组dna技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活细胞中，并使之无性繁殖（称之为“克隆“）和行使正常功能（称之为“表达“），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。,45,一、基因重组由哪些步骤组成,（1）从供体微生物细胞中，通过酶切消化或pcr扩增等方法，分离出带有目的基因的dna片段； （2）在体外，将重组dna分子； （3）将重组dna分子转移到适当的受体细胞，并与之一起增殖； （4）从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组dna分子的受体细胞克隆； （5）从这些筛选出来的受体细胞克隆中提取已经得到了扩增的目的基因，并作序列分析等鉴定； （6）将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，大量培养重组微生物，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的目的产物。,46,47,基因工程操作过程大致可归纳为以下主要步骤： 1.分离或合成基因（目的基因的制取）。 2.通过体外重组将基因插人载体（基因载体 的选取及dna的体外重组）; 3.将重组dna导人细胞（ dna重组体导入受体 细胞）; 4.扩增克隆的基因（受体细胞的繁殖扩增）; 5.筛选重组体克隆烟对克隆的基因进行鉴定或测序（克隆子的筛选和鉴定）; 6.控制外源基因的表达（目的基因的表达）; 7.得到基因产物或转基因动物、转基因植物.,48,基因工程的四大要素,一.基因工程工具酶和dna加工 二.基因克隆载体 三.目的基因 四.受体细胞,49,二、微生物发酵方法有哪些？,分批（间歇）法、半连续法、连续法、补料分批发酵法等。 1.分批式（fed-batch）: 是目前微生物培养的最基本的方式，即是以微生物的一个生长周期为一个生产周期，包括设备的灭菌、种子培养、发酵操作。 优点： （1）每一次进行重复的配料、灭菌、等操作，微生物培养可靠、安全。 （2）微生物发酵过程中，微生物的各个阶段的生理、代谢特征不同，易于控制。 缺点： （1）效率较低，每次发酵重复进行既是一种时间的浪费，又是原材料和能量和浪费。 （2）底物利用率低，分次分批发酵都存在一个微生物自身的增殖过程，增殖本身就是底物消耗的过程，这必然导致转化率的降低，例如，在ga的发酵过程中，微生物增殖所需要的c源占总c源的20%左右。 （3）分批发酵培养基中的底物浓度较高，增加了培养基的渗透压，不利于微生物的生长。,50,2. 连续操作 基本概念：当微生物菌体达到某一特定状态时，（这一状态可以是：菌体浓度、比生长速率、产物的比生成速率等），连续向反应器内流加混合底物（c、n、p），同时反应器排放等量的发酵液。 优点： 微生物处于一个稳定的底物浓度和产物浓度的环境中，从理论上讲，这种方式是最高效率的微生物培养方式？节省消耗（底物、能量） 缺点： (1)由于微生物菌种易发生变异，特别是代谢控制发酵所采用的菌种，大部分是经过诱变的突变菌株，其遗传性质非常不稳定，后期，当菌种发生变异或者说恢复突变的菌体占有优势时，发酵就意味着失败。 (2)长时间的连续培养，防止杂菌、phage的感染也是难以克服的问题。,51,三、固定化酶,1、固定化酶（immobilized enzyme）的定义:指限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。 2、固定化酶 的特点 （1）可以多次使用，酶的稳定性提高； （2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。 （3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制； （4）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少； （5）比水溶性酶更适合于多酶反应。,52,3、固定化酶的制备技术 （1）吸附法制备技术 （2）包埋法制备技术 （3）交联法制备技术 4、固定化酶反应的特性变化有哪些？ 酶活力的改变；稳定性提高；最适作用温度的改变；最适ph的改变；反应动力学常数的改变；相对酶活力与半衰期 5、酶反应器 （1）游离酶反应器；（2）固定化酶反应器,53,按其培养细胞的方式不同，这些反应可分为以下三类： 悬浮培养用反应器：如搅拌反应器、中空纤维反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器、气升式反应器、鼓泡式反应器； 贴壁培养用反应器：如搅拌反应器（微载体培养）、玻璃珠床反应器、中空纤维反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器； 包埋培养用反应器：如流化床反应器、固化床反应器,54,生物反应器的检测及控制 生物反应器的检测：是利用各种传感器及其他检测手段对反应器系统中各种参数进行测量，并通过光电转换等技术用二次仪表显示或通过计算机处理打印出来。 生物反应器过程检测的目的：为了提供对生物反应有影响的信息，便于对反应器进行适当的控制，而控制的最终目的，在于创造良好条件，使生物催化剂处于高效的催化活性状态，以使所进行的生物反应高速、高效、收率高，降低原材料和能量消耗，同时保证产品质量。 生物反应器的控制主要包括：温度、ph、溶氧浓度、基质和细胞浓度等(见表2-7)。,55,56,通用式发酵罐,57,自吸式发酵罐,自吸式发酵罐使用的是带中央吸气口的搅拌器。搅拌器由从罐底向上伸人的主轴带动，叶轮旋转时叶片不断排开周围的液体使其背侧形成真空，于是将罐外空气通过搅拌器中心的吸气管而吸人罐内，吸人的空气与发酵液充分混合后在叶轮末端排出，并立即通过导轮向罐壁分散，经挡板折流涌向液面，均匀分布。,58,59,60,第四节、产物的提取与纯化,61,一、发酵液的预处理和细胞的分离及破碎,发酵液的预处理：（1）加热处理；（2）凝聚和絮凝；（3）使用助滤剂 细胞分离： 过滤（原理：是原料通过固态过滤介质时，使细胞等固态悬浮物与溶液分离） 离心分离：离心机是利用转鼓高速转动所产生的离心力，来实现悬浮液、乳溶液的分离或浓缩的分离机械。（习惯上把离心机分为：过滤式离心机、沉降式离心机和分离机。）,62,细胞破碎： 破碎的方法： 机械破碎法 化学处理法 （具体的工艺有： 渗透压破碎； 洗涤剂溶解； 类脂溶解； 酶消化分解； 碱处理等） -酶消化分解法,人类胚胎干细胞,血细胞,神经细胞,神经细胞（突触）,红细胞,免疫荧光细胞,63,64,细胞膜 结构示意图,65,二、产物的提取,a.沉淀法提取技术：有机溶剂沉淀、等电点沉淀法、盐析沉淀、加热沉淀、沉淀分离过程的放大 b.萃取分离技术：溶剂萃取、双水相萃取 c.离子交换提取技术：离子交换设备根据操作方式不同：可分为静态和动态交换设备两大类。,66,d.吸附分离技术：（一）吸附：是利用固体（吸附剂）对液体或气体中某一组分具有选择吸附的能力，使其富集在固体表面上。 （二）根据吸附质与吸附剂之间存在的吸附力性质不同：可分为物理吸附和化学吸附。 （三）吸附分离操作方法：间歇吸附、连续搅拌槽操作、固定床吸附过程。,67,e.膜分离和超滤：,68,69,三、产物的纯化与精制,色谱分离技术 电泳分离技术 蒸发浓缩与 结晶技术 干燥技术,70,71,72,73,2019/2/7,74,1 厂 房设计和施工 厂房布局 厂房应选择在大气含尘、含菌浓度低，无有害气体，自然环境好，对药品质量无有害因素，卫生条件较好的区域。 生产区应与生活区、餐厅相互分开，不得互相防碍。 厂房设计时还应考虑风向。 特殊生产区域（如生产青霉素类等高致敏药品）应使用独立厂房和设施。 药材的前处理、提取、浓缩等操作，不得与其制剂生产使用同一厂房。,四.工业制药生产设备的要求,2019/2/7,75,厂区环境 通过绿化（种植草坪和树木）及其它一些措施，使生产区无裸土地面 绿化应选用不产生花絮、花粉、绒毛等对环境有不良影响的树种,2019/2/7,76,厂房内部设计 厂房内表面应平整光滑、无裂缝、接口严密、不积聚灰尘，无脱落物，便于清洁。 地面、墙壁和顶棚等，应使用发尘最小的建筑材料，并经得起消毒、清洁和冲洗。 厂房内的墙壁与地面、天花板的交界处应做成弧形，以减少灰尘积聚和便于清洁。 厂房内安装的水池、下水道不得对药品生产带来污染。100级洁净区内不得设置地漏。 洁净区与非洁净区之间应设置缓冲间，并有互锁装置。 厂房应能防止昆虫、鸟类、鼠类等动物的进入。,2019/2/7,77,按生产工艺流程及所要求的空气洁净级别进行合理布局。 相互联系的洁净级别不同的房间之间要有防止污染措施。 有相应措施来保证不同操作不在同一区域同时进行。 人流、物流设计应合理、简单，防止产生交叉污染。 物流设计原则： 不同状态的物流避免交叉、重叠 按物料加工顺序设计物料流向 物流通道不可穿过生产区域,车间布局,2019/2/7,78,生产环境参数要求 温湿度，房间温湿度取决于以下要求： 生产工艺 中间产品及生产中所使用物料的贮存 人体的舒适 压差 通风量 换气次数,2 空气净化系统,2019/2/7,79,空气净化系统的空气处理措施 空气过滤。过滤器的分类：,2019/2/7,80,气流组织与换气 为了达到特定目的而在室内造成一定的空气流动状态与分布，通常叫做气流组织。 洁净房间组织气流的基本原则是： 最大限度地减少涡流； 使气流经过最短流程尽快覆盖工作区； 希望气流方向能与尘埃的重力沉降方向一致，并使回流能有效地将室内灰尘排出室外。,2019/2/7,81,气流组织的方式： 乱流方式，主要是利用稀释作用，使室内尘源产生的灰尘均匀扩散而被“冲淡”。它的原则是满足工艺和人的卫生要求，避免涡流把工作区外的灰尘卷入工作区，以减少药物被污染的机会。一般采用上送下回的形式，使气流自上而下，与尘粒重力方向一致。适合于10000 300000极洁净区。,2019/2/7,82,气流组织的方式： 层流方式，指流线平行、流向单一、具有一定的和均匀的断面速度的气流组织方式。送入房间的气流充满整个洁净室断面，它象“活塞作用”那样把室内随时产生的灰尘压至下风侧，在把灰尘排至室外，可达到100级洁净度。层流方式分为垂直层流和水平层流两种。,2019/2/7,83,送风方式与换气次数: 送风方式 垂直层流（100级）：顶送下回 水平层流（100级）：侧送侧回 乱流（10000级）：顶送侧回 乱流（100000300000级）：顶送侧回、上送上回 送风量 换气次数 (送风量与房间体积的比值),2019/2/7,84,压力控制 为了维持洁净室的洁净度免受邻室的污染或者污染邻室，在洁净室内维持其一个高于邻室或低于邻室的空气压力，同时为了防止外界污染物随空气从围护结构的门窗或其它缝隙滲入洁净室内，以及防止当门开启后空气从低洁净区流向高洁净区，必须使洁净室对相邻房间或走廊维持一个正的静压差或负的静压差。,2019/2/7,85,洁净室的压差原则： 洁净室必须维持一定的正压。不同等级的洁净室之间的静压差应大于5pa，洁净室（区）与室外的的静压差应大于10pa。 空气洁净度级别相同的区域，产尘量大的操作室应保持相对负压。 青霉素类等强致敏性药物及其它易产生污染的区域应保持相对负压。,2019/2/7,86,洁净室排风和回风的设计原则： 洁净室（区）的净化空气如可循环使用，应采取有效措施避免污染和交叉污染。 产尘量大的洁净区域经捕尘处理仍不能避免交叉污染时，其空气净化系统不得利用回风。 洁净室内产生粉尘和有害气体的工艺设备，应设局部排风装置。,2019/2/7,87,主要消毒灭菌方法 干热法 湿热法 药物法 电磁辐射法,3 洁净室消毒灭菌措施,2019/2/7,88,紫外线消毒灭菌 臭氧消毒 气体灭菌，甲醛熏蒸等 消毒剂灭菌，常见的消毒剂有：乙醇（75）、异丙醇（75）、戊二醛、新洁尔灭等,2019/2/7,89,饮用水 符合生活用水标准 纯化水 制备：过滤/粒子交换/反渗透 控制指标：重金属/电导率/toc/微生物 注射用水 制备：蒸馏/膜过滤 控制指标：ph 值/电导率/toc/微生物/ 细菌内毒素,4 生产用水系统,2019/2/7,90,水处理的对象: 电解质，指在水中以离子状态存在的物质。通常可用电导率来反映电解质类杂质在水中的相对含量。 有机物，通常用测量水中总有机含碳量（toc）的方法来分析此类物质在水中的含量。 颗粒物质，可用颗粒计数器来测定这些杂质在水中的含量。 微生物，包括细菌、霉菌、病毒和热原等。 溶解气体等。,2019/2/7,91,水的净化技术: 前处理，有主要是通过过滤、活性炭吸附等方法初步去除水中的悬浮物、胶体、微生物等，并消除过高的硬度和浊度。 脱盐（去离子），有电渗析、反渗透、离子交换等。 后处理（精处理），一般包括：用终端离子交换去除离子痕迹、紫外杀菌、高温杀菌、超过滤、微孔过滤等。,2019/2/7,92,纯化水、注射用水的制备、储存和分配要求： 储罐和输送管道所用材料应无毒、耐腐蚀，应采用优质低碳不锈钢（如：316l等），内表面光滑（焊缝）。 管路设计应避免死角、盲管， 分支管径比（直径/长度）：1/31/6。 注射用水储罐的通气口应安装不脱落纤维的疏水性除菌滤器。 注射用水的储存可采用80以上保温、65以上保温循环或4以下存放。 纯化水的储存宜采用循环方式。 应定期监控、清洁、消毒灭菌。,2019/2/7,93,材质要求 与药品直接接触的设备材质应无毒、耐腐蚀、不与药品发生化学变化或吸