悄无声息的基因治疗手段：可生物降解的纳米微针.docx

悄无声息的基因治疗手段：可生物降解的纳米微针经过刻蚀后的一小块硅片能做什么？大部分人的答案可能都和微电子产品或者光伏材料脱不开关系。绝大多数人可能都不会想过，一块比指甲盖还小的硅片，经过刻蚀后可以做成“注射器”！这种纳米微针注射器相对于传统注射手段而言，不仅无痛无创，而且可以实现更精准高效地定向给药。近年来材料学与生物学领域的许多科学家的都投身到对这种最新的治疗手段的研究中。目前纳米微针注射已经被用于将化疗药物直接递送至癌细胞内，或将事先经过修饰的DNA分子运至特定的组织内实现基因治疗。但如何向特定组织中可控地传输遗传物质目前还是一大难题，之前的研究成果普遍传输效率较低，稳定性差，且一种传输手段不能适用于各种不同部位的组织和细胞，安全性和细胞毒性存疑。目前在体外实验中取得了一定的突破，但是在体内实验中，由于环境复杂，传输效果仍然不理想。2015年5月Nature Materials报道了帝国理工学院M. M. Stevens和E. Tasciotti课题组联合研究的成果：他们成功通过化学刻蚀方法制备了一种多孔的，可生物降解的纳米微针，可以在胞质溶胶中高效协同传输DNA和siRNA，传输效率超过90%。在选取VEGF-165为被传输物质的体内实验中，有效促进了小鼠局部组织区域内血管生成，将特定区域肌肉组织的血流量提升了6倍。众所周知，基因疗法是通过向特定组织或细胞内传输遗传物质，调节特定基因的表达情况来达到对特定组织治疗的目的，甚至可以实现调节特定区域的生理结构、功能，进行对局部组织的基因工程改造。但遗传物质必须传输到胞质溶胶或细胞核区域才能起作用，而核酸本身带较多电荷，很难在血浆中稳定传输。之前的科学家在这方面花费了很多努力，但普遍存在被传输物质稳定性差，无法实现胞内传输等缺陷。纳米微针可以在对细胞结构和代谢影响最小的条件下，对特定区域的细胞内有效传输生物活性物质，非常具有研究价值。纳米微针，即多孔型硅纳米针阵列，通过化学刻蚀法制备。微针形状规整，机械性能稳定，有一定的透膜传输性能，细胞毒性低。通过电镜观察可见：微针尖端直径可调节至50 nm以下，远低于普遍认为的纳米注射器的安全直径。对于5微米长，尖端直径50纳米，底部直径600纳米的微针而言，其表面积比利用传统方法制备的纳米线大300倍。微针的孔隙率，负载容积和机械性能都可以方便地进行调节。力学性能测试表明，这种圆锥样结构的微针坚固耐用，可以承受穿透细胞膜所必须的力。这种结构在模拟体内环境中会逐渐降解（图1）：首先变薄，之后变得更加多孔，15小时即失去原来的形状，72小时后仅能检测到一些固体残留。图1. 纳米微针在细胞培养基37环境下形貌随时间变化情况通过两种方式的细胞实验（nN-B：在纳米微针表面培养细胞；nN-T：将纳米微针压到细胞表面）测试纳米微针对于细胞活动的影响。两种情况下培养5天细胞都保持正常的生理活动，有正常的细胞增殖，未观察到显著的细胞毒性。乳酸脱氢酶LDH分析显示培养基中酶的浓度没有改变，说明纳米注射器不会引起胞内物质泄漏。通过向Hela细胞中运送Cy3-labelled siRNA和GFP-expressing DNA质粒测试纳米微针对于核酸类物质的运载效率，结果证明纳米微针可以同时负载和释放这两种物质至同一区域细胞内，且传输效率可达90%以上。通过针对小鼠皮肤和组织进行荧光染色对比纳米微针和微米微针的传输效果。通过测算染色斑点面积可知，染料通过纳米微针传输效率80%，荧光可持续48小时，水洗不掉。使用纳米微针传输形成的斑点相对于微米注射器更规整，说明纳米微针传输手段更精准使用未负载任何传输物质的的空纳米微针评估其体内安全性。对小鼠皮肤、肌肉和耳组织纳米微针处理后5小时和24小时组织切片观察，组织结构正常，未见急性炎症反应。皮肤组织部分：表皮、真皮、皮脂腺、毛囊结构清晰完整，无炎症反应。表皮、真皮和毛细血管结构未见破坏，角质层结构正常，上皮细胞轻微增生，但角质增厚情况基本可以忽略。肌肉组织纳米微针处理后5小时，5天，15天后观察，肌肉组织的横截面和纵截面两个取向肌纤维细胞的大小和形状都没有发生明显改变，肌肉组织结构也未见明显变化，说明这种纳米微针的生物安全性良好。图2. 对照组、直接注射pVEGF165和纳米微针注射pVEGF165处理后小鼠肌肉组织的明场与共聚焦显微镜照片通过直接注射和纳米微针注射两种方式向小鼠肌肉内注入100 g pVEGF165，对比两种处理方式的效果。VEGF是促进血管生成的关键基因，对新血管的生成起着重要作用。实时PCR显示，两种注射方式处理后的小鼠VEGF165表达情况都有增加，且纳米微针处理的小鼠VEGF165表达情况更高。但只有经纳米微针处理的小鼠在被处理区域的血流量明显增加，且观察到了相互连通的血管网络，持续观察结果表明，纳米微针处理14天后，该组织区域的血流量和血管结点数目提高了6倍（图2）。以上的实验和结果都表明纳米微针是一种安全高效的传输手段。通过这种手段可以在对细胞和组织影响最低的情况下，突破各种生物屏障，将各类遗传物质同时直接传输至胞质溶胶和细胞核区域。纳米微针尺寸远小于之前报道的各类微米微针，针头尺寸的降低，将原来在三维尺度的传输变为二维尺度的传输，可以突破几层细胞，实现对特定组织，特定区域的传输。相对于传统的微米微针而言，纳米微针传输不仅更精准，而且降低了微针尺寸过大引起的炎症反应，局部组织损伤和细胞坏死。这种纳米微针是通过化学