降解石榴单宁为鞣花酸的微生物筛选-大学生研究训练项目申请书.docx

枣 庄 学 院大学生研究训练计划（SRT）项目申 请 书项目名称： 降解石榴单宁为鞣花酸的微生物筛选 项目负责人姓名： 杨露 学号： 201307110151 所学专业： 生物技术 隶属学院： 生命科学学院 指导教师姓名: 张立华 职称 教授 申请日期：2015年 3 月 10日填 报 说 明一、填写申请书前，请先查阅枣庄学院大学生研究训练计划实施办法（枣院政字20139号）关于“SRT”计划项目申请的要求及有关规定。二、申请书的各项内容，要实事求是、逐条认真填写，表达要明确、严谨。正文内容表格空格不够可加页。凡选择性栏目，如“项目类别”、“项目来源”、“经费来源”等，请在相应提示符A、B、C、D之后打勾（）。“项目编号”暂不填，批准立项后由学校统一编号。三、申请书一式三份，一律用A4纸双面打印,左侧装订。校级立项申请书由指导教师和隶属学院签署审查意见后，连同申请书电子版，以学院为单位统一报送实验室管理处。四、本申请书有关的表格及学校文件的电子版，可以到实验室管理处网站（/syglzx/）查阅、下载。申请人承诺我保证本表所填写的内容真实。如果获得立项资助，我与本项目组成员将严格遵守学校的有关规定，服从学校管理，在不影响课程学习的同时，保证项目研究工作的时间，并按计划认真开展研究工作，自觉接受学校对本项目的中期检查和结项考核，按时提交项目中期进度报告书、项目结项报告书和项目成果。项目负责人（签名）： 年 月 日一、简表项目名称降解石榴单宁为鞣花酸的微生物筛选项目类别A、科学实验和科技创新制作类、科研类； B、国家级、省级竞赛（决赛）类；C、社会调查、学术论文类； D、其他类。项目来源A、自立项目； B、导师科研课题的子项目； C、竞赛项目； D、其他。经费来源A、学校资助； B、导师课题资助； C、企业资助； D、自筹经费经费预算 元项目起止年月项目编号项目负责人姓名杨露性别女民族汉出生年月1994年10月学号201307110151所在班级本一隶属学院生命科学所学专业生物技术联系电子邮箱1521929538兴趣爱好运动 读书特长排球 乒乓球学习成绩及所获学分情况综合测评：86所获学分：62.2修读课程有无不及格情况无指导教师姓名张立华性别男学位职称教授近期主要教学工作情况时 间授课名称授课班级学生人数授课学时近期主要科研工作情况时 间项目名称获奖情况项目组成员姓名性别学号所学专业学习成绩项目中的分工本人签名杨露女201307110151生物技术良好野生菌种培养，纯化杨荣爱女201307110152生物技术优秀单宁提取姜胜男女201207110112生物技术优秀筛选二、立项依据（包括项目的研究意义、现状分析，并附主要参考文献及出处）1、研究意义石榴作为枣庄市的特色农产品，栽培面积已达到15万亩，年产量13万吨。石榴皮渣为石榴加工的副产物，多被废弃，或低价销售给一些企业进行简单加工，利用率不高，且价值不高。目前研究表明石榴皮石榴皮含多种活性成分，以鞣质、类黄酮及齐墩果酸为主，其中鞣质含量最高，约10%15%，本项目拟在得到筛选得到可降解石榴皮单宁为鞣花酸的优质菌种，以提高石榴皮资源的利用率和利用价值。2、现状分析石榴的综合利用研究，是目前国外学者研究的一个热点。石榴皮含多种活性成分，以鞣质、类黄酮、有机酸和生物碱为主，其中鞣质含量最高，约10.4%21.5%（滕碧蔚，2013）。石榴皮中提取的鞣质成分可用于鞣制皮革，但产品的附加值相对较低。而鞣花酸(ellagic acid, EA)具有较强的抗脂质过氧化，捕捉自由基的能力，可以抑制多环芳香烃、黄曲霉素和芳香胺等引起的癌变，抵抗肺癌、食管癌，如对小鼠乳腺癌和肝癌细胞具有明显的抑制作用。鞣花酸与金属的络合具有止血的作用，临床上可用来分离血浆。此外，鞣花酸还具有镇定剂的功能（李庆 等，2001；杨洪亮 等，2010）；鞣花酸可作为医药、保健品的原料（王静 ，2002），以石榴皮为原料制取鞣花酸可以大大提高产品的附加值。石榴皮中鞣花酸多以聚合态鞣花单宁的形式存在，要获取其中的鞣花酸，目前的方法是介绍化学制取鞣花酸的方法：虽然化学降解具有降解速率快的优点，但降解程度不易控制，副产物多，产物的精细化利用受到限制。相反，生物降解具有条件温和及特异性强等特点，具有化学降解无可比拟的优势，可以获取理想的单宁降解产物，具有巨大的潜在价值（李明姝，2004；黄文 等，2002）。参考文献：1滕碧蔚.石榴皮的研究与应用进展J.大众科技,2013,26(10):59-60.2李庆,姚开,谭敏.新型天然抗氧化剂-鞣花酸J四川食品与酵.2001,37(4):10-14.3杨洪亮,王晓芳,于泳,等.鞣花酸对肿瘤细胞增殖抑制和诱导凋亡作用的初步研究N.赤峰学院学报.2010,26(10):49-51.4 王静,周晞,王姝,等.由五倍子制取鞣花酸N.青岛化工学院报,2002,23(3):8-11.5李明姝.微生物降解塔拉单宁为棓酸的研究D.四川大学,2004,4.30.6黄文,石碧,李庆,等.利用多菌种共培养降解橡椀单宁制备鞣花酸J.林产化学与工业,2002,01:21-24.三、项目实施方案及实施计划（项目实施方案、研究办法、具体实施计划及可行性分析）1、实施方案 （1）研究目标本项目旨在筛选出23种可降解石榴单宁为鞣花酸的微生物，提高石榴皮的利用率和经济效益。（2）研究内容石榴粗皮单宁的提取及含量测定酸提取有机溶剂萃取法可见光分光广度计测定野生菌种的培养、纯化野生菌种的获得：将自然环境中的石榴皮在恒温箱中培养得到野生菌种。将得到的野生菌种多次划线培养直到得到纯菌种。菌种筛选 将得到的微生物首先接种在含有溴酚蓝的1%的石榴单宁的培养基上进行菌种初筛，筛选的到的菌种接种在不同浓度的石榴单宁浸提物培养基中筛选，根据测量培养基中COD和鞣花酸变化的变化为指标筛选出对石榴单宁耐受和鞣花酸产率较高的菌种。2、研究办法（1)石榴皮的准备取干燥的石榴果皮，使用小型粉碎机粉碎，备用。（2)粗单宁的提取及含量测定酸提取有机溶剂萃取法a 称取50g石榴皮，倒入1000ml锥形瓶中。b 再向烧瓶中加入100mL盐酸（2mol/L）溶液。c 在沸水浴锅中水解1h。d 冷却至室温，加入100ml氢氧化钠（2mol/L）溶液，静置15min。e 加入400ml丙酮提取24h，用布氏漏斗过滤，滤液60减压蒸馏，干燥，得到粗单宁固体。操作中丙酮可回收。分光光度计测定单宁含量a标准曲线将0.11g一水合没食子酸加水溶解并定容到100ml容量瓶，分别精确吸取此溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml于100ml容量瓶中定容，此时溶液浓度分别为0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0mg/L。分别吸取上述没食子酸溶液1.0ml与10ml具塞试管中，以蒸馏水为空白对照，然后依次加入适量FC试剂，碳酸钠溶液，定容至10ml，避光静置30min，与760nm处测定样品吸光值，重复两次，取平均值绘制标准曲线图。b含量测定将提取液用蒸馏水定容，按照标准曲线制作步骤显色后在760nm处测定吸光度，再按照标准曲线方程计算溶液中单宁类物质的含量。(3）菌种筛选野生菌种的获得和纯化将石榴皮接种在培养皿中，加适量自来水，也可在空气中暴露一段时间获得较为丰富的细菌，32恒温箱培养一周；也可将石榴皮放置在光照、温度、湿度适宜的自然环境中，使其自然长菌。挑去石榴皮表面的微生物，分别接种于马铃薯培养基、麦芽汁琼脂培养基，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，于恒温箱中培养72h，反复进行上述划线分离操作，直至得到纯菌种。筛选将分离得到的纯菌种分别接种在含溴酚蓝1.0%没食子酸培养基中，培养4d，观察培养基周围菌落变化情况和变色圈的大小。将初筛得到的菌种分别接种于含有1.0%的石榴单宁的液体培养基中培养6d，以相同条件下的液体发酵液为空白对照，测定溶液中的COD变化，以COD的去除率为衡量单宁降解率的指标，对菌种进行筛选，选取COD去除率高的菌株。将上述得到的菌株接种在含有不同浓度的石榴单宁液体培养基中培养，以各菌株COD随单宁浓度变化的变化趋势和鞣花酸的产率为指标，选择对单宁有一定耐受和较高鞣花酸产率的菌种。3、实验结果的分析4、项目研究计划及预期进展利用平时的课余时间进行项目的研究，项目研究计划及预期进展如下：（1） 2015年4月至2015年6月a、查阅资料，确定实验详细计划，购买试剂；b、野生菌种获得、纯化；c、提取石榴单宁测定含量；（2） 2015年6月至2015年8月菌种筛选 （23） 2015年8月至20162015年411月写总结报告，进行项目验收可行性分析：石榴皮单宁中的鞣花酸具有极强的抗氧化作用，具有防癌及抑制病毒的作用，在制药、生化、日化、食品以及精细化工等高科技领域具有广阔的应用前景，市场需求量大。随当前“追求自然”消费观念的兴起，从石榴皮中制取的植物源的鞣花酸倍受消费者的欢迎，也具有广泛的利用价值，市场前景十分广阔。化学降解具有降解速率快的优点，但降解程度不易控制，副产物多，产物的精细化利用受到限制。相反，生物降解具有条件温和及特异性强等特点，具有化学降解无可比拟的优势，可以获取理想的单宁降解产物。四、预期成果1、预期研究成果1）、筛选23种可降解石榴单宁为鞣花酸的微生物2）、争取在核心期刊上发表1篇相关的学术论文五、本项目的特点与创新之处（1）、本项目以微生物降解石榴皮单宁为鞣花酸，相对于传统的化学降解，降解过程、降解产物更加易于控制，且绿色无污染。另一方面，降解后的产物鞣花酸使得石榴皮具有更高的使用价值和经济效益。（2）、2、就申请人而言课题涉及的内容多为教材知识的向外延伸，在以往的学习过程中接触并不多，此课题的研究能够使我们接触和掌握更多的新知识，提高实践能力，激发创新意识,为以后的科学研究奠定基础。（3）、3、本项目指导教师张立华教授近年来一直从事与本项目内容有关基础研究，曾在国内许多核心刊物上发表过多篇研究论文，如于中国粮油学报，农业工程学报，食品科学报.，园艺学报等刊物上发表。另外，本项目研究组成人员间均有强烈从事科学研究的欲望，学习成绩优秀，学有余力，且相互间有良好的团结合作精神。在指导老师的精心指导下，我小组对完成本项目中的研究内容很有把握，相信一定能取得预期结果。六、研究基础1. 项目负责人与本项目相关的专业知识积累和已取得的成绩；指导教师的教学、科研工作积累和已取得的工作成绩；项目组成员的学习情况等。 在大学将近两年的时间里，我们组员学了有关无机化学、有机化学、生物化学等几门基础课程，以及正在学习的微生物学，都能帮助我们学习掌握了各种物质提取和微生物培养的要点、多种实验仪器的操作与相关问题的分析解决。另外本项目指导教师已对石榴加工等进行了深入地研究。至今在与本项目有关研究领域发表了近10篇高质量的论文，从而为本项目中的顺利进行坚实的基础。 2. 已具备的条件、尚缺少的条件和拟解决的途径（包括利用教学实验室、科研实验室和实习实训基地等实施计划及落实措施等）本实验室已有高速粉碎机，精密电子天平，旋转蒸发仪，紫外可见分光光度计等仪器，