狼尾草属6个品种（系）EST-SSR指纹图谱构建开题答辩完.docVIP

四川农业大学草业科学专业2011级本科生开题报告狼尾草属6个品种（系）EST-SSR指纹图谱构建学生： 苟 强 学号： 20110018 班级： 草业科学11级1班 指导教师： 黄琳凯（副教授） 完成日期： 2014年 4 月 10日四川农业大学本科毕业论文（设计）开题报告毕业论文（设计）题目狼尾草属6个品种（系）EST-SSR指纹图谱构建选题类型基础型课题来源省级项目学 院动物科技学院专 业草业科学指导教师黄琳凯职 称副教授姓 名苟强年 级2011级学 号201100181 文献综述 狼尾草因其具有耐干旱、耐瘠薄、养护简单、景观效果自然质朴等特性，受到园艺学家和园林设计师的青睐1。狼尾草是热带、亚热带地区重要的牧草，是草食家畜和食草淡水鱼的优质饲料和青饵料，又是南方亚热带地区的保土植物2。狼尾草广泛应用于我们的生活中，为畜牧业发展和生态环境建设作出了突出贡献。我国目前已开发或引进了许多该属植物作为饲草种植和园林观赏植物，并在生物学特征、适应性、产量和品质方面展开了研究3。近年来，随着基础研究的加强和分子标记技术的发展，带动了狼尾草育种和生物学特性研究的快速发展，新的品系不断出现。由于大多数形态性状易受环境因素影响，可描述的形态特征有限，所以依赖于形态学的种质鉴定结果并不准确。因此，构建狼尾草的DNA指纹图谱将对其品种真实性鉴定、知识产权保护和新品种培育具有重要意义。1.1 狼尾草的分类、分布与习性简介狼尾草属（Pennisetum Spp.）为禾本科、黍亚科一年生或多年生草本植物。全世界约有140余种，是世界性大属，广泛分布于热带、亚热带和部分温带地区4。我国人工栽培利用的主要是多年生象草（P. purpureum）、一年生美洲狼尾草(P. americanum)以及象草与美洲狼尾草的杂交种。截止到2011年，我国草品种审定委员会审定的狼尾草属品种共14种，其中引进福建省栽培种植面积较大的有5个品种依次为华南象草（P. purpureum cv. Huanan）、杂交狼尾草（P. americanumP. purpureum）、热研4号王草（P. purpureumP. typhoideum. cv. Reyan No.4）、桂牧1号杂交象草和魔特矮象草（P. purpureum cv. Mott）,对当地的草食动物的生产发展发挥了重要的作用5。本实验材料主要有红色狼尾草、矮象草、皇竹草、桂牧1号杂交象草、宁杂3号、台畜2号等品种。红色狼尾草（P. setaceum Rubrum.）是多年生草本，株高可达1.5m，叶基生，禾叶状，叶色深红色，花期为夏季中旬过后，穗状花序，花玫瑰红，成熟后变成白色。该品种由美国提供，其抗逆性、抗病性均较强，可常年观赏，是一种非常好的室外庭院种植观草植物，但该草自然情况下种子萌发率非常低6。矮象草（P. purpnreum cv. Mott）是多年生植物，由于其适应性较广、抗逆性强、较耐干旱、产量较高且质量好、茎叶粗蛋白质含量高、适口性好、叶量大、利用率高，是中小型动物的上乘饲料，相比热带禾本科牧草，其营养价值非常高。矮象草易于种植，在我国海拔1000m以下、年极端低温-5以上、年降雨量700mm以上的热带、亚热带地区均可种植7。皇竹草(P. purpureumP. typhoideum)是禾本科狼尾草属多年生牧草品种，由象草和非洲狼尾草杂交育成。我国最早于1982年从哥伦比亚引种到海南岛试种成功。皇竹草根系发达，植株高大，直立丛生，株高可达4.5m，密集圆锥花序，但温带地区栽培多不抽穗，仅表现为营养生长，因此一般只能利用腋芽进行无性繁殖。皇竹草能耐受短期的干旱，但却不能耐受水淹或涝积，喜土层深厚、疏松肥沃、排水良好的土壤，在气温达1215时才开始生长，2535为适宜生长温度，低于10时生长受到抑制，低于5时停止生长，低于0的严寒条件下可能冻死，需采取保护措施。它是典型的C4植物，光合速率强，粗蛋白和糖分含量较高，生物产量高，是一种适宜热带亚热带及我国南方温带地区栽培种植的优质高产牧草品种8。桂牧1号杂交象草(P. purpureum cv.Mott)(P. americanumP.purureum)cv.Guimu No.1是广西畜牧研究所1992年以美国引进的杂交狼尾草美洲狼尾草（P. americanum）象草（P. purpureum）为母本、矮象草（P. purpureum cv. Mott）为父本进行有性杂交，经多年的选育培育而成的新型杂交象草品种。该饲草具有产量高、再生能力强；品质好、营养丰富；抗逆性强、适应性广；青绿期长，利用时间久；密封地面快、覆盖强度大，拦截泥沙能力强；一年种植、多年利用，且病虫害少，全年不需打药治虫的特点，是一种适于热带、亚热带地区种植的高产优质多年生饲料牧草新品种，在我国南方各省市、海拔850m以下的红、黄、沙壤土中均能良好生长9-10。宁杂3号美洲狼尾草是利用美洲狼尾草不育系与鲜草和籽实产量高、恢复性能好的恢复系配制的种内杂交种。其鲜草、干草亩产量均比对照品种宁牧26-2高，表现出适应区域广、适应性强、鲜草产量高、适口性好等特点。与苏丹草相比较，其具有分蘖多、耐刈割、抗病等特性，是适宜长江流域及其以南地区种植的一年生夏季优质高产牧草品种11-13。狼尾草台畜2号（P. purpureum cv.）原产非洲，适合温热气候，具有叶面光滑、极少或不具茸毛的植物学特征：平均年产鲜草量达398.68t/hm2,平均年产干草量达54.91t/hm2,鲜干比为7.26；生育期313天；具耐高温、较抗寒、喜湿、好肥、生育期长、生长迅速、产草量高等优良特性，具备抗病虫害、较耐水渍，较耐酸性土壤等能力14。1.2 EST-SSR分子标记技术EST（Expressed Sequence Tags，表达序列标签）是一小段（通常长度300500bp）单次重复的mRNA序列或cDNA序列。它们在特定的组织或者特定的时期内特异的表达，可以看作是特定的cDNA文库中的标记。EST计划由美国科学家Venter于1989年提出，并首先应用于人类基因组研究，之后被广泛用于植物基因组研究，它是通过大规模的cDNA随机测序，从而获得对基因组认识的一种研究策略15。EST的出现为SSR的开发带来了新的契机，近年来快速增长的ESTs数据已成为SSR标记的重要来源。为了与传统的基因组SSR标记相区别，一般将源于EST库的SSR称为EST-SSR标记16。EST-SSR是近年发展起来的新型分子标记，与传统SSR标记相比，不仅具备传统SSR标记的特点，而且能够更准确地检测出品种间的亲缘关系17。它反映了基因的编码部分，可以直接获得基因表达的信息，为功能基因提供“绝对”的标记，这有可能对决定重要表型性状的等位基因进行直接鉴定18；它避免了传统SSR标记开发需要构建基因组DNA文库等烦琐步骤，而且从ESTs中发掘出的SSR只是ESTs测序计划的副产品，从而节省了大量人力物力19；由于不同物种间基因共线性和保守性，从一种作物中开发的EST-SSR可同时用于其他作物研究，从而能够为比较基因组学和同源基因克隆提供新的途径20。此外，它还具有开发引物比较廉价、通用性好、条带清楚、容易统计等优点21。如今EST-SSR已在植物遗传多样性分析、遗传图谱构建及标记辅助育种中广泛应用22。1.3 狼尾草分子标记技术的研究进展分子生物学技术应用于狼尾草的种质资源研究上，主要有RAPD（Random amplified polymorphic DNA）、ITS(Internal transcribed spacer)等技术23-24。目前国内主要通过RAPD技术对来自不同区域的多种狼尾草属牧草进行了种质资源分析，有效地分析了狼尾草属牧草的遗传多样性25-26。钟小仙等27发现RAPD引物能扩增出“杂交狼尾草”的特异指纹图谱，为牧草杂交狼尾草品种的保护提供了分子鉴定基础。杨清辉等28、钟小仙等29分别将RAPD技术应用于狼尾草的杂种鉴定上，发现双亲间的特征带可以对杂交或自交后代作出鉴定，而且RAPD技术可为美洲狼尾草亲本材料及其杂交种鉴定的纯度分析提供了一种快速的、准确的检测手段。由于核糖体DNA中包含了进化速度不等的编码区、非编码转录区和非转录区，而ITS是核糖体DNA中介于ITS1以及ITS2的非编码转录间隔区，进化速度快且片段长度不大，加上ITS序列变化与进化距离相适应，该技术已成为在序列水平上探讨科内属间及属下种间关系十分有效的手段30-32，陈志彤33等通过对狼尾草ITS扩增片段进行序列上的分析，结果显示，克隆的目的片段长度为573586bp，聚类结果总体能较好地反应狼尾草属牧草之间的遗传距离，其中杂交狼尾草和细茎杂交狼尾草可能存在着同种异名的现象。Stuwig34对133份狼尾草属牧草采用AFLP技术用引物组合法MluI/MseI对狼尾草属（象草）材料进行基因分型组。结果所得条带的聚类分析表明，样品可分为五大、五小规模集群。但是AFLP技术的数据并不能清晰划分样本界限，无论是归因于高层次的遗传一致性的存在，还是非最佳引物或不良种质管理做法。2 研究背景及目的意义2.1 研究背景传统耗粮型畜牧业的发展对粮食有很大的依赖性，一些畜牧业发达国家大多以大量粮食作为基础。我国粮食产量虽然位居世界前列，但由于人口众多，人均粮食占有量仅和世界平均水平持平，远低于欧美等发达国家，若将大量粮食用作饲料粮，必然会造成人畜争粮的紧张局面。饲料粮短缺是我国粮食安全问题的根本问题，而非口粮安全问题。在我国粮食总需求中，饲料粮耗费量已占到我国每年粮食总产量的1/3以上，预计到2020年将达到39%。显然，仅靠18亿亩的耕地以粮养畜来解决13亿人口的吃饭问题是行不通的。而且随着经济发展，人们生活水平逐步提高，对肉、奶等畜产品的需求越来越多。因此，通过种草养畜，发展节粮型畜牧业才能尽快实行畜牧业内部结构的合理调整，改善人民的膳食结构，从根本上解决人畜争粮的矛盾。现阶段我国草原畜牧业发展面临的问题是：第一，我国北方天然草原退化严重，载畜量大幅度降低，仅靠天然草场已无法满足家畜生产的需要。发展人工种草是解决这一发展颓势的基本出路。第二，广大农区依靠秸秆养畜，饲养效率低而无法满足质量效益型畜牧业的发展要求，不能适应国际化的市场竞争。所以，种草养畜尤其是用优质牧草来饲养家畜对我国畜牧业发展具有重要意义35-36。狼尾草是一种优质高产牧草，它喜温暖、湿润的气候条件，对土壤要求不严，生性强健，萌发力强，容易栽培，对水肥要求不高，基本上无病虫害，但在高水肥条件下，产量优势可以更充分发挥。以杂交狼尾草为例，每公顷鲜草单产9万12万kg，在孕穗期干物质粗蛋白含量为15.4%，粗纤维35%，无氮浸出物26.4%，粗灰分7.1%，另含丰富的维生素和微量元素37。狼尾草作为优良的牧草品种，已被广泛地引种利用，并培育出不少新的狼尾草品种，这些培育的品种各自具有特点，同时有关狼尾草被逐渐应用于畜牧业生产上的报道也逐渐增多。2.2 目的意义早在1980年，江苏省农科院就从国内外搜集作为牧草用途的狼尾草种类，共收到7个种，近80份材料，其中美洲狼尾草50份、象草8份、西非狼尾草（P. clandistum）2份、东方狼尾草（P. oriental）3份、多穗狼尾草（P. longissimum）6份、白草（P. flaccidum）1份、美洲狼尾草与象草的杂交种10余份38。目前我国通过品种审定的狼尾草品种共有14种39-40。另外，还有不少暂未登记的地方品种41。狼尾草以较高生物产量和木质素含量，较低的纤维素含量等优势，作为一种新型能源植物，受到越来越多的关注42-43。近年来，利用分子标记对狼尾草属牧草遗传多样性方面的研究已有报道，但仅RAPD、AFLP、ISSR标记在狼尾草属牧草上应用，存在检测手段较单一和稳定性不足的问题44。在生产实践中，丰富狼尾草属牧草的检测手段成为客观需求。EST-SSR是一种基于SSR的新型标记，能够准确地检测出品种间的亲缘关系，并且开发引物比较廉价、通用性好、条带清楚、容易统计等优点。如今EST-SSR已在植物遗传多样性分析、遗传图谱构建及标记辅助育种中广泛应用。但该技术在狼尾草属牧草研究方面尤其是指纹图谱构建上还未见报道，鉴于此，本研究采用多态性丰富的EST-SSR标记，对6份狼尾草属牧草进行DNA指纹图谱构建，将对狼尾草资源的充分利用、品种鉴定与品种保护等具有重要的意义。3 研究的内容与方法3.1 研究的内容采用EST-SSR分子标记对狼尾草属6个品种进行DNA指纹图谱构建。3.2 技术路线材料收集及种植DNA提取 EST-SSR标记分析指纹图谱构建3.3 材料方法3.3.1 植物材料用于DNA指纹图谱构建的狼尾草属6种材料，分别为红色狼尾草、矮象草、皇竹草、桂牧1号、宁杂3号、台畜2号。3.3.2 狼尾草EST-SSR的来源和引物设计从NCBI数据库（/）中下载狼尾草EST序列，将FASTA格式的EST提交到网上的“简单序列识别工具”（SSRIT）工具（/db/markers/ssrtool）识别SSR，设定识别标准为重复序列的长度大于20bp。用“Primer 3”软件（/primer3/） 设计SSR侧翼区域引物。为提高引物扩增的特异性，设定引物设计的原则为GC含量为40%到60%，最佳为50%；退火温度为55到63，最佳为55；引物长度为18bp到25bp，最佳为20bp。其它参数采用默认值，引物设计时先用中括号将SSR位点括起来，以确保产物序列中包括SSR位点。引物命名为“pems*”（pe是狼尾草拉丁文名第一个单词的前两个字母，ms是微卫星（microsatellite）缩写）。3.3.3 DNA 提取及EST-SSR PCR反应取生长良好的狼尾草属6种材料幼嫩叶片，采用植物基因组DNA提取试剂盒DNeasy Plant Mini kit (Qigene公司，美国)提取DNA。提取的DNA用0.8%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计进行纯度和浓度的检测，并将样品稀释成20 ng/L后在4下保存备用。若备用时间过长，就将DNA样品置于-20冰箱保存。待开始实验时，将各个DNA样品取出一部分稀释至20ng/L，放于4冰箱保存并使用。PCR扩增在BIO-RAD公司的iCycler PCR扩增仪上进行，具体反应程序为：94预变性5min；94变性1min，52-58退火1min，72延伸1.5min，共35个循环；最后72延伸10min，4保存。3.3.4 电泳分析检测EST-SSR PCR扩增产物用6%变性聚丙烯酰胺胶（丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺 =191，7.5 mol/L尿素，1TBE缓冲液)进行检测。样品点样5 L，以博瑞克公司的D2000 Marker为对照，400 V电压下电泳140 min，银染法显影，照相保存。4 预期结果通过EST-SSR分子标记能够构建出狼尾草属6种材料的多态性DNA指纹图谱。5 试验进度安排2014.4 材料收集和种植2014.6 供试材料 DNA提取2014.6-7 供试材料EST-SSR标记鉴定分析2014.7-9 供试材料DNA指纹图谱构建2014.10-2015.2 论文写作参考文献1 武菊英, 滕文军, 袁小环, 等. 几种狼尾草观赏植物在北京地区的生长特性J. 武汉植物学研究, 2009, 27(6): 661-666.2 陈志彤, 何水林, 黄毅斌. 狼尾草属牧草研究进展J. 草地学报, 2010, 18(5): 740-748.3 袁小环, 滕文军, 武菊英. 新型地被植物-观赏草C. 2006.4 徐柱. 世界禾草属志-计算机自动分类描述M. 北京市: 中国农业科技出版社. 1999. 548-557.5 卓坤水, 苏水金, 杜仲清, 等. 闽引象草(Pennisetum purpureum schum MIN-YnD)的选育J. 热带作物学报, 2009, 30(8): 1196-1200.6 郑建铃. 红色狼尾草的离体培养及产业化生产J. 防护林科技, 2013, 120(9): 10-12.7 赖志强, 黄敏瑞, 周解, 等. 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