工业用溶菌酶行业标准简要编制说明.doc

工业用溶菌酶行业标准简要编制说明1、 工作简况（一）任务来源、起草单位、起草人本标准由中国食品发酵工业研究院组织上报，被列入工业和信息化部2012年行业标准制修订计划，计划名称为工业用溶菌酶，项目编号2012-1187T-QB。本标准由中国轻工业联合会提出，全国食品标准化中心归口。本标准主要起草单位略。本标准主要起草人略。负责标准技术资料查询、收集及对比，检测方法的验证比对，样品检测及数据整理，标准文本及编制说明的起草、撰写，行业内征求意见，组织标准的初审讨论会及标准报送等。（二）简要起草过程标准任务下达后，中国食品发酵工业研究院针对制定工业用溶菌酶行业标准的具体工作进行了认真研究，确定了总体工作方案，于2012年12月组建了标准起草工作组。起草工作组首先查阅相关的国内外技术标准资料，在参照国际和国外先进标准的基础上，结合目前国内市场产品的实际情况，初步确定了产品的质量技术指标和相应的试验方法，形成了标准草案（第一稿）。2013年5月，工作组在北京召开第一次讨论会对标准草案进行讨论研究，综合各方意见，对一些尚存在异议的内容进行进一步整理，修改成标准草案（第二稿），同时确定了进一步的对比验证工作，2013年6月2014年4月，起草组完成样品的搜集，测定底物、标准品的购置、转化及试验方法的验证调整工作。2014年5月，工作组在北京召开第二次讨论会，经过大家的认真、细致的讨论研究，对标准中涉及的主要关键问题达成共识，会后又经多次沟通研究，并于2015年11月修改形成征求意见稿，向行业内公开征集意见。2、 对主要条款的说明（一） 主要内容据起草工作组调研和查阅，目前FCC Lysozyme（溶菌酶）和JECFA（1992）Lysozyme Hydrochloride（盐酸盐溶菌酶）、日本食品添加剂公定书第八版-Lysozyme Japans specification & standard for food additives（食品添加剂溶菌酶标准规范）及原卫生部2010-23号公告均已公布了溶菌酶的质量规格要求。JECFA的质量规格特指盐酸盐溶菌酶；FCC只限定蛋清来源，给出酶活力测定方法，不限工艺，也没有给出特定质量规格；日本公定书针对溶菌酶产品，工艺上涵盖原卫生部公告的溶菌酶产品，因此，本标准制定综合考虑上述质量标准给出本标准技术要求。对比情况见附表1、附表2。本标准的主要技术内容说明如下：本标准编写符合GB/T 1.1-2009的规定。1. 酶活力酶活力对于酶制剂产品即是性能指标也相当于鉴别指标。FCC根据酶活力定义，直接测定计算溶菌酶活力，对活力大小没有给出限值；JECFA针对盐酸盐工艺的溶菌酶，以纯度指标表达相对酶活，并规定纯度指标95%，原卫生部2010-23号公告两个指标全部规定，但酶活力指标的规定单位为企业申报的方法及单位。本标准认为活力指标与纯度指标没有必要同时设定，FCC酶活力测定方法快速、简单，不依赖于标准酶的使用，因而酶活力采纳FCC的定义及计算，试剂的使用及溶液的配制，考虑操作的方便，给出细微调整。一个溶菌酶活力单位定义为25，pH6.2条件下，使用溶壁微球菌悬浊液在450nm处每分钟引起吸光度变化为0.001的溶菌酶的量。直接采纳FCC的活力单位定义。2. 水分原卫生部2010-23号公告，JECFA及日本公定书对溶菌酶的水分要求均限定在6%（固体），本标准与之保持一致。检测方法采用国标GB 5009.3食品安全国家标准 食品中水分的测定。3. 灰分与原卫生部公告一致固体1.5%，液体0.3%。检测方法采用国标GB 5009.4食品安全国家标准 食品中灰分的测定。4. pH原卫生部公告值固体产品3.03.6，液体产品3.04.0；JECFA3.03.6；日本规定5.0。由于该指标与工艺有关，且溶菌酶在酸性条件下化学性质、热稳定性均较好，且该指标与安全性无直接关系，因此本标准综合考虑pH规定在3.07.0的范围内。固体产品1.5%水溶液测定pH。5. 抑菌作用在目前市场上溶菌酶有微生物发酵、蛋清提取等不同来源，来源不同抑菌作用也差别很大。为了确保溶菌酶的质量，在溶菌酶行业标准中，增加定性抑菌试验检测。抑菌环直径6 mm，判为有抑菌作用；抑菌环直径6 mm，判为无抑菌作用。2次重复试验均有抑菌作用，判为合格。6. 食品安全要求应符合国家相关规定。7. 酶活力的测定标准草稿中酶活测定方法等同转化FCC的方法，但实验室在验证时发现直接按FCC方法，无法获得酶活测定结果，测定底物浓度与仪器初始浓度存在不匹配的问题，且实验过程中必须规定相关细节才能保证实验结果的准确、一致性。因此，本标准中的酶活测定方法参照FCC的测定方法做适当调整，具体调整如下：测定用底物：为了保证酶活测定的准确性及一致性，必须指定测定用底物，其中JECFA指定使用ATCC4689溶壁微球菌，底物配制时按干菌粉给出配制方法及初始底物溶液吸光值；FCC直接指定Sigma M-3700，或同等分析效果的产品。作为一般企业或质检机构ACTT4689菌种购进手续繁琐，且存在被告知为国内限制购入产品而无法购得的可能。Sigma M-3700为ACTT4689的活菌制品，价格昂贵，且为一次性使用产品，对于企业连续测定成本较高。为了便于标准发布后测定方法的有效执行，起草组委托食发院菌种中心引进ACTT4689菌种，并接种培养配制成不同浓度，配合起草组各实验室进行FCC方法的有效转化。起草过程中有关单位提出，菌种的接种培养及稀释度的控制专业性较强，如果直接要求菌种中心提供合适浓度的菌悬液，又存在运输困难且由于运输、储存条件的变化造成菌液不稳定的情况。因此，本标准制定也考虑自制标准测定用菌粉的可能。经实验比对，文本给出ACTT4689编号及对应CICC菌种编号，同时考虑给出CICC菌粉编号。日本也是制定本国菌种编号及标准酶编号。底物溶液：FCC以空气调分光光度计零点，底物溶液的吸光度，450nm下读数应为1.70.1，或吸光度降低的速度应在0.030.06单位/min；本标准以磷酸盐缓冲液调分光光度计零点，然后测定底物溶液的吸光度，450nm下读数应为0.700.1。酶活力测定步骤：增加“3min之内初始吸光度值变化应小于等于0.003时，方可开始测定”，确保底物溶液的稳定且没有受到溶菌酶的污染；增加“反应1min后稳定，计算时忽略最初1min的读数”，以保证酶活测定在有效的线性范围内，保证酶活测定的准确性。附表1：国内外溶菌酶质量规格指标对照表项目标准本标准原卫生部2010-23号公告日本公定书第八版（溶菌酶）JECFA 1992（盐酸盐溶菌酶）范围本标准适用于从鸡蛋清中提取、精制等工艺制得的工业用溶菌酶用离子交换树脂从鸡蛋清中提取溶菌酶，然后经洗脱、离心过滤、低压反渗透过滤、巴氏杀菌制得液体型溶菌酶产品；将液体型溶菌酶进行喷雾干燥制得粉末型溶菌酶产品能溶解细菌细胞壁物质的一种酶制剂，来源于蛋清，用碱性水溶液或盐溶液处理后用树脂纯化，或用柱纯化，或树脂纯化后再结晶，或加盐处理从鸡蛋蛋清中提取的，由129个氨基酸组成的多肽，分子量大约为14000，等电点为10.7。具有酶活性，可以水解细菌，尤其是革兰氏阳性细菌的外膜中的连接N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之间的（1-4）键；通常以盐酸盐型的形式获取，用于食品加工。必须符合食品加工处理所用酶制品的通用技术指标性状白色至淡黄色粉末；浅黄色至深褐色液体白色至淡黄色粉末；浅黄色至深褐色液体无味白色粉末白色无味粉末鉴别B：0.01%，pH5.4醋酸盐缓冲液于279nm281nm处有最大吸收A：可溶于水，不溶于有机溶剂和浓盐溶液B：25mg/100mL水溶液，紫外吸光度值252nm281nm含量测定（纯度）95%95%溶液透明度80.0%（5mL，1%溶液，pH3.0，必要时可用稀盐酸调pH）pH3.07.03.03.6；3.0-4.0（液体）5.0（3.0g，200mL水）3.03.6水分，%6（固体）6（固体）6.0（固体）6（固体）总干物质94%；22%（液体）酶活力符合声称3.5107FIP/g；9106FIP/g以干基计酶活性不小于0.9mg/mg灰分，%1.5（固体）0.3（液体）1.5（固体）0.3（液体）1.5抑菌作用合格氮，%16.817.816.817.8氯，%3.24.2；1.0（液体）4.53.24.2钠，%0.60.6附表2：国内外溶菌酶标准试验方法对照表 标准项目本标准FCC日本公定书第八版（溶菌酶）中国药典（CP）水分，%GB 5009.3取样1.0g，硅胶减压2小时减压干燥酶活力修改采用FCC，初始吸光度0.70.1（参照药典）比浊法，以溶壁微球菌培养液为底物，溶菌酶可以溶解溶壁微球菌，使吸光度降低，且其降低程度与溶菌酶的活性成正比。缓冲液pH6.2测定温度（25）底物溶液球菌浓度3040mg/100mL；对照标准溶液和样品溶液浓度1mg/ml；将1cm比色皿放入分光光度计，调整吸光度零点；吸2.9mL底物溶液于比色皿；最初450nm处吸光度应为1.70.1；吸0.1mL标准制备液加入底物溶液，充分混合。记录3min的吸光度的降低，每15s记录一次吸光值，吸光值得变化应呈线性，每分钟的变化范围应在0.030.06。重复操作测定样品溶液.1个溶菌酶活力单位定义为25，pH6.2条件下，使用溶壁微球菌悬浊液在450nm处每分钟引起吸光度变化为0.001的溶菌酶的量。分析1分钟后稳定，计算时忽略最初1分钟的读数。用曲线的线性部分（通常在后2分钟）确定每分钟吸光度变化的平均值。精确称取相当于50mg活力效能的样品（以干基计）用pH6.2磷酸缓冲液配制成一定浓度的样品溶液；用真空干燥器烘干0.1g酶标样2小时，精确称取相当于50mg活力效能的标准参考酶，用pH6.2磷酸缓冲液配制成一定浓度的标准溶液。准确吸取3mL底物溶液至试管35预热3min；底物溶液，样品溶液，标准溶液35预热3min；准确吸取3mL预热过的溶液至试管中35反应10min；640nm测定吸光度，计算酶活力底物悬浮液的制备称取溶酶小球菌3040mg，加磷酸盐缓冲液(pH6.2)0.51ml,在研钵内研磨3分钟，再加磷酸盐缓冲液(pH6.2)适量，使总体积约为100ml，使悬浮液于250.1时，在450nm的波长处测得的吸收度为0.700.05(临用前配制)。测定法精密量取250.1的底物悬浮液3ml，置1cm比色池中，在450nm的波长处测定吸收度，作为零秒