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分子生物学复习提纲一、重组DNA技术1、基本概念1) DNA克隆：获得DNA相同副本或拷贝的过程。2) 基因工程： 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组工艺学。3) 限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。4) DNA载体：携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。5) DNA体外重组：在DNA连接酶的催化作用下，将外源DNA分子（目的基因）与载体DNA分子连接成一个重组分子的过程。 6) 粘性末端：在双链DNA分子的末端，有一条链的3或5端比另一条链的3或5端要长，这样的双链DNA分子的末端称为粘性末端。7) 基因组DNA文库：存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。2、重组DNA技术的基本过程 1) 分2) 切3) 接4) 转5) 筛6) 表达3、重组DNA技术中常用工具酶有哪些？各有什么特点和作用。限制性核酸内切酶：识别特异序列，切割DNA。DNA连接酶：催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。DNA聚合酶：以DNA为模板合成双链DNA分子。4、作为基因工程载体所需具备的基本条件：1) 能自主复制2) 有多个单一酶切位点，称为多克隆位点（MCS），利于外源DNA分子插入3) 具有两个以上的选择性遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定4) 分子量小，以容纳较大的外源DNA5) 拷贝数高 6) 具有较高的遗传稳定性人工染色体载体包含的调控元件 7、人工接头有什么特点？有什么用途？人工接头特点：有限制性核酸内切酶的酶切位点人工接头用途：在平末端上形成粘性末端8、宿主细胞应具备的条件1) 处于感受态2) 对载体无严格限制 3) 限制酶和重组酶缺陷4) 不对外源DNA进行修饰 5) 能表达重组体所提供表型特征9、原核表达体系有什么特点？其优点：简单、迅速、经济、适合大规模生产 。不足：1) 不宜表达真核基因组DNA；2) 不能加工表达的真核蛋白质；3) 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体；4) 很难表达大量可溶性蛋白。10、真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）有什么特点？优点：1) 可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA2) 可适当修饰表达的蛋白质3) 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、不经济二、基因表达调控与基因诊断 （一） 概念：基因表达、基因表达的时间特异性、基因表达的空间特异性、组成性表达、诱导性表达、阻遏性表达、协调性表达、管家基因、启动子、增强子、沉默子、操纵子、顺式作用元件、顺式作用蛋白、反式作用因子、值矛盾、反义RNA、基因诊断、单基因病、多基因病、获得性基因病、疾病的表型诊断 （二） 简答或论述1.举例说明基因表达调控的生物学意义2.怎么理解基因表达调控的复杂性 3.简要说明基因转录起始调控的基本要素 4.原核基因转录调控有何特点 5.试解释乳糖操纵子的负性调节和正性调节6.简述真核生物基因组的结构特点 7.简述基因诊断的特点8.简述基因诊断的应用9.简述基因诊断的原则三、分子生物学“基因诊断及基因治疗”试题（一）名词解释：1、基因诊断：指应用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测人体基因结构、表达水平及其产物是否正常，从而对疾病做出诊断的方法称为基因诊断（gene diagnosis）。2、自杀基因：又称为前体药物酶转化基因，这种基因导入受体细胞后可产生一种酶，将原来无细胞毒性或低毒药物前体转化为细胞毒物质，使导入自杀基因的细胞“自杀”。3、SSCP：即单链构象多态性诊断法，用来分析相同长度的单链DNA由于碱基序列的不同，甚至是单个碱基不同，所引起的构象差异。这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失的检测。 4、基因治疗：将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞纠正基因的缺陷或发挥生物学效应，达到治疗疾病目的的生物医学技术。5、基因增补：指不去除异常的基因，仅通过外源基因的非定点导入，使其在靶细胞中能表达正常产物，补偿缺陷基因的功能。（二）简答题： 1基因诊断与传统诊断方法有何区别，其特点是什么?答：传统诊断方法是通过表现型推测基因型，而基因诊断是从基因型诊断推测表现型，即绕过基因产物，通过直接探查基因进行诊断，不受细胞类型和发病年龄的限制，可用于一切遗传病的诊断。 特点：（1）针对性强；（2）特异性高；（3）灵敏度高。（4）早期诊断（5）适应性强。 2基因诊断常用技术有哪些？ 答：（1）核酸分子杂交：限制性内切酶图谱分析；限制性片段长度多态性（RFLP，或DNA多态性连锁分析）；等位基因特异的寡核苷酸（ASO）探针杂交；单链构象多态性（SSCP）；班点杂交；单核苷酸多态性（SNP）分析；原位杂交；southern印迹杂交；菌落杂交等。（任答五种）（2）聚合酶链式反应（PCR）（3）基因测序（4）基因芯片 3简述常见基因载体的优缺点。类型载体名称优点缺点病毒介导反转录病毒载体病毒滴度相对较高；稳定表达; 易操作只能感染分裂期细胞；随机整合可导致靶细胞基因突变；腺病毒载体滴度高，易制备，安全性髙免疫原性强，易诱发免疫反应，表达短暂，基因组结构复杂腺病毒相关病毒载体感染谱广，定点整合，毒性小外源基因容量较小，随机整合有产生插入突变可能非病毒介导单纯疱疹病毒具有神经组织特异性，外源基因容量较大基因组结构复杂，难制备，细胞毒性，不能稳定表达慢病毒载体（HIV等）感染效率高，可稳定表达随机整合易导致基因突变，通过同源重组有可能产生有复制能力的病毒裸DNA易制备，无病毒序列瞬间表达，效率差异大脂质体和脂质复合物易制备，DNA大小无限制转导效率低，表达短暂阳离子多聚物易制备，无细胞毒性转染效率低，有效表达时间短分子偶联体特异组织靶向性表达水平较低 4. 基因治疗的方法及策略是什么？答：（1）基因置换；（2）基因添加（或基因增补）；（3）基因干预 （或基因失活）；（4）活化前体药物基因治疗或“自杀基因”治疗；（5） 免疫基因治疗；（6）耐药基因治疗；（7）抗血管基因治疗。或者答：（1）基因置换；（2）基因增补；（3）基因失活；（4）基因矫正；（5）活化前体药物基因治疗或“自杀基因”治疗；（6） 免疫基因治疗。四、常用分子生物学技术原理及其应用习题（一）名词解释：核酸分子杂交 PCR RT-PCR 核转移技术 基因芯片（二）问答：1. Southern 印迹杂交的定义及基本步骤，除Southern 印迹杂交技术外还有那些印迹杂交技术？2. PCR技术的基本步骤和主要特点，常用的比较重要的PCR技术有哪些，他们各有什么特点？五、因组和蛋白质组学1、基本概念1) 基因组：从GENes和chromosOMEs组成的。泛指一个细胞或一个生物体的全部遗传信息。在真核生物，基因组是指一套（单倍体）染色体DNA。2) 人类基因组：是指人的24条染色体(22条常染色体2条性染色体)内的全部DNA和线粒体DNA，其中蕴藏的信息决定了人类个体发育、生殖、生长、疾病、衰老、死亡等所有生命现象。3) 基因组学：以分子生物学技术、计算机技术和信息网络技术为研究手段，以生物体内全部基因为研究对象，在全基因背景下和整体水平上探索生命活动的内在规律及其内外环境影响机制的科学。4) 遗传图谱：指基因或DNA标志在染色体上的相对位置与遗传距离（单位为厘摩）。它以具有多态性的遗传标记为“路标”，以重组频率为图距的基因组图。5) 物理图谱：指DNA序列上各遗传标志间的实际距离，是把遗传图谱中克隆群上的DNA片段按实际的物理位置进行排序所构建的图谱。距离单位为bp/kb/Mb。 6) 蛋白质组：源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合。一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质。7) 蛋白质组学：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，是从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动的角度研究在不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体的组成、结构及其活动规律来揭示和阐明生命活动基本规律的学科。8) 激光捕获显微切割原理：在显微镜下选择感兴趣的细胞，用乙烯醋酸盐聚合体膜覆盖在被选择的细胞上 ，激光源发射一束激光被覆盖的透明乙烯乙酸酯膜吸收，瞬间升温使膜局部熔化，并在激光脉冲结束后瞬间冷却，当膜被提起时，仅目标细胞留在膜上，这些细胞直接在膜上进行裂解。9) 双向高效凝胶电泳：第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开的技术10) 质谱技术：用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片）按它们的质荷比（m/z）分离后进行检测的方法。2、基因病及其分类以基因组学为基础，从疾病和健康的角度考虑，人类疾病大多直接或间接地与基因相关，故有“基因病”概念产生。根据“基因病”这一概念，人类疾病大致分为三类：一，单基因病是指某种疾病的发生主要由一对等位基因的一个或两个基因位点存在缺陷而引起，其遗传方式遵循孟德尔遗传规律。 二，多基因病，这类疾病发病的基因机制理十分复杂，涉及一个以上的等位基因以及基因与环境因素的相互作用，又称为多因子疾病。三，获得性基因病：这类疾病由病原微生物感染引起，不符合孟德尔遗传规律。3、比较基因组学研究内容及其意义比较基因组学是比较不同物种的整个基因组，并研究每个基因组的功能和进化关系的学科。比较基因组学的基础是相关生物基因组的相似性，所有当代基因组都是从一个共同祖先基因计划而来，为通过研究非人类生命个体中基因的功能来确定人类基因的功能提供有价值的手段。4、蛋白质相互作用的研究技术：1）蛋白质亲和层析：将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来2）免疫共沉淀：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础，当用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术3） 蛋白质印迹：将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离, 然后取固定化基质膜与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场力或其它外力作用下, 使凝胶中的单一抗原组份转移到印迹纸上, 并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等，对抗原固定化基质膜进行检测和分析。4） 酵母双杂交技术：将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子(如GAL4