广西地方标准《猪蓝耳病病毒美洲型经典株、变异株以及欧洲型毒株的检测多重反转录聚合酶链反应法》（征求意见稿）.doc

ICS 11.220 B 41 DB45 广西壮族自治区 地方标准 DB 45/T XXXXXXXXX 猪蓝耳病病毒美洲型野毒株和疫苗株的 猪蓝耳病病毒美洲型经典株、变异株 以及欧洲型毒株的检测 多重反转录 聚合酶链反应法 Multiplex RT-PCR for detection of classical and variant strain of North American genotype and European genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 （征求意见稿） （本稿完成日期：2015 年 11 月 15 日） XXXX - XX - XX 发布XXXX - XX - XX 实施 广西壮族自治区质量技术监督局 发 布 DB45/T XXXXXXXXX I 目 次 前言II 1 范围1 2 术语和定义1 3 材料准备2 3.1 试剂2 3.2 仪器设备及耗材2 4 操作方法3 4.1 操作环境3 4.2 待检样品处理3 4.3 待检样品总 RNA 提取.3 4.4 反转录(RT)3 4.5 PCR 扩增 .3 4.6 阴性及阳性对照3 5 结果判定4 5.1 琼脂糖凝胶制备4 5.2 加样4 5.3 电泳条件4 5.4 结果判定4 附录 A（规范性附录） 引物序列、扩增片段及结果判定 .5 附录 B（规范性附录） 试剂盒 .8 附录 C（规范性附录） 重组质粒标准品制备 10 DB45/T XXXXXXXXX II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出并归口。 本标准起草单位：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：施开创、蒙振亩、张步娴、莫胜兰、王海清、尹彦文、韦建华、胡杰、李军。 DB45/T XXXXXXXXX 1 猪蓝耳病病毒美洲型经典株、变异株以及欧洲型毒株的检测 多重 反转录聚合酶链反应法 1 范围 本标准规定了用于鉴别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株、变异株以及欧洲型毒株的多 重反转录聚合酶链反应法的材料准备、操作方法及结果判定。 本标准适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株、变异株以及欧洲型毒株的鉴别检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒 porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV 又称猪蓝耳病病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，其基因组为单股正链 RNA。 2.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典株 classical porcine reproductive and respiratory syndrome virus，C-PRRSV 指在病毒 Nsp2 蛋白第 481 位和第 533561 位氨基酸未出现缺失的、以 VR-2332 毒株为代表的美 洲基因型猪繁殖与呼吸综合征病毒。 2.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型变异株 highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV 指在病毒 Nsp2 蛋白第 481 位氨基酸和第 533561 位氨基酸出现 30 个氨基酸的不连续缺失为特 征的、以 JXA1毒株为代表的高致病性美洲基因型猪繁殖与呼吸综合征病毒。 2.4 猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型毒株 European genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus，EU-PRRSV 指以Lelystad virus( LV) 毒株为代表的欧洲基因型猪繁殖与呼吸综合征病毒。该型毒株最早在 欧洲分离得到。 2.5 反转录 reverse transcription，RT 以RNA为模板合成互补脱氧核糖核酸（cDNA）的过程。 DB45/T XXXXXXXXX 2 2.6 聚合酶链反应 polymerase chain reaction，PCR 是一种由热变性复性延伸三步反应组成一个循环，经多次循环反应，在体外快速扩增特定脱 氧核糖核酸（DNA）片段的方法。 2.7 多重聚合酶链反应 multiplex polymerase chain reaction，Multi-PCR 简称多重 PCR，是 PCR 技术的一种特殊形式。指在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增多个 模板的 PCR 技术。 3 材料准备 3.1 试剂 3.1.1 特异性引物 引物序列见附录 A 中的表 A.1，上、下游引物的使用浓度均为 25 pmol/L。 3.1.2 RNA 抽提试剂盒 商业化的 RNA抽提试剂盒主要成分见附录B 中的 B.1，使用前经技术验证合格。 3.1.3 RT-PCR 试剂盒 商业化的 RT-PCR 试剂盒主要成分见附录B 中的 B.2，使用前经技术验证合格。 3.1.4 电泳缓冲液 商业化的电泳缓冲液主要成分见附录B 中的 B.3，使用前经技术验证合格。 3.2 仪器设备及耗材 3.2.1 仪器设备 本方法使用下列仪器设备： a）生物安全柜； b）普通 PCR 仪； c）高速台式冷冻离心机； d）电热恒温水槽； e）混匀器； f）组织匀浆机； g）凝胶成像系统； h）微量移液器。 3.2.2 一次性耗材 一次性耗材如下： a）乳胶手套； b）离心管； c）PCR 反应管； d）吸头。 注：离心管、PCR 反应管、吸头等应使用无 RNA 酶的一次性塑料制品，否则应在使用前经 DEPC水处理，然后用 DB45/T XXXXXXXXX 3 1.034105 Pa 高压灭菌 30 min。 4 操作方法 4.1 操作环境 以下操作应在生物安全II级或II级以上防护实验室内、无RNA酶的环境下进行。 4.2 待检样品处理 采取病猪的肺脏、脾脏和淋巴结等组织共约1 g，置于 2.0 mL 离心管中，加入灭菌的1 mol/L PBS（pH 7.2）1 mL，用组织匀浆机充分研磨后，反复冻融 3 次；细胞培养物则直接反复冻融 3 次。 以10 000 g离心 5 min，收集上清，用于总 RNA 抽提，或置 -20 保存备用。 血清样品直接用于总 RNA 抽提，或置 -20 保存备用。 4.3 待检样品总 RNA 提取 取 200 L 待检样品于无 RNA 酶的 1.5 mL 离心管中，按照 RNA 提取试剂盒操作说明书抽提总 RNA 。 4.4 反转录(RT) 提取样品总 RNA 后，以样品总 RNA 为模板，按下列反应体系进行反转录，获得 cDNA。-20 保存 备用。 a）10RT 缓冲液：1L； b）AMV反转录酶（5 U/L）：0.5L； c）dNTP混合物（各10mM/L）：1L ； d）RNA酶抑制剂（40 U/L）：0.25L； e）MgCl2 溶液（25 mM/L）：2L； f）随机引物9聚体（50pmol/L）：0.5L； g）待检总 RNA 模板：2 L； h）灭菌双蒸水：补足总体积至 10 L。 加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反应管置于普通 PCR 仪内进行反转录。反应程序为：30，10 min；42，30 min；95，5 min。获得的cDNA直接用于多重PCR 扩增，或置 -20保存备用。 4.5 PCR 扩增 反转录后，以获得的cDNA 为模板,建立 50 L PCR 反应体系。在冰浴条件下，在 PCR 反应管中按 下列用量分别加入各成分： a）5 RT buffer:10 L； b）Ex Taq HS 聚合酶（5 U/L）：0.25 L； c）EU-ORF5 上、下游引物（25 pmol/L）：各 1 L； d）CO-ORF7 上、下游引物（25 pmol/L）：各 0.5 L； e）AM-Nsp2 上、下游引物（25 pmol/L）：各 1 L； f）cDNA 模板：5 L； g）灭菌双蒸水：补足总体积至 50 L。 加完试剂后瞬时离心混匀。将 PCR 反应管置于 PCR 仪内，反应程序为：94 2 min；然后94 DB45/T XXXXXXXXX 4 30 s，56.2 30 s,72 45 s,循环35次；最后72 10 min。PCR 产物直接用于电泳，或置 4 保存备用。 4.6 阴性及阳性对照 4.6.1 阴性对照 用灭菌双蒸水作为阴性对照。 4.6.2 阳性对照 用重组质粒 p-AM-ORF7、p-EU-ORF7、p-EU-ORF5、p-Nsp2-VR2332和p-Nsp2-JXA1混合物作为阳性 对照。 注：重组质粒 p-AM-ORF7、p-EU-ORF7、p-EU-ORF5、p-Nsp2-VR2332和p-Nsp2-JXA1的制备方法见附录C。 5 结果判定 5.1 琼脂糖凝胶制备 称取 1.5 g 琼脂糖加入到 100 mL 1 倍电泳缓冲液，煮沸溶解琼脂糖，冷却至约 50 时，加入 10 mg/mL 的 GelRED 10 L，充分混合后倒入水平的已插入合适梳子的凝胶盘中，凝胶厚度控制在 3 mm5 mm 之间。待凝胶充分凝固后，拔出梳子，将凝胶连同托架一起放入电泳槽中(加样孔一侧放置于 负极)，加入 1 倍电泳缓冲液，使之没过凝胶表面约 2 mm，以备加样电泳。 注：GelRED为商业化的、PCR产物凝胶电泳时所需溴化乙锭（EtBr）的替代品。 5.2 加样 将 5 L RT-PCR 产物与 1 L 加样缓冲液混合均匀，加入一个琼脂糖凝胶样品孔中。每次电泳应加 阳性和阴性对照的扩增产物，并且设立 DNA 分子质量标准作为分子质量大小的对照。 5.3 电泳条件 以100 V稳压进行电泳，直至溴酚蓝指示剂到达离琼脂糖凝胶末端 2 cm3 cm 时停止。 5.4 结果判定 5.4.1 将电泳后的琼脂糖凝胶用凝胶成像系统观察并拍照。当阴性对照无任何 DNA 扩增带，而阳性 对照在 614 bp、433 bp、398 bp、338 bp 和 248 bp 位置出现 DNA 扩增带，则试验结果成立；否则，此 次检测无效。 5.4.2 若被检样品在 433 bp 和 338 bp 位置出现 DNA 扩增带，判定为 C-PRRSV 阳性，记为 C- PRRSV（+）；若被检样品在 433 bp 和 338 bp 位置未出现 DNA 扩增带，判定为 C-PRRSV 阴性，记为 C- PRRSV（-）。 5.4.3 若被检样品在 433 bp 和 248 bp 位置出现 DNA 扩增带，判定为 HP-PRRSV 阳性，记为 HP- PRRSV（+）；若被检样品在 433 bp 和 248 bp 位置未出现 DNA 扩增带，判定为 HP-PRRSV 阴性，记为 HP-PRRSV（-）。 5.4.4 若被检样品在 614 bp 和 398 bp 位置出现 DNA 扩增带，判定为 EU-PRRSV 阳性，记为 EU- PRRSV（+）；若被检样品在 614 bp 和 398 bp 位置未出现 DNA 扩增带，判定为 EU-PRRSV 阴性，记为 EU-PRRSV（-）。 DB45/T XXXXXXXXX 5 注：多重 RT-PCR 产物凝胶电泳结果图见附录A中的图A.1。 DB45/T XXXXXXXXX 6 附 录 A （规范性附录） 引物序列、扩增片段及结果判定 A.1 PRRSV 特异性引物序列及扩增片段长度 引物序列及扩增片段长度见表 A.1 表 A.1 引物序列及扩增片段长度 引物名称引物序列（53）针对毒株扩增片段长度（bp） CO-ORF7-FATGGCCAGCCAGTCAATCA CO-ORF7-RTCGCCCTAATTGAATAGGTG C-PRRSV/HP-PRRSV /EU-PRRSV433/398 AM-Nsp2-FGGCGGCAATGTCCCTAAC AM-Nsp2-RGCCTCATATTCAGTCTGTG C-PRRSV/HP-PRRSV338/248 EU-ORF5-FCTGCAATGAGGTGGGCTACAAC EU-ORF5-RTAACCCCTTCGAGGACGACAT EU-PRRSV614 注：CO-ORF7-F和CO-ORF7-R引物对扩增C-PRRSV和HP-PRRSV时长度为433 bp，扩增EU-PRRSV时长度为398 bp；AM-Nsp2- F和AM-Nsp2-R引物对扩增C-PRRSV时长度为338 bp，扩增HP-PRRSV时长度为248 bp；EU-ORF5-F和EU-ORF5-R引物对 扩增EU-PRRSV时长度为614 bp。 A.2 扩增的目的基因片段 A.2.1 扩增的C-PRRSV ORF7基因目的片段 CO-ORF7-F/CO-ORF7-R引物对扩增C-PRRSV和HP-PRRSV ORF7基因中433 bp 的片段。扩增C-PRRSV代 表毒株VR-2332株（GenBank 登录号：AY150564）Nsp2基因目的片段的核苷酸序列如下： ATGGCCAGCCAGTCAATCAGCTGTGCCAGATGCTGGGTAAGATCATCGCTCAGCAAAACCAGTCCAGAGGCAAGGGACCG GGAAAGAAAAATAAGAAGAAAAACCCGGAGAAGCCCCATTTTCCTCTAGCGACTGAAGATGATGTCAGACATCACTTTAC CCCTAGTGAGCGGCAATTGTGTCTGTCGTCAATCCAGACCGCCTTTAATCAAGGCGCTGGGACTTGCACCCTGTCAGATT CAGGGAGGATAAGTTACACTGTGGAGTTTAGTTTGCCTACGCATCATACTGTGCGCCTGATCCGCGTCACAGCATCACCC TCAGCATGATGGGCTGGCATTCTTGAGGCATCTCAGTGTTTGAATTGGAAGAATGTGTGGTTAACGGCACTGATTGACAT TGTGCCTCTAAGTCACCTATTCAATTAGGGCGA 注：引物CO-ORF7-F/CO-ORF7-R扩增C-PRRSV ORF7基因和HP-PRRSV ORF7基因目的片段的长度均为433 bp，且其代表 毒株VR-2332株和JXA1株的同源性达到93.76%，故只构建基于C-PRRSV代表毒株VR-2332株ORF7基因的重组质粒 p-AM-ORF7，作为扩增 C-PRRSV和HP-PRRSV ORF7基因的阳性对照。 A.2.2 扩增的EU-PRRSV ORF7基因目的片段 DB45/T XXXXXXXXX 7 CO-ORF7-F/CO-ORF7-R引物对扩增EU-PRRSV ORF7基因中398 bp 的片段。扩增代表毒株LV株 （GenBank 登录号：M96262）ORF7基因目的片段的核苷酸序列如下： ATGGCCAGCCAGTCAATCAACTGTGCCAGTTGCTGGGTGCAATGATAAAGTCCCAGCGCCAGCAACCTAGGGGAGGACAG GCCAAAAAGAAAAAGCCTGAGAAGCCACATTTTCCCCTGGCTGCTGAAGATGACATCCGGCACCACCTCACCCAGACTGA ACGCTCCCTCTGCTTGCAATCGATCCAGACGGCTTTCAATCAAGGCGCAGGAACTGCGTCGCTTTCATCCAGCGGGAAGG TCAGTTTTCAGGTTGAGTTTATGCTGCCGGTTGCTCATACAGTGCGCCTGATTCGCGTGACTTCTACATCCGCCAGTCAG GGTGCAAGTTAATTTGACAGTCAGGTGAATGGCCGCGATTGGCGTGTGGCCTCTGAGTCACCTATTCAATTAGGGCGA A.2.3 扩增的C-PRRSV Nsp2基因目的片段 AM-Nsp2-F/AM-Nsp2-R引物对扩增C-PRRSV Nsp2基因中338 bp 的片段。扩增代表毒株VR-2332株 （GenBank 登录号：AY150564）Nsp2基因目的片段的核苷酸序列如下： GGCGGCGATGTCCCTAACAGTTGGGAAGATTTGGCTGTTAGTAGCCCCTTTGATCTCCCGACCCCACCTGAGCCGGCAAC ACCTTCAAGTGAGCTGGTGATTGTGTCCTCACCGCAATGCATCTTCAGGCCGGCGACACCCTTGAGTGAGCCGGCTCCAA TTCCCGCACCTCGCGGAACTGTGTCTCGACCGGTGACACCCTTGAGTGAGCCGATCCCTGTGCCCGCACCGCGGCGTAAG TTTCAGCAGGTGAAAAGATTGAGTTCGGCGGCGGCAATCCCACCGTACCAGGACGAGCCCCTGGATTTGTCTGCTTCCTC ACAGACTGAATATGAGGC A.2.4 扩增的HP-PRRSV Nsp2基因目的片段 AM-Nsp2-F/AM-Nsp2-R引物对扩增HP-PRRSV Nsp2基因中248 bp 的片段。扩增代表毒株JXA1株 （GenBank 登录号：EF112445）Nsp2基因目的片段的核苷酸序列如下： GGCGGCGATGTCCCTAACGGTTCGGAAGAAACTGTCGGTGGTCCCCTCAATTTTCCGACACCATCCGAGCCGATGACACC TATGAGTGAGCCCGTACTTGTGCCCGCGTCGCGACGTGTCCCCAAGCTGATGACACCTTTGAGTGGGTCGGCACCAGTTC CTGCACCGCGTAGAACTGTGACAACAACGCTGACGCACCAGGATGAGCCTCTGGATTTGTCTGCGTCCTCACAGACTGAA TATGAGGC A.2.5 扩增的EU-PRRSV ORF5基因目的片段 EU-ORF5-F/EU-ORF5-R引物对扩增EU-PRRSV ORF5基因中614 bp 的片段。扩增代表毒株LV株 （GenBank 登录号：M96262）ORF5基因目的片段的核苷酸序列如下： CTGCAATGAGGTGGGCTACAACCATTGCTTGTTTGTTCGCCATTCTCTTGGCAATATGAGATGTTCTCACAAATTGGGGC GTTTCTTGACTCCGCACTCTTGCTTCTGGTGGCTTTTTTTGCTGTGTACCGGCTTGTCCTGGTCCTTTGCCGATGGCAAC GGCGACAGCTCGACATACCAATACATATATAACTTGACGATATGCGAGCTGAATGGGACCGACTGGTTGTCCAGCCATTT TGGTTGGGCAGTCGAGACCTTTGTGCTTTACCCGGTTGCCACTCATATCCTCTCACTGGGTTTTCTCACAACAAGCCATT TTTTTGACGCGCTCGGTCTCGGCGCTGTATCCACTGCAGGATTTGTTGGCGGGCGGTACGTACTCTGCAGCGTCTACGGC GCTTGTGCTTTCGCAGCGTTCGTATGTTTTGTCATCCGTGCTGCTAAAAATTGCATGGCCTGCCGCTATGCCCGTACCCG GTTTACCAACTTCATTGTGGACGACCGGGGGAGAGTTCATCGATGGAAGTCTCCAATAGTGGTAGAAAAATTGGGCAAAG CCGAAGTCGATGGCAACCTCGTCACCATCAAACATGTCGTCCTCGAAGGGGTTA A.3 PRRSV 多重 RT-PCR 产物凝胶电泳图 PRRSV 多重 RT-PCR 产物凝胶电泳图见图 A.1。 DB45/T XXXXXXXXX 8 a 100 bp DNA分子质量标准； b 阳性对照； c EU-PRRSV（+）； d C-PRRSV（+）； e HP-PRRSV（+）； f 阴性对照 图 A.1 PRRSV 多重 RT-PCR 产物琼脂凝胶电泳图 B DB45/T XXXXXXXXX 9 附 录 B （规范性附录） 试剂盒 B.1 商业化的 RNA抽提试剂盒 主要成分包括： a）细胞裂解液； b）Proteinase K； c）Carrier RNA； d）洗液； e）无水乙醇； f）DEPC 水； g）过滤柱。 B.2 商业化的 RT-PCR 试剂盒 主要成分包括： a）10RT 缓冲液； b）AMV 反转录酶； c）dNTP混合物：包含 dATP、dTTP、dCTP、dGTP； d）RNA酶抑制剂； e）MgCl2 溶液； f）随机引物9聚体； g）5 RT buffer； h）Ex Taq HS 聚合酶。 B.3 商业化的电泳缓冲液 主要成分包括： a）tris； b）冰乙酸； b）EDTA。 B.4 胶回收试剂盒 主要成分包括： a）GM缓冲液； b）WB缓冲液； c）洗脱缓冲液； d）离心柱； DB45/T XXXXXXXXX 10 e）收集管。 B.5 T4 连接酶试剂盒 主要成分包括： a）T4 DNA连接酶； b）10T4 DNA 连接酶缓冲液。 B.6 质粒提取试剂盒 主要成分包括： a）RNase A（10