生物工程 毕业设计.doc

摘 要毕业论文作 者： 学 号： 院 系： 专 业： 生物工程 题 目：不同溶菌酶的提取、分离方法的比较及酶活力测定方法之探讨 指导者: 评阅者： 2014 年 6 月 要摘 要废弃蛋壳对于人类来说等于是一个还未开发的宝藏，它潜在的价值难以估计。本实验以前人的研究为基础，对溶菌酶的提取方法进行了改进。采用聚丙烯酸沉淀法从废弃的新鲜蛋壳中提取溶菌酶，经抽提、除杂蛋白、吸附、解离、盐析等一系列步骤成功地从废弃蛋壳中提取出了一定量的溶菌酶。讨论了pH值、温度、NaCl溶液浓度等因索对抽提盐析及溶菌酶酶活力的影响，确定了最佳的抽提条件：最佳抽提pH为4.5，最佳抽提温度为40，最佳抽提剂NaCl质量分数为2.0，最佳盐析pH为11；实验采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的方法对溶菌酶进行鉴定，研究了溶菌酶对枯燥芽孢杆菌的抑制作用，并用分光光度计测定了溶菌酶的的酶活力。实验结果表明：从1000g废弃的新鲜蛋壳中可以提取出0.801g左右的溶菌酶，溶菌酶对枯草芽孢杆菌的生长具有抑制作用，在最佳的抽提条件下提取的溶菌酶酶活力最高，为15220Umg。关键词：蛋壳；溶菌酶；聚丙烯酸；酶活力IAbstractAbandoned eggshell is an untapped treasure for human，its potential value is difficult to estimate.So this experiment based on the previous research，In the use of raw materials and Waste recycling point of view to improve the method of the extraction of lysozyme. the polyacrylic acid precipitation method of extracting lysozyme from eggshell was studied. The extraction, removing impurity protein, dissociation, salting out a series of steps successfully from the eggshell extract the trace of lysozyme and protein identification, and influences of pH value, temperature, concentration of NaCl solution on the extraction in the process of test, determine the optimum extraction conditions :the best extraction pH 4.5,the best extraction temperature is 40, the mass fraction of NaCl optimal extraction agent for 2.0%,the optimum salting out pH 11,The experimentadopts themethod of polyacrylamide gel electrophoresis separation of proteins to identificate oflysozyme,tthedetermination of enzyme activityof lysozymeby spectrophotometry,studyon theinhibitory effect oflysozyme onboringbacillus,and compared to the enzyme activity at different extraction conditions.The experimental results show that:in the 1000gwasteof fresheggscan extract0.801g,lysozyme,lysozymecan inhibit the growth ofBacillus subtilis,and lysozyme activity was highest in the optimal extraction conditions of extraction, is 15220U / mg.Key words ：Eggshell;lysozyme;polyacrylic acid;enzyme activityI东北电力大学学士学位论文目 录摘 要IAbstractII目 录IV第1章 绪 论11.1 溶菌酶的性质及作用11.2 国内外研究现状和发展趋势21.3 溶菌酶分离纯化的方法31.3.1 结晶法41.3.2 色谱法41.3.3 亲和分离法51.3.4 反胶团萃取法51.3.5 双水相萃取法61.3.6 超滤法61.4 课题研究目的和意义61.5 本课题主要研究内容7第2章 溶菌酶的提取、鉴定和酶活力的测定82.1 实验材料和药品82.2 试验仪器92.3 工艺流程102.4 实验过程102.4.1 溶菌酶的提取102.4.2 盐折112.4.3 溶菌酶的的鉴定112.4.4 溶菌酶酶性的测定13第3章 结果与讨论153.1 pH值的影响153.1.1 pH值对抽提的影响153.1.2 pH值对酶活的影响163.2 温度的影响163.2.1温度对抽提的影响163.2.2温度对酶活的影响173.3 NaCl浓度的影响183.3.1不同的NaCl浓度对抽提的影响183.3.2 不同的NaCl浓度对酶活的影响193.4 盐析时pH值对溶菌酶活性的影响193.5 溶菌酶酶活性203.5.1 溶菌酶抑菌效果203.5.2 溶菌酶活力测定20结 论22参考文献23致 谢2521第1章 绪 论第1章 绪 论在自然界中，溶菌酶广泛地存在于动植物体内和人的外分泌液中。目前可以从牛、羊马等乳汁中分离出溶菌酶，从番木瓜、大麦、无花果、卷心菜等植物中也可分离出溶菌酶。鸡蛋清中的溶菌酶是目前从动植物中分离最多的溶菌酶之一。1.1 溶菌酶的性质及作用溶菌酶( Lysozyme) 又称胞壁质酶或N一乙酰胞壁质聚糖水解酶，是由129个氨基酸构成的碱性蛋白, 化学性质非常稳定，通常情况下为白色或微白色的无定性粉末或晶体性、味甜、无臭、无毒性，对革兰氏阳性菌中的耐辐射微球菌有强力分解作用。 蛋清中的溶菌酶是等电点在pH值9.510.0的强碱性蛋白质，分子量约14000道尔顿。溶菌酶系专一催化革兰氏阳性细菌和放线菌细胞壁粘肽部分-1.4糖苷键的水解，是一种专门用于微生物细胞壁的水解酶。（1）在医学上，它是一种高效抑菌、杀菌、抗病毒蛋白质，它能够分解杀灭诸如葡萄球菌属、链球菌属等革兰氏阳性菌，用于抗菌、抗病毒、止血、消炎等。它能水解细菌坚韧的细胞壁，使菌体失去保护的屏障而死亡，因而具有溶化细菌的作用，所以它的主要功用是水解细菌细胞壁，在细胞内，则对吞噬后的病原菌起破坏作用。所以它具有抗炎功效，并以保护机体不受感染，它能分解稠厚的粘蛋白使其变稀薄，使脓性创口渗出物液化而易于排出；能清除坏死粘膜，加速粘膜组织的修复和再生；和抗生索具有很好的协同增效作用用溶菌酶制成的漱口液还可预防龋齿1。它与抑菌剂并用可大大提高抗菌力，如溶菌酶中添加甘油、癸酸脂、六偏磷酸钠调和的静菌剂对大扬杆菌和芽孢菌的溶菌效果特优。氯化溶菌酶医疗效果更广，有浓疲分散、出血抑制、组织修复、消炎镇痛、抗过滤性病毒等作用，因而用氯化溶菌酶的制药有消炎消痔、治感冒、皮肤病及眼、鼻、喉等用药。口腔中主要的龋齿病原菌是突变链球菌，溶菌酶可有效抑制突变链球菌的生长繁殖，防止龋齿的发生。目前日本已有含溶菌酶的牙膏生产2。（2）在食品工业中，若将溶菌酶加在鲜牛奶或奶粉中，可增强婴儿的免疫力；溶菌酶具有杀菌防腐作用，作为一种无毒无害蛋白质，还是一种安全性很髙的杀菌剂，应用于食品工业中作为防腐剂延长商品的货架期。溶菌酶作为防腐剂有以下优点：(a)溶菌酶是很稳定的蛋白质，有较强的抗热性。蛋淸溶菌酶是C型，是己知的最耐热的酶； (b)溶菌酶不会因为有机溶剂的处理而失活，当转移到水溶液中时，溶菌酶的活力可全部恢复；(c)溶菌酶可被冷冻或干燥处理，且活力稳定；(d)溶菌酶适宜pH4.45.3，可用于低酸性食品防腐；(e)溶菌酶生产成本较低；(f)溶菌酶的抗菌谱较广，不仅局限于G+菌，对部分G-菌也有抑制效果；(g)溶菌酶作为防腐剂安全性高。溶菌酶是一种天然蛋白质，1992年FAOWTO的食品添加剂协会已经认定溶菌酶在食品中应用是安全的3。 溶菌酶作为防腐剂应用在食品中的研究日本较多，且有许多专利。新鲜蔬菜、水果、鱼肉等均可用涂溶菌酶溶液来防腐。溶菌酶与食盐水溶液处理蚝、虾和其它海洋食品，在冷藏条件下贮藏，可起到防腐作用。鱼糕、糕点、酒类、新鲜水产品等也可用溶菌酶来防腐。（3）在基因工程和细胞工程中，溶菌酶是一种必不可少的工具酶。一般应用溶菌酶进行菌体或细胞破壁提取细胞内容物（如原生质体等）应用于融合育种，或生产蛋白质、核酸 类呈味物质。溶菌酶也是生物工程中重要的研究对象，随着生物技术的发展，对溶菌酶的研究也更精细，更深入，提取溶菌酶也具有更重要的战略意义4。（4）在发酵工业中，该酶作为一种重要的溶菌剂可用于无菌体提取液的制取等。（5）环境工程中也用溶菌酶处理污水、污泥，即处理含有生物难降解物质的废水，它能加快污泥脱水速率，泥饼含水率下降，提高污泥消化率。利用海工程在环境工程中是一个很有前途的发展方向，溶菌酶以其特有的性质在环境工程中的应用更具潜力。基于溶菌酶的广泛用途及在蛋制品加工中发拝资源优势，综合利用原材料，增加产值利润。1.2 国内外研究现状和发展趋势最早有关溶菌酶的报道的是1907年NicoHe首次发表桔草芽胞杆菌(Bacillussubtitis)溶解因子存在；1909年拉希琴科指出，鸡蛋清具有强抑菌作用。1922年弗莱明发现人的鼻涕、唾液、眼泪也有强的抑菌作用，并将溶菌的因子命名为溶菌酶；同年他又报道了从鸡蛋清中提取溶菌酶的方法，从此开始了对溶菌酶这种具有杀菌作用的天然抗感染物质的研究。1927年，英国菲利普集团发表了对鸡蛋清溶菌酶一作用底物复合体第一射线衍射的研究5。1936年，麦耶(Meyer) 等人验证了溶菌酶的溶菌现象；1951年证明溶菌酶是细菌细胞壁溶解酶；19591963年索尔顿（Satton)等人又通过实验证明溶菌酶是一种能切断N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺间P-K 4苷键的酶。1967年，英国菲利普集团首先发表了关于对鸡卵白溶菌酶作用底物复合体X射线衍射，具体地介绍了其结构，这项研究成果在近代酶化学史上有着举足轻重的地位。随着溶菌酶的发现，科学工作者对溶菌酶进行了大量的研究。麦耶等人于1936年最先发表了溶菌酶精制的报告，竖年，亚伯拉罕等人用大致相 同的方法获得了溶菌酶结晶标准品。1945年，奥尔德顿等人用彭润土岩吸附，再用吡啶溶出从鸡蛋清中得到了收率较髙、结晶好的溶菌酶，第二年他们开发出直接结晶法，即在含5%NaCl、pH10左右蛋白中加入溶菌酶晶体作为晶种，低温下获得了溶菌酶结晶品。自20世纪50年代以后，随着实验工具的飞速发展， 对鸡蛋清溶菌酶和许多动物溶菌酶的研究也更加确切，例如对溶菌酶的结构、氨基酸排列等有了更淸楚的了解。Alderton (1945)及Cardon (1945)采用彭润土吸附溶菌酶，再用5%吡啶溶出得到溶菌酶。Li-Chan (1986)用阳离子交换柱色谱分离蛋淸中溶菌酶，他用Duolite-C464 (一种弱酸性阳离子交换树脂）吸附溶菌酶，再用一定浓度和pH的氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液将溶菌酶洗脱下来，得到活力较高的溶菌酶，收率高达90%95%。Durance (1988) 利用两步法即离子交换-等电点沉淀同步分离蛋清中溶菌酶和抗生物素蛋白，得到高纯度、髙活力的溶菌酶和抗生物素蛋白。Chiang (1993)结合超滤和亲和色谱分离纯化蛋淸溶菌酶，二次超滤浓缩后再用几丁质纯化，得到髙活力溶菌酶，酶收率高达80%，但是成本较高。赵哲勋（1993)利用D201大孔离子交换树脂从鸡蛋壳膜中提取溶菌酶，他釆用静态吸附，再经洗脱、盐析、透析纯化得到了活力较髙的成品，活力13000。也可采用大孔苯乙烯系强碱阴离子吸附型交换树脂从蛋淸中提取溶菌酶（成均匀，1991）。施德恒（1992)采用阳离子交换树脂CM-Sephadex抽提鸡蛋壳膜中溶菌酶。蒋冶良（1997)利用超滤技术制备溶菌酶，冷冻干燥得到的溶菌酶质量达到药用标准（活力4000U/mg)。Ching-chuan yang (1998)利用阴离子多糖分离溶菌酶。Shu-ting chon (1998)用反胶束萃取鸡蛋淸溶菌酶，收率90%，比活高达 73000U/mg，是目前有报道的资料中溶菌酶活力最高的一种方法，但此种方法是否能达到所报道的酶活力，尚待测定。Hung-Min chang (2000)采用还原剂（抗坏血酸）与热处理结合提取鸡蛋和鸭蛋淸溶菌酶，最大收率为78%。在这些方法中树脂吸附法相对成本较低，较经济，溶菌酶活力及收率均较高，可成功应用于工业化生产，提取溶菌酶的工艺简单，投资少，但技术要求较严格，目前缺乏对其工业化步骤的深入研究。目前，世界上只有美国、加拿大、日本等少数发达国家进行了工业化大规模生产，我国起步较晚，且存在提取率低、处理量小和产品比活低等缺点6。1.3 溶菌酶分离纯化的方法鉴于溶菌酶特殊的理化性质及其在食品中的广泛应用，它的分离纯化研究也一直受到追捧，已经开发并建立起多种方法，总体说来主要概括有结晶法、色谱法、亲和分离法、反胶团萃取法、双水相萃取法及超滤法等7。1.3.1 结晶法结晶法是一种传统的制备溶菌酶晶体的方法，由于溶菌酶具有耐热和耐酸，以及在盐溶液中稳定好，溶解性强的特点，结晶过程可以通过改变溶液的条件，来使溶菌酶在溶液中以晶体态析出。向溶菌酶含量最多的蛋清中加入一定量的中性盐，如NaC1、（NH）4SO2等，然后用氢氧化钠调节溶液pH至溶菌酶的等电点区(10.711.3)，再加入溶菌酶晶体，在低温下静置23周时间，溶菌酶晶体即可析出，而其他蛋清中大部分蛋白质仍在溶液中。可根据要求纯度的不同，将析出的溶菌酶晶体过滤，然后再溶解，通过同样的方法重结晶，以达到更高的纯度。结晶法是目前提取分离蛋清中溶菌酶的首选方法，它要求溶菌酶的含量相对高点，因此不适宜分离微量的溶菌酶，故除了蛋清，其他来源的溶菌酶生产一般不用结晶法。但是蛋白质的结晶是一个十分复杂的物理化学过程，晶体的形成，一方面受到自身分子的结构影响，另一方面受到结晶条件的影响，导致的结果是结晶过程的细微差别，将得到不同产量和质量，甚至不同形态的晶体。因此单纯的结晶法分离纯化溶菌酶，存在着许多不稳定的因素。而膜结晶作为一种新的结晶方法受到越来越多的注意和重视。与常规的结晶方法相比，膜结晶具有结晶过程可控、结晶诱导时间短，蛋白质初始浓度低等优点。其基本原理是通过膜蒸馏来脱除溶液中的溶剂，浓缩溶液，使溶液达到过饱和并通过膜表面的诱导作用而形成晶体8。1.3.2 色谱法(1)离子交换色谱法离子交换色谱法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质和结合力的差异来分离离子型化合物的一种方法。离子交换层析法是制备高纯度的溶菌酶时，最常用的方法。由于溶菌酶是一种碱性蛋白质，最适宜的酸度为pH 6.5，因此制备溶菌酶时，一般选用弱酸性阳离子交换树脂。目前国内外在分离溶菌酶时最常用的树脂有724、732弱酸性阳离子交换树脂，201大孔离子交换树脂，Duolite-464离子交换树脂、醋酸纤维素(PC)、羧甲基纤维素和羧甲基琼脂糖等。(2)亲和色谱法亲和色谱也称为亲和层析，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和层析应用始于20世纪70年代，由于底物可以专一性与溶菌酶结合，进而与其它蛋白分离，是一种高效的分离方法。目前，利用亲和层析法分离溶菌酶的报导有很多。(3)分配色谱法分配色谱法是利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般为液相的溶剂。1.3.3 亲和分离法亲和分离法是一种以亲和力为基础的分离纯化方法，利用物质问的特异性结合力，使得目的物质或者杂质与相应的配基结合，达到相互分离的目的。它包括亲和沉淀法，亲和过滤法，亲和膜分离法，固定金属亲和层析法等各类方法。亲和沉淀法是采用在物理场(pH、离子强度和温度等)改变时发生可逆性沉淀的水溶性聚合物为亲和配基的载体，从而利用目标分子与其亲和配基的特异性结合作用及沉淀分离的原理进行目标大分子的分离纯化，是蛋白质等生物大分子的新型亲和技术之一。由于生物亲和相互作用的选择性高，离心分离法操作简便、易于放大，因此亲和沉淀法不仅具有接近于亲和层析法的纯化效率，而且可弥补亲和层析法放大困难的缺点。此外亲和沉淀操作中目标分子与配基的亲和相互作用在水溶状态下，传质阻力小、吸附速率快、可处理高粘度甚至含微粒的粗原料6。亲和膜色谱技术是兼具膜分离与亲和分离的特点，与传统的膜分离、亲和色谱相比，不仅具有纯化倍数高，压降小，分离时间短，生物大分子在分离过程中变性几率小，允许较快的加料速度等特点，而且比柱亲和色谱更易实现规模化生产。固体亲和层析法是指蛋白质分子能够与金属离子发生亲和反应并与之结合，用于分离纯化蛋白质。用螯合剂将特定的金属离子固定在固体表面会减少蛋白质一金属相互反应的自由度，蛋白质因此不容易失活，可以保持较高的活性。它的优点是可用不同的金属离子固定到螯合载体上，用一种更强的螯合剂将所用的螯合剂洗脱下来从而实现再生。1.3.4 反胶团萃取法当表面活性剂溶于大量与水不相溶的有机溶剂中，达到一定浓度时，会形成极性头在内，非极性头在外的聚集体，这种聚集体为反胶团。当体系中含量一定量的水，则在反胶团中心有一个水池，可以包围水溶性的蛋白质分子。这种反胶团的有机溶剂与蛋白质水溶液混合时，一定条件下，蛋白质分子能够从水相进入到反胶团的中心水池，经过分相后，再将有机相与另一水相接触，改变条件，即可打开胶团，释放蛋白质分子，从而达到萃取分离的目的。1.3.5 双水相萃取法当两种高聚物的的水溶液相互混合时，若两种被混合分子间存在空间排斥作用，使它们之间无法相互渗透，则在达到平衡时就有可能分成两相，形成双水相。两相的组成和密度均不相同，通常密度较小的一相浮于上方，为上相；密度较大的一相沉于下方，为下相。一般认为，只要两种聚合物水溶液的水溶性有所差异，混合时就可以发生相分离，并且差别越大，相分离倾向就越大。聚乙二醇葡聚糖和聚乙二醇无机盐是常用的双水相体系，由于葡聚糖价格昂贵，因此聚乙二醇无机盐体系应用更为广泛。聚乙二醇无机盐中所用的无机盐主要是磷酸盐和硫酸盐。1.3.6 超滤法超滤法是一种新兴的分离纯化物质的技术，它是利用滤膜的孔径大小来筛分不同的物质，达到过滤杂质，使得水以及小分子物质通过，从而获得产物的效果，一般在反渗析和浓缩等方面应用得多，近来也在蛋白质的分离纯化中得到越来越多的应用。与传统的分离技术相比，它的特点是产出量高，活性大，杂质少，纯度也较高。1.4 课题研究目的和意义溶菌酶存在于自然界的动物植物微生物中，除了人体之外，蛋清中的含量最为丰富，蛋壳膜中也有存在。蛋壳重量占整个鸡蛋的11%13%，壳内膜约占蛋壳重量的4%5%，其厚度约为0.06mm。本实验就是从废弃的蛋壳中提取出溶菌酶。蛋类是全人类共同的优质动物性食品，随着禽蛋生产与消费的日益增加，其不可食用部分蛋壳就大量产生，在一个千万人口的城市，如每人每日丢弃一个蛋壳，按通常蛋壳在全蛋重量中的比重计算，一年下来，废弃蛋壳总重将达28.5kt，其量之巨，需5700辆5t大货车才能装运。我国的废弃蛋壳主要来源于大量消费鸡蛋的食品厂、孵化场、酒家等单位，而成批抛弃的蛋壳很快就会腐败变质，造成环境污染，在不遗余力地寻求解决垃圾污染、破坏环境的措施时，垃圾的减量化、资源化则是最具积极意义的，最值得提倡的。在各类动物性食品的废弃物中，其骨、皮、血的资源化程度较高，市场上有多种骨钙补剂、氨基酸、胶原蛋白功能制剂等，但尚未见到蛋壳钙剂、蛋壳蛋白、蛋壳胶原等商品，蛋壳的开发利用明显滞后，这与长期以来蛋壳来源十分分散有直接关系。已有研究表明，蛋壳含有丰富的钙、角蛋白、粘多糖、溶菌酶等成分，又基于蛋壳资源数量巨大，永不衰竭，综合利用深度加工就显得特别必要。现代蛋制品加工业的发展将在很大程度上改变蛋壳来源分散、不易收集、污染严重的现状，因此，对蛋壳资源化研究与开发具有重要的理论与实践意义9。目前虽然对溶菌酶的研究较多，但是缺乏适于工业化生产溶菌提取的可行性工艺及溶菌酶在食品中的研究，对溶菌酶的性质等的报道也说法不一，为了更好的将溶菌酶应用于医药、食品等行业中，有必要对溶菌酶的提取、性质及应用进行系统性的研究本试验即以综合利用蛋壳为目的，研究了适宜工业化生产的溶菌酶提取工艺，该工艺具有工艺过程简单、提取效率髙、酶活力较高、成本低、生产周期短、可连续生产的特点，并对溶菌酶的稳定性、抑菌能力等也进行了研究，为溶菌酶的应用提供可行性依据10。1.5 本课题主要研究内容 本课题以蛋壳综合利用为目的，主要内容包括蛋壳溶菌酶的分离纯化、溶菌酶酶活性质研究。但溶菌酶在鸡蛋壳中含量很低，所以我将采用聚丙烯酸沉淀法从废弃蛋壳中提取溶菌酶进行初步的研究，将经过提、除杂蛋白、吸附、盐析等一系列步骤成功地提取出蛋壳中的微量溶菌酶，讨论不同的条件对抽提的影响；本试验在参考相关文献的基础上，通过优化试验条件，在溶菌酶酶活性质研究过程中，以枯草芽孢杆菌作为研究对象，研究溶菌酶对枯草芽孢杆菌的抑制作用及在不同的抽提条件下提取的溶菌酶的酶活力。第2章 溶菌酶的提取、鉴定和酶活力的测定第2章 溶菌酶的提取、鉴定和酶活力的测定2.1 实验材料和药品实验材料：鸡蛋壳（去校外超市购买）实验药品：表2-1 实验所用药品药品名称纯度/浓度氯化钠99.5%（分析纯）氢氧化钠97.0%无水氯化钙99.5%（分析纯）碳酸钠99.5%（分析纯）聚丙烯酸PAA冰醋酸99%（分析纯）盐酸36%-38%（分析纯）磷酸二氢钾99.5%（分析纯）磷酸85%（分析纯)无水乙醇99%（分析纯）丙烯酰胺95%（分析纯）亚甲基双丙烯酰胺99.0%Tris99.9%（分析纯）DSD10%过硫酸铵98.5%Tris-HCl0.5mol/L甘油95%（分析纯）-巯基乙醇95%（分析纯）溴酚蓝0.1%考马斯亮蓝R25095%（分析纯）甲醇50%附表2-1续表药品名称纯度枯草芽孢杆菌实验室提供磷酸二氢钾99.5%（分析纯）磷酸85%（分析纯)2.2 试验仪器表2-2 实验所用仪器仪器名称型号/规格数显恒温水浴锅HH-1高压灭菌锅YXQ-SG46-280S低速离心机80-2B恒温磁力搅拌器85-2烧杯1000ml，500ml，50ml电子天平FA1004N移液管1mlpH计PHS-3C电泳槽DYY-12电泳仪DYY-12容量瓶25ml，100ml分光光度计722比色管50ml 2.3 工艺流程 滤渣(弃去)蛋壳 杂蛋白(弃去) 滤液 上层清液(弃去) 上层清液 吸附物 滤渣(弃去) 滤液(弃去) 上层清液 结晶物 鉴定 测定酶活力2.4 实验过程2.4.1 溶菌酶的提取蛋壳的预处理：将新鲜蛋壳用自来水进行冲洗，洗去残余的蛋清和蛋壳表面的污垢，然后再用蒸馏水漂洗一遍，漂洗后的蛋壳滤干水分后置于干燥处10h，使蛋壳中的水分蒸发。抽提：称取750g清洗干净的蛋壳用900ml的一定浓度的NaCl溶液泡后，用2molL-1的HCl调pH值，然后每10分钟测一次pH值并且调整，在水浴锅中加热4h，在这过程中不停的搅拌并且调整pH值，始终让溶液中的pH值保持不变，然后用筛子将蛋壳过滤掉11。保持温度为40，氯化钠浓度为2%的条件不变分别调pH为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和pH不控制，进行抽提；然后再保持pH为4.5，氯化钠浓度为2%不变，分别保持温度为25（室温）、30、35、40和45条件进行抽提；最后保持pH4.5，温度40不变，改变氯化钠浓度为0.5%、1%、1.5%和2%、2.5%进行抽提。除杂蛋白：将水浴锅的温度调到80，将烧杯溶液的pH值用1:1的乙酸调至4.5后，迅速放入水浴锅搅拌加热，不停的搅拌，当温度到达77时发现有白色沉淀析出，开始计时，10分钟后取出烧杯静置。3个小时以后，发现溶液基本澄清。继续静置14个小时后，采用常压过滤法过滤。弃掉滤渣。清液留待进行下步实验12。吸附：将过滤后的澄清溶液用20的NaOH溶液调pH至6.0，在调pH值的过程中不停的搅拌，有少量的乳白色沉淀析出，然后加入15的聚丙烯酸，立即有白色沉淀析出加至pH值为3.0为止，静置17个小时进行倾析，得到粘附于底部的乳白色胶状物。解离：将前一步得到的溶菌酶聚丙烯酸凝聚物，加入少量蒸馏水并用0.5 mol/L-l的Na2C03将其溶解，转移后，将pH值调到9.5。加入5CaCl2溶液将溶菌酶聚丙烯酸解离，至无沉淀析出，然后过滤，得到澄清溶液13。2.4.2 盐折将所得澄清溶液加入5的NaCI溶液搅拌均匀，放入冰箱调温度为0。待有晶体析出后。用无水乙醇洗涤数次。至恒温培养箱中40条件下干燥称重。2.4.3 溶菌酶的的鉴定配置鉴定试剂：30%凝胶贮备液：丙烯酰胺 29.2g，亚甲基双丙烯酰胺 0.8g，加蒸馏水至100ml。外包锡纸，4冰箱保存，30天内使用分离胶缓冲液（1.5mol/L）:Tris 18.17g,加蒸馏水溶解，6mol/L，HCl调pH8.8，定容100ml。4冰箱保存浓缩胶缓冲液（0.5mol/L）: Tris 6.06g,加蒸馏水溶解，6mol/L，HCl调pH6.8，定容100ml。4冰箱保存电极缓冲液（pH8.3）：SDS 1g，Tris 3g，Gly 14.4g，加蒸馏水溶解定容到1000ml。4冰箱保存10%SDS，室温保存10%过硫酸铵：10g过硫酸铵，加蒸馏水定容至100ml（新鲜配置）上样缓冲液：0.5mol/L Tris-HCl pH6.8 1.25ml，甘油2ml，10%SDS 2ml，-巯基乙醇 1ml，0.1%溴酚蓝 0.5ml ，加蒸馏水定容至10ml0.25%考马斯亮蓝R-250染色液：0.25g考马斯亮蓝R250，加入91ml50% 甲醇，9ml 冰醋酸脱色液：50ml 甲醇，75ml 冰醋酸与875ml蒸馏水混合未知分子量的蛋白质样品装板：将密封的硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠，将两块玻璃立起来使底端接触桌面，用手将两块玻璃夹住放入电泳槽内，然后插入斜插板到适中程度，即可灌胶。凝胶的聚合：首先制备分离胶，然后将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板的内面缓慢用滴管滴入，小心不要产生气泡。将胶液加到距短玻璃板上沿2cm处为止，约5ml。然后用细滴管或注射器仔细注入少量水，约0.5-1ml。室温放置聚合30-40min。待分离胶聚合后，用滤纸条轻轻吸去分离胶表面的水分，制备浓缩胶，用长滴管小心加到分离胶的上面，插入样品模子；待浓缩胶聚合后，小心把出样品模子14。 蛋白质样品的处理：若标准蛋白质或预分离的蛋白质样品是固体，称取1mg的样品溶解于1ml0.5mol/LpH6.8Tris-盐酸缓冲液中，放置在0.5ml的离心管中，加入15-20L的样品处理液。在100水浴中处理2min，冷却至室温后备用。吸取未知分子量的蛋白质样品20L，按照标准蛋白质的处理方法进行处理。加样：用手夹住两块玻璃板，上提斜插板使其松开，然后取下玻璃胶室去掉密封的硅胶框，注意在上述过程中手始终给玻璃胶室一个夹紧力，在将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽，插入斜板，将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上，外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿3mm处即可，注意避免在电泳槽内出现水泡。加样时用加样器斜靠在提手边缘的凹槽内，以准确定位加样位置14。电泳：加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电流控制在1520mA，大约1520min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶后，电流升到3045mA，电泳过程保持电流稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿12cm处即停止电泳，约12小时。染色、脱色：电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入铜丝作为标志，放入大培养基中染色，使用0.25%的考马斯亮蓝染液染色，过夜。弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经常更换脱色液，直至蛋白质带清晰，最后测出蛋白质的相对分子质量。2.4.4 溶菌酶酶性的测定(1)溶菌酶的抑菌作用培养基的制备：液体培养基：3g牛肉膏，10g蛋白胨，5gNaCl，蒸馏水定容到1000ml；固体培养基：3g牛肉膏，10g蛋白胨，5gNaCl，20g琼脂，蒸馏水定容到1000ml15。按照枯草芽孢杆菌培养基配方说明分别配制60ml固体培养基和30ml液体培养基，同时准备20个培养皿，一起于121、0.1MPa条件下灭菌20min：待固体培养基温度降至50左右时，在无菌操作台内倒平板，凝固后，将这20个培养皿分为两组，放于4冰箱内保存备用。细菌的活化与扩增：在无菌条件下，从已保存的菌种斜面上挑选单一菌落，转接到10ml的液体培养基中，37水平摇床上培养3h，然后从该培养基中吸取0.1ml的培养液转移到一个含有20ml培养基的三角瓶中进行扩增培养，37培养8h。溶菌酶抑菌试验：先将已扩增好的菌液用经灭菌的液体培养基按102、103、104、105、106依次进行倍比稀释，取稀释好的菌液与50u l预先稀释好的已过滤除菌的浓度为5mg/ml的溶菌酶溶液混合，然后将其倒入固体培养基进行涂布操作(固体培养基要提前于室温中放置十分钟)。20个培养皿分两组平行操作，每个梯度分别设实验组(B)和空白组(A)，空白组用无菌水代替溶菌酶溶液。整个操作要求在无菌环境中进行，已涂布好的固体培养基放于37恒温箱中培养12h，然后观察试验结果，并统计每个培养皿中的菌落数16。 (2)溶菌酶酶活力的测定磷酸盐缓冲溶液的配制：称取25g磷酸二氢钾，倒入500ml烧杯中，加入20ml磷酸，待磷酸二氢钾全溶后加入蒸馏水稀释，调节pH值至6.2左右。底物悬浮液的制备：称取枯草芽孢杆菌0.02g，加入5ml磷酸盐缓冲液，在研钵中研磨3min，然后倒入50ml烧杯中，再加入磷酸盐缓冲液，使总体积达到50ml。供试品溶液的制备：称取5mg溶菌酶于25ml烧杯中，加磷酸盐缓冲液使其溶解并稀释，摇匀。将其移至100ml量瓶中，加磷酸盐缓冲液至刻度，摇匀。此时每1 ml供试品溶液中含溶菌酶约为0.05 mg。测定酶活力：取含枯草芽孢杆菌悬浮液作为底物加入一定量的供试品溶液，用pH为6.2的磷酸盐缓冲液调pH值，于30450nm的波长下测定吸光度的变化以每毫克溶菌酶每分钟使吸光度降低0.001个单位为一个酶活力单位同17。E450/(0.001Ew)=U/mg式中E450：450nm处每分钟中吸光度的变化Ew：每0.5mL所用酶溶液中含有酶的质量，mg0.001：一个单位每分钟内使吸光度下降0.001在以往文献报道中，都是每隔1min、0.5min甚至15s记录1次结果，但本实验由于底物悬液的不均匀性，从加入酶液到第15s时吸光度下降极为迅速，误差较大，另外90s以后菌体和酶液已经大量减少而更不能充分接触、反应，更加不稳定，记录结果无较大意义。因此取第15 s和第75 s之间的差值，这样便简化了读数范围。第3章 结果与讨论第3章 结果与讨论3.1 pH值的影响3.1.1 pH值对抽提的影响以清洗后的蛋壳为原料用2mol/L-1HCl维持抽提液pH，使pH处于3.5、4.0、4.5、5.0、5.5及不控制pH的条件下进行抽提。提取温度：室温25；提取时NaCl含量：2.0表3-1 pH值对抽提的影响蛋壳pH溶酶菌50gpH不控制0.043g50gpH3.50.042g50gpH4.00.044g50gpH4.50.052g50gpH5.00.050g50gpH5.50.047图3-1 pH值对抽提的影响从表、图3-1中可以看出当pH维持在4.5时酶的提取量较大，pH不控制时溶菌酶的提取量最少。pH在4.5之前随着pH的增大提取量也随之增大，pH过4.5后提取量又有所减少。抽提的最佳pH为4.5。3.1.2 pH值对酶活的影响图3-2 pH值对溶菌酶活性的影响由图3-2可以看出pH在45范围内，酶的活性较高，实验中抽提的目的是用抽提剂(NaCI)使溶菌酶从蛋壳膜中溶解出来。由图可知，pH越大，对抽提越有利，溶菌酶从蛋壳中溶解出的量就会越多，但酶活在pH值4.5之后时有下降趋势此外，在pH为34.5之间时，酶活变化较为显著，溶菌酶稳定性较差，因而溶菌酶虽然在酸性条件下耐热性很好，但过酸也会影响溶菌酶的活性。产生这种情况可能的原因是pH改变了酶的活性中心或与之有关的基团的解离状况，因为酶要表现活性，它的活性部位有关的基团必须具有一定的解离形式，其中任何一种基团的解离形式发生变化都将使酶转入“无活性”状态；而活性部位以外的其它基团则无关紧要。另外，在抽提中所选择的pH不应超过酶的稳定范围，其次从最佳的抽提效果着眼，抽提时pH最好远离待抽提酶的等电点，即酸性蛋白质宜用碱性溶液抽提，碱性蛋白质宜用酸性溶液。最后，还要考虑到抽提要有利于切断酶和细胞内其它成分间可能有的联系9。3.2 温度的影响3.2.1温度对抽提的影响在固定pH值为4.5的前提下，分别在25(室温)、30、35、40、45中进行抽提。提取pH：pH4.5,提取时Nacl含量：2.0表3-2 温度对酶抽提的影响抽提温度2530354045溶菌酶的量0.0380.0550.0570.0580.056图3-3 温度对酶抽提的影响由表3-2图4-3克可知在固定pH值为4.5的前提下当抽提温度为40时，酶的提取量最大，室温时酶的提取量最少；温度在40之前随着温度的升高提取量也随之增大，温度过40后提取量又有所减少。3.2.2温度对酶活的影响图3-4 温度对溶菌酶活性的影响由图3-4可知，随着温度的提高。溶菌酶的活性增大，在2 540范围内，溶菌酶的活性变化显著，40时酶活力最大。40以后，随着温度进一步升高，酶蛋白变性，酶活性则开始下降。抽提时采用较高温度进行试验，也是充分考虑到溶菌酶的耐热性较好和一些文献资料而确定的。3.3 NaCl浓度的影响3.3.1不同的NaCl浓度对抽提的影响本实验分别以0.5NaCl、1NaCl、1.5NaCl 、2NaCl、2.5NaCl五种浓度进行平行实验。提取pH：pH4.5 提取温度：室温25表3-3 不同的NaCl浓度对溶菌酶提取的影响抽提条件溶酶菌0.5NaCl0.054g1NaCl0.055g1.5% NaCl0.056g2NaCl0.057g2.5NaCl0.056g图3-5 不同的NaCl浓度对溶菌酶提取的影响从表3-3和图3-5中可以看出随着溶液中盐的浓度增大，酶的提取量也增大，但是达到一定浓度后提取量有所下降，所以当NaCl浓度为2%时酶的提取量较大。3.3.2 不同的NaCl浓度对酶活的影响图3-6不同的NaCl浓度对溶菌酶活性的影响从图3-6可以看出，抽提剂质量分数为2时溶菌酶活力最大，随着抽提剂质量分数的变大，溶菌酶酶活变大，且其变化曲线明显。出现这种情况可能是因为抽提溶液中的盐离子能减弱溶菌酶分子间离子键及氢键的作用力，其盐离子作用于大分子表面，增加了表面电荷，从而极性增加，水合作用增强，形成稳定的双电层10。如果从溶解度角度考虑，盐溶液的质量分数加大，溶解度也会变大，因而盐溶液质量分数提高，溶菌酶活性应随之增强。但抽提剂质量分数超过2时，对酶活性的影响进一步加剧7。3.4 盐析时pH值对溶菌酶活性的影响这五组实验的条件是：抽提用NaCl溶液浓度2温度40，pH值4.5，盐析用NaCl溶液浓度为5。图3-7 盐析时pH值对溶菌酶活性的影响图3-7表明盐析pH为11时，溶菌酶的酶活最大，并且pH在91l内酶活变化曲线陡峭，出现这种情况可能是因为溶菌酶的等电点为11.1，提取的pH接近等电点，利于溶菌酶的析出，酶量增加，也使酶活性显著升高，并且此处析出的溶菌酶活性较好。所以在较低的盐浓度下，溶液的pH值接近等电时，析出的溶菌酶活性较好。3.5 溶菌酶酶活性3.5.1 溶菌酶抑菌效果图3-8 溶菌酶的抑菌作用从图3-8可以看出，溶菌酶对枯草芽孢杆菌具有明显的抑制作用。未加溶酶的培养基上菌落生长较大，而含有溶菌酶的培养基上的菌落非常小，并且分布比较分散，这说明鸡蛋溶菌酶严重影响到枯草芽孢杆菌的生长，对其生长有明显的抑制作用。3.5.2 溶菌酶活力测定根据实验测得的数据可知，提取时的pH、温度和氯化钠的浓度不同时，溶菌酶的酶活力也不同，由表3-4可知，当pH为4.5，温度40，氯化钠浓度为2%时，溶菌酶酶活力最高。计算酶活力：E4500.0761U；Ew=0.005mg； E450/(0.001Ew)=0.0761U/(0.0010.005mg)=15220U/mg所以测得溶菌酶的最高酶活力为15220U/mg。表3-4 不同条件下的酶活力pH温度NaCl浓度E450酶活力3.5252.0%0.0594118704.0252.0%0.0637126204.5252.0%0.0692138405.0252.0%0.0671134205.5252.0%0.0657131404.5252.0%0.0682136404.5302.0%0.0734146804.5352.0%0.0753150604.5402.0%0.0761152204.5452.0%0.0759151804.5250.5%0.0623124604.5251%0.0632126304.5251.5%0.0646129104.5252%0.0679135804.5252.5%0.066013210结 论本实验主要是采用聚丙烯酸沉淀法从废弃的新鲜蛋壳中提取溶菌酶并测定其活力，在使用原料和废物再利用的角度上，本实验对以减轻环境污染和废物回收利用为原则提取的方法进行改进。得出以下几个结论：(1) 本实验成功的从1000g废弃的新鲜蛋壳中提取出0.801g溶菌酶。(2) 在实验过程中讨论了不同pH值、温度、NaCl溶液浓度等因索对抽提的影响，对比不同条件下溶菌酶的抽提量和不同条件下提取的溶菌酶的酶活力，确定了最佳的抽提条件：最佳抽提pH为4.5，最佳抽提温度为40，最佳抽提剂NaCl质量分数为2.0最佳盐析pH为11(3) 研究了溶菌酶对枯草芽孢杆菌生长的影响作用，发现溶菌酶对枯草芽孢杆菌生长有抑制作用(4) 计算不同条件下提取的溶菌酶的酶活力，在最佳抽提条件下提取的溶菌酶的酶活力最高，15220Umg。本实验的成功完成，对于环境保护和废弃资源再利用有着重要的意义，我国作为一个产蛋大国，每天产生的废弃蛋壳重量以千吨计，成批抛弃的蛋壳很快就会腐败变质，造成环境的污染，与其我们不遗余力地寻求解决垃圾污染、破坏环境的方法