聚合酶链式反应-2011分子生物学.ppt

第三章 聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction, PCR ） 聚合酶链反应 又又称体外体外DNADNA扩增技术。是指利用耐热扩增技术。是指利用耐热 DNADNA聚合酶的反复作用，通过变性聚合酶的反复作用，通过变性- -退火退火- - 延伸循环操作，在体外延伸循环操作，在体外特异特异地扩增所需要地扩增所需要 的的DNADNA片段的一种技术。它能片段的一种技术。它能快速快速将将皮克 (pg)水平的DNA特异地扩增100万倍左右 ，达到微克(g)水平。 优点：敏感度高、特异性强、产率高、重优点：敏感度高、特异性强、产率高、重 复性好以及快速简便等。复性好以及快速简便等。 在分子生物学、基因工程研究，以及遗传 病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研 究中得到广泛应用。 并已普及到许多普通实验室，大大简化了并已普及到许多普通实验室，大大简化了 传统的分子克隆技术，便于对传统的分子克隆技术，便于对目的基因目的基因 进行分析、鉴定。进行分析、鉴定。 目的基因目的基因 载体载体 复制子复制子 宿主细胞宿主细胞 扩增扩增 扩增扩增 提取提取DNADNA分子分子 通常的通常的DNA DNA 扩增法是分子克隆法扩增法是分子克隆法, , 首先要构建含有目的的基因的载体首先要构建含有目的的基因的载体, , 然然 后将它导入细胞后进行扩增后将它导入细胞后进行扩增, ,还要用同还要用同 位索探针进行筛选位索探针进行筛选; ;要经过要经过DNADNA内切、连内切、连 接、转化和培养等相关的过程，操作复接、转化和培养等相关的过程，操作复 杂杂, ,一般需要数周时间。一般需要数周时间。 70年代的初期由Dr. H. Klenow发现了较具有实验价 值及实用性的Klenow fragment of E. Coli ； 1976年从 温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分 离出来的Taq polymerase ，它的特性能耐高温。 80 年代之后它被广泛运用； 1983年美国Mullis等人发明了聚合酶链反应方法； 1985年美国PE-Cetus公司开发出了具有应用价值的 PCR技术； 1987年引入了耐高温的DNA聚合酶，从而使PCR成 为一项成熟的技术，而迅速在世界各地推广。 1993年Mullis也因此获得了诺贝尔化学奖。 PCR技术的发现 Kary B Mullis (1944-) l 1983 年提出PCR方法 l 1993年度诺贝尔化学奖 一、PCR基本原理 PCR是一项DNA体外合成技术，类似于 生物体内的DNA复制过程。 依据DNA半保留复制的机理。 PCR合成DNA比细胞内复制过程简单。 第一节 PCR技术的原理和特点 细胞内复制的过程 1）细胞内有关蛋白质参与下，DNA双螺旋 解链成两条单链，各自作为模板。 2）引物酶以两条单链为模板各自合成一段引 物，引物提供3-OH末端。 3）DNA聚合酶以亲代DNA单链为模板，以 dNTP为原料，按照碱基配对的原则，从引 物的3端，循53方向，将脱氧核苷酸聚 合，最终形成子代的DNA双链。 Denaturing 95C Annealing Tm-5C Extension 72C PCR的原理 PCR的基本过程 1.变性：将反应体系升温至95左右，样品 中双链DNA解开成两条单链，各自作为模 板（待拷贝的 DNA 称为模板） 。 2.退火：将温度降至引物的Tm值以下(55 左右)，5端和3端的引物各自与两条单链 DNA模板的互补区域结合。 5 5 3 3 编码链 3端引物5端引物 3 3 3. 延伸：将温度升到75左右，耐热的 Taq DNA聚合酶催化四种 dNTP，从引 物3-OH端开始，依据模板碱基序列互 补方式依次聚合，合成一条互补的DNA 链。 5 5 3 3 5 DNA聚合酶 5 Cycle 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 PCRPCR产物的鉴定、提取产物的鉴定、提取 PCR的扩增效应 理论上，每增加1个循环，双链DNA片 段会增加1倍，使DNA量可成指数(2n)增 加。 实际上，扩增效应低于指数增加，约为 (1+X)n。 一般进行30个左右的循环，特定区域的 DNA量可至少增加 106 倍。 PCR产物的积累规律 PCR反应初期，目的DNA片段的增加 呈指数扩增。随着目的DNA扩增产物 的逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和， 此时DNA扩增产物的增幅减慢，即出 现“平台效应”。 到达平台期所需要的循环次数一般在30 次循环之后。 PCR DNA复制 部位： DNA体外合成放大过程 生物体内DNA合成 引物： DNA引物 RNA引物 （作为新链的一部分） （复制终止时被切除 ） 催化酶：TaqDNA聚合酶 DNA聚合酶 有5 3核酸外切酶 有5 3核酸外切 酶 无3 5核酸外切酶 有3 5核酸外切 酶 基本过程：每循环一次包括 复制起始、链延伸 和 变性、退火、延伸 终止三阶段 反应实质：扩增靶DNA 合成子代DNA PCR仪 聚合酶链反应中的变性、退火 、延伸的温度和时间，以及循环 次数，是由具有程控的快速升温 和快速降温装置的PCR仪控制。 PCR仪 越快，越精确，越昂贵 ABI 7500实时荧光定量PCR仪 普通梯度PCR仪 二、PCR技术的特点 1. 高度的敏感性：可将极微量(pg)DNA ，扩增到紫外光可见的水平(ug)，这 是最主要的特点，它可对单拷贝基因 、单个细胞、单根头发、一滴血等微 量标本进行分析。 2. 高度的特异性：PCR扩增的特异性 由两个引物的序列决定，因此引物 设计至关重要。 引物与模板DNA特异正确的结合； 遵循碱基配对原则； Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； 靶基因的特异性与保守性。 引物引物 引物引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决引物的序列及其与模板结合的特异性是决 定定PCRPCR反应结果的关键。反应结果的关键。 引物设计的原则是最大限度地提高扩增效引物设计的原则是最大限度地提高扩增效 率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增 。 基因 组 3. 适用样品的广泛性： 对样品的要求并 不十分严格： 1)可以是DNA，也可以是RNA 2)可以是纯化的，也可以是粗制的 3)可以是新鲜组织，也可以是陈旧组 织 4)可以是细胞，也可以是体液 4. 操作简便、快速：PCR自动化，数小 时完成。扩增产物一般用电泳分析，不一 定要用同位素，无放射性污染、易推广。 三、参与PCR反应体系 的因素及其作用 模板 引物 Taq DNA聚合 酶 dNTP Mg2+ 缓冲液 反应温度 循环次数 PCR仪等 n PCR体系 （一）模板核酸 1. 模板：指能扩增靶DNA片段的核酸 2. DNA是直接模板，RNA是间接模板 RNA样品必须先经过逆转录 生成cDNA， cDNA作为PCR扩增 的模板。这个技术称为逆转录 PCR（RT-PCR）。 病原体标本：有病毒、细菌、真菌、螺 旋体、立克次体、支原体等。 病理生理标本：有细胞、血液、绒毛、 羊水细胞、尿液、上皮细胞、体外培养 细胞系。 法医学标本：有血斑、精斑、毛发等。 考古标本：残留有核酸物质 3. 常见的扩增对象(含核酸的标本)： 4.避免有影响扩增反应的物质存在 如：核酸酶：降解DNA、RAN 蛋白酶：降解Taq DNA聚合酶 血红素、抗凝剂：抑制Taq DNA聚合 酶 活性 理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩 增只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列 DNA作为模板。 人基因组组DNA0.1-1 g 大肠肠杆菌基因组组DNA10-100 ng DNA0.5-5 ng 质质粒DNA0.1-10 ng 5. 模板量要合适，一般为102105拷贝。 50l PCR反应体系中模板DNA推荐使用量 （二）引 物 1）引物：2条人工合成的、能与 模板DNA互补结合的脱氧寡核 苷酸。 1. 引物的性质和作用 2）引物的序列：根据欲扩增的DNA 片段两端序列而设计的。 5端引物：与模板链的5端序列相同； 3端引物：与模板链的3端序列互补。 5 5 3 3 模板链 3端引物5端引物 3 3 3) 引物决定PCR扩增产物的特异性和 长度。 4) 引物设计决定PCR反应的成败。 特异性：引物只针对DNA的一个特定序列 互补结合，因此2条引物与DNA模板 特异性结合决定了要扩增的DNA区 域。 长度：2条引物分别互补于所要扩增DNA 片段的两端，使DNA片段的扩增只 限于引物之间的部位。 2. 引物设计的基本要求 1）引物长度要合适，一般为1630个 核苷酸，常用20bp左右。 引物过短：会影响PCR的特异性； 引物过长：需提高相应的退火温度，若 超过延伸温度即Taq DNA酶的最适温度 ，则影响PCR反应产物。 2）G+C含量一般占5060，有利于引 物与模板的结合。G C太少扩增效果不佳 ，G C过多易出现非特异条带。 3） ATCG 4 种碱基随机分布，避免连续出 现3个以上相同的嘌呤或嘧啶核苷酸的成 串排列，最好随机分布。否则易使引物与 模板的嘌呤或嘧啶密集区发生错配。 4）引物内部不能存在互补序列，以避免形 成发夹结构。 5）两个引物之间不能存在互补序列，以避 免形成引物二聚体。 6）引物与非特异性序列的同源性不能超过70% 或不能有连续8个碱基互补，否则导致非特 异性扩增。 7）引物3末端碱基一定要与模板正确配对，引 物3端最佳碱基选择是G和C。 8）引物的5端可以修饰，如：引入酶切位点、 启动子序列、用荧光素、生物素等标记等 9）引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条 件下可扩增长至10kb的片段。 55 限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列 启动子序列启动子序列 定点突变定点突变 探针标记探针标记 引物引物33端端为为关键碱基关键碱基；55端端无严格限制。无严格限制。 33 355 G C 3.引物的使用要求 引物浓度要远高于模板浓度，一般每条引 物的浓度0.1 0.5 mol，以最低引物量产 生所需要的结果为好。引物浓度偏高会引 起错配和非特异性扩增，且可增加引物之 间形成二聚体的机会。 合适的退火温度比引物本身的Tm低 5 ，一般在 55 左右。 （三）Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶是从一种水生栖嗜热菌YT1株( 一种嗜热真菌)分离提取出来，该酶基因全长 2.49kb，编码832个氨基酸。该酶虽然在90以上 几乎无DNA合成， 但确有良好的热稳定性。（天 然酶） 另一类通过基因工程合成的酶。（基因工程酶） Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应 的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应 用的原因。 (一)酶活性与热稳定性 1）酶蛋白分子量 94KDa，比活性200 000/mg， Taq酶的浓度通常为12.5/l，太多浪费并易导致 非特异性扩增。 2）热稳定性好：能耐受DNA变性时的高温 在92.5、95 、97.5时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min、40min、5min后，仍 可保持50%的活性。 PCR反应时变性温度为9520sec，50个循环 后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。 1）Taq DNA聚合酶是Mg2+ 依赖性酶，对Mg2+ 浓度非 常敏感。 2）Mg2+浓度2.0mmol/L时，能最大限度地激活 TaqDNA聚合酶的活性。 3）Mg2+ 能与dNTP结合而降低PCR反应液中游离的 Mg2+ 浓度，优化浓度一般反应 中Mg2+ 浓度至少应 比dNTP总浓度高0.51.0 mmol/L。 4）适当浓度的KCl能使Taq DNA聚合 酶的催化活性 提高5060%。 (二)离子依赖性 1）TaqDNA聚合酶具有53 聚合酶活性和53 外切酶活性，而无3 5外切活 性，在PCR反应 中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能 。Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2.110-4。 2）Taq DNA聚合酶还具有逆转录酶活性. (三)忠实性 (四) Taq酶的最适温度 7580每个酶分子可延伸约150个核苷酸/秒，70 延伸率大于60个核苷酸/秒，55时为22个核苷酸/秒。 最适温度75左右。 （四）原料 原料：四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)：浓度 为 20200mol/L。 Mg2+：为Taq 酶的必需激活剂。 浓度为0.52.5mmol/L。 太少：酶活性明显降低； 太多：导致非特异性扩增。 （五） Mg2+ 反应温度和时间 1. 变性： 95，30”1 双链DNA变成单链。 2. 退火：55，30”1 引物与模板互补结合。退火温度对特异性影响很大 。退火温度=Tm值-(510) Tm值(解链温度)= 4(G+C)2(A+T） 3. 延伸：7275， 1 2 Taq 酶催化dNTP，从引物3-OH端开始，与模板 互补，合成一条新的DNA链。 小于20bp 片段 反应缓冲液：常用10mmol/L Tris-HCl缓 冲液，pH8.38.8为Taq 酶最适pH值。 循环次数：主要取决于模板DNA的起始浓 度，合适的循环数为25 30次。 循环数太少：产物量不多 循环数太多：非特异性扩增会增加，出 现平台效应 PCR反应体系 5扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双蒸水至 50ul 四、四、PCRPCR常见问题常见问题 1.无扩增产物 1. 模板:含有抑制物，含量 低 2. Buffer对样品不合适 3. 引物设计不当或者发生降 解 4. 反应条件：退火温度太低 延伸时间太短 原 因 对 策 1. 纯化模板或者使用试剂盒 提取模板DNA或加大模板 的用量 2. 更换Buffer或调整浓度 3. 重新设计引物（避免链间 二聚体和链内二级结构） 或者换一管新引物 4. 提高退火温度、延长延伸 时间 现象：对照组有条带，而样品则无； 2. 非特异性扩增 现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小 不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩 增带与非特异性扩增带。 1.引物特异性差 2.模板或引物浓度过 高 3.酶量过多 4.Mg2+浓度偏高 5.循环次数过多 原 因 对 策 1.重新设计引物 2.适当降低模板或引物 浓度 3.适当减少酶量 4.降低Mg2+浓度 5.减少循环次数 非特异性扩增 3.拖尾 现象：产物在凝胶上呈拖尾状态。 M 1 2 1.模板不纯 2.降解 3.退火温度偏低 4.酶量过多 5.dNTP、Mg2+浓度偏 高 6.循环次数过多 原 因 对 策 1.纯化模板 2.改变条件 3.适当提高退火温度 4.适量用酶 5.适当降低dNTP和Mg2+ 的浓度 6.减少循环次数 拖尾 4.假阳性 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物 对策： 1. 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪 内或溅出离心管外； 2. 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均 应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性 使用。 3. 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 五、 PCR实验注意事项 由于PCR的灵敏性极高，故微量的样品污染 便可导致假阳性结果的出现。所有的溶液都 应该没有核酸和核酸酶的污染 采取的措施： 1）隔离不同的操作区 2）采用一次性用具 3）严格按无菌操作原则进行 4）并设置严格的对照，以提高PCR结果的 正确性。 除实验样品外，应设几种实验对照： 1）阳性对照：阳性DNA模板参与的PCR 反应；阳性对照要选择扩增度中等、重 复性好，经各种鉴定是该产物的标本。 2）阴性对照：无核酸模板参与的PCR反 应；在PCR试剂中不加模板DNA或RNA ，进行PCR扩增，以检测试剂是否污染 。 示例电泳结果 1 2 3 4 5 M M：DNA marker 1：为阳性对照 2：为阴性对照 3-5：为扩增出的 DNA条带 DNADNA片段片段 基因诊断基因诊断 基因治疗基因治疗 基因工程产品基因工程产品 法医学检测法医学检测 人类学研究人类学研究 六、 PCR技术的主要用途 PCR 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模 板获得已知目的基因片段, 或与逆转录反应 相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模 板获得目的片段。 1. 目的基因的克隆 大肠杆菌大肠杆菌 胰岛素胰岛素 重组体重组体 + 胰岛素胰岛素基因基因 基因工程基因工程 产品产品 A 内源内源性病变基因性病变基因 正常人A 病 人 病原微生物基因 正常人 (-) 病 人 (+) 2. 基因检测 遗传病的诊断遗传病的诊断 基因缺失、插入或置换等基因缺失、插入或置换等 地中海贫血地中海贫血 珠蛋白链珠蛋白链合成障碍，或合成障碍，或珠蛋珠蛋 白白的组分改变，的组分改变，功能降低功能降低 A 正常人正常人 病病 人人 正正 常常 病病 人人 ASOASO探针法探针法 病人病人 A A C C T T G G ASOASO探针探针 正常正常 PCR-ASO检测基因点突变：主是利用PCR技 术扩增靶基因的适当片段，然后用人工合成 的含突变位点的标记寡核苷酸探针杂交 探针杂交 NC膜探针 正常人正常人 突变纯合子突变纯合子突变杂合子突变杂合子 PCR-RFLPPCR-RFLP（restriction fragment length polymorphism 限制性片段长度多态体）法：）法： 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因） RasRas基因基因 突变突变 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 正常正常突变突变 电电 泳泳 3. DNA和RNA的微量分析 PCR技术高度敏感，对模板DNA的量 要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好 方法。 PCR后将待测DNA片段既可克隆到特定 的载体进行序列测定，也可直接测定。 PCR技术引入DNA序列测定，使测序工 作大为简化，也提高了测序的速度； 使用引物对靶序列进行扩增，就可掺入同位 素或非同位素标记的各种碱基，获得所需比活性 的探针 。 4. DNA序列测定 5. 用PCR标记DNA探针 mRN A 第二节 常用几种PCR反应 1)RNase 2)碱性液 (水解RNA) 单链DNA 逆转录酶 (使dNTP 聚合) RNA-DNA杂化链 PCR 一、逆转录 PCR DNA 聚合酶 双链DNA (使dNTP 聚合) PCR 二、实时 PCR 实时PCR（real-time polymerase chain reaction） 又称荧光定量PCR。是指在PCR反应体系中加入荧光 化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不 断累计，荧光信号强度也等比例增加，利用荧光信号 积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未 知模板进行定量分析的方法。 荧光定量光定量PCRPCR仪是一种带有激发光源和荧光仪是一种带有激发光源和荧光 信号检测系统的信号检测系统的PCRPCR仪，通常配有电脑系统仪，通常配有电脑系统 及相应的分析软件。及相应的分析软件。 实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测 反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定 量分析的干扰，亦被称为定量PCR，得到广 泛应用。 荧光定量荧光定量PCRPCR标记方法：标记方法： 序列特异性探针：如序列特异性探针：如 T T aqmanaqman 内掺式染料：如内掺式染料：如SYBR GreenSYBR Green I PCR引物 n实时PCR技术原理 引物之间间一段带带有标记标记 寡核苷酸链链，称作探 针针 报报告基团团淬灭灭基团团 无荧荧光信号产产生 能量 激发发光 完整的探针：5端荧光基团吸收能量后将能量 转移给临近的3端荧光淬灭基团（发生荧光共 振能量转移） 变性变性 (95(95C)C) 退火退火 (60(60C)C) 退火退火 (60(60C)C) ? 53外切酶活性 将探针5端连接的荧光基 团从探针上切割下来 n实时PCR技术原理 Q R 3 3 5 5 上游 引物 下游 引物 荧光标记分子 R Q 3 3 5 5 荧光报 告分子 荧光淬灭 分子 荧 光 信 号 SYBR Green I作用机理 Emission Emission SYBR Green I作用机理 ExcitationEmission 原位PCR(In Situ PCR,IS-PCR)是利用完整的细胞利用完整的细胞 作为一个作为一个微小的反应体系微小的反应体系来扩增细胞内来扩增细胞内进行原位扩增 目的片段目的片段, ,在不破坏细胞的前提下在不破坏细胞的前提下, ,利用一些特定的检利用一些特定的检 测手段来检测细胞内的扩增产物测手段来检测细胞内的扩增产物进行定性定量定位分 析。 即即把原位杂交的细胞定位技术与PCR的高灵敏 度相结合的技术。 三、原位 PCR 待检标本先经化学固定，以保持组织细胞的良好 形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性， PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶， dNTP等均可进入细胞内或细胞核内。 以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板 ，于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或 互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，被保 留在原位。使原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定 DNA或RNA序列在原位以呈指数扩增，扩增的产物 就很容易被原位杂交技术检查。 使用专用原位PCR的仪器。 用反向的互补引物来扩增两引物以外的用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNADNA片段