水稻纹枯病的综合治理研究.doc

山东农业大学本科毕业生毕业论文 学院：植物保护学院 班级：09级植检1班 学号：20095017 水稻纹枯病的综合治理研究Study on the integrated management of rice sheath blight作者：温东东 指导老师：刘爱新Author: Dongdong Wen The instructor: AiXin liu目录中文摘要1关键词1Abstract1Keywords11. 前言31.1 水稻纹枯病的研究进展31.1.1 水稻纹枯病的病原及融合群31.1.2 水稻纹枯病的危害、防治及其存在问题31.1.2.1 抗病品种的选育31.1.2.2 生物防治41.1.2.3 化学防治41.1.3 水稻纹枯病菌（R.solani AG1-IA）的群体遗传学研究41.1.3.1 水稻纹枯病菌的遗传特性41.1.3.2 影响水稻纹枯病菌群体遗传结构变化的因素5（1） 随机遗传漂变5（2）基因流动5（3） 突变5（4） 重组5（5） 选择52 研究内容62.1 材料与方法62.1.1 材料62.1.1.1 菌株材料62.1.1.2 植物材料62.1.1.3 其它材料62.2 方法62.2.1 纹枯病菌分离培养62.2.2 纹枯病病菌致病力测定62.2.3 菌丝融合群测定72.2.4 供试菌株基因组DNA的提取72.2.5 AG1-IA融合群SSR标记体系的建立及遗传多样性研究82.2.5.1 微卫星标记所需引物92.2.5.2 SSR-PCR扩增反应体系102.2.5.3 SSR-PCR反应程序102.2.5.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳11（1） 所需试剂及配制11（2） 电泳11（3） 银染步骤122.2.6 数据统计123 结果与分析133.1不同地区水稻纹枯病菌融合群鉴定133.1.1 水稻纹枯病菌菌丝融合鉴定133.1.2 5.8S rDNA-ITS序列分析154 讨论174.1 关于R. solani AG1-IA水稻分离物的遗传分化174.2 菌株致病力与SSR多态性的关系17参考文献19致谢. . 21DirectoryChinese abstract1Chinese keywords1Abstract1Keywords11.Preface31.1 Research progress of rice sheath blight31.1.1 The pathogen of rice sheath blight and fusion group31.1.2 Harm, rice sheath blight and its control problems31.1.2.1 Breeding resistant varieties31.1.2.2 Biocontrol41.1.2.3 Chemical control41.1.3 Rhizoctonia solani (R.solani AG1-IA) Population Genetics41.1.3.1 Genetic characteristics of Rhizoctonia solani41.1.3.2 Rhizoctonia solani influence changes in the factors of population genetic structure5（1）Random genetic drift5（2）Gene flow5（3）Mutation5（4）Restructuring5（5）Choose52 Research62.1 Materials and Methods62.1.1 Material62.1.1.1 Strain material62.1.1.2 Plant material62.1.1.3 Other materials62.2 Method62.2.1 Rhizoctonia solani isolated and cultured62.2.2 Sheath blight pathogen virulence determination62.2.3 Determination of anastomosis group72.2.4 Strains tested genomic DNA extraction72.2.5 AG1-IA fusion groups Establishment of SSR markers and genetic diversity of82.2.5.1 Microsatellite marker primers required92.2.5.2 SSR-PCR amplification reaction102.2.5.3 SSR-PCR reaction procedure102.2.5.4 Polyacrylamide gel electrophoresis11（1） And preparation of the necessary reagents11（2） Electrophoresis11（3） Silver staining procedure122.2.6 Statistics123 Results and analysis133.1Different regions of Rhizoctonia solani anastomosis group identification133.1.1 Identification of Rhizoctonia solani anastomosis133.1.2 5.8S rDNA-ITS sequence analysis154 Discuss17 4.1 About R. solani AG1-IA rice isolate genetic differentiation17 4.2 Strain virulence and SSR polymorphism17References19Acknowledgements. .2119中文摘要立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）寄主范围广泛，可侵染危害250多种植物。R. solani是一个复合种，该种至少包括14个融合群，每个融合群又可分为不同的融合亚群。R. solani AG1-IA属于AG1融合群的IA亚群，该真菌可危害玉米、水稻和大豆等多种植物，在水稻形成典型的纹枯病症状，是水稻纹枯病的优势致病类群。R. solani AG1-IA群体结构组成和变化对该类病害的发生和流行起着非常重要的作用。本研究中，我们利用SSR分子标记，对我国山东和广东4个主要产稻区的61个R. solani AG1-IA分离物的群体遗传结构进行了分析, 旨在明确AG1-IA群体在不同地区间的遗传多样性组成及演化动态，希望为进一步制定水稻纹枯病的综合治理措施提供理论依据。1. 纹枯病菌采集、分离及融合群确定从山东临沂、东营和济阳采集标本，经分离培养，通过菌丝融合测定、ITS序列测定等鉴定所属的融合群，将51株鉴定为AG1-IA的水稻分离物用于本研究，还有10株来自广东的菌株。2 R. solani AG1-IA水稻分离物遗传多样性分析利用10对SSR引物对山东3个水稻产区的51株AG1-IA水稻分离物和10株广州分离物进行SSR遗传多样性分析，共检测到32条多态性条带，每对引物能扩增出25条多态性条带。采用UPMGA法进行SSR聚类分析结果表明，61个分离物在0.50到1.00遗传相似系数范围内，被分为不同聚类组。来自不同地区的水稻纹枯病菌，多以地理来源聚为一类，表明SSR分组与菌株的地理来源有一定的相关性。Neis遗传多样性指数在广东省达到最大，为0.4228，Shannons指数在广东省达到最高，为0.7309，表明来自广东省的水稻纹枯病菌具有复杂的遗传结构。其中，来自广东和济阳的菌株遗传距离最远，临沂和济阳的菌株遗传距离最近。对群体的遗传分化进行分析，群体内和群体间都存在一定的遗传分化，群体间的变异约占总变异的17.4%，群体内的变异占总变异的82.6%，因此，遗传变异主要发生在群体内。关键词：水稻纹枯病；SSR；遗传多样性Abstract Rhizoctonia solani (Rhizoctonia solani) wide host range and can infect endanger more than 250 kinds of plants. R. solani is a species complex, which includes at least 14 species of fusion groups, each group can be divided into different fusion fusion subsets. R. solani AG1-IA IA belong AG1 fusion group subsets, the fungus can be hazardous to corn, rice and soybeans and other plants, in the form of a typical rice sheath blight symptoms are the advantages of rice sheath blight pathogenicity groups. R. solani AG1-IA changes in population structure and composition of the class of the incidence and prevalence of disease plays a very important role. In this study, we used SSR markers on Chinas Shandong and Guangdong four major producing rice for 61 R. solani AG1-IA isolates were analyzed genetic structure, aimed at clarifying AG1-IA groups in different regions between the composition and evolution of the dynamics of genetic diversity, hope for the further development of rice sheath blight comprehensive measures provide a theoretical basis.1 R. solani collection, separation and fusion group identified From Linyi, Shandong Dongying and Jiyang collect specimens, the isolation and culture, through hyphal fusion determination, ITS sequencing and other identification of an integration group, the 51 identified as AG1-IA rice isolates used in this study, as well as 10 strains from Guangdong.2 R. solani AG1-IA rice genetic diversity of isolates The use of 10 pairs of SSR primers Shandong three rice-producing areas 51 AG1-IA rice isolates and 10 Guangzhou isolates SSR analysis of genetic diversity were detected 32 polymorphic bands per primer pair can expand increase of 2 to 5 polymorphic bands. SSR clustering method using UPMGA analysis showed that 61 isolates in the 0.50 to 1.00 range of genetic similarity coefficient, is divided into different cluster groups. From different regions of Rhizoctonia solani, and more to the geographical origin clustered together, indicating that the SSR grouping and geographical origin of strains have some relevance.Neis genetic diversity index in Guangdong province reaches the maximum 0.4228, Shannons index reached the highest in Guangdong Province, is 0.7309, indicating that from Guangdong Province Rhizoctonia solani has a complex genetic structure. Among them, from Guangdong and Jiyang genetic distances strains, strains Jiyang Linyi and genetic distance.On the genetic differentiation were analyzed within the group and between groups, there are certain genetic differentiation among populations variance accounted for 17.4% of the total variance, variation within populations 82.6% of the total variance, so genetic variation occurs mainly in within the group.Key words: rice sheath blight; SSR; genetic diversity1. 前言1.1 水稻纹枯病的研究进展水稻纹枯病（Rhizoctonia solani Khn）是我国各大稻区主要病害之一，近年已上升为水稻三大病害（纹枯病、稻瘟病、白叶枯病）之首1。该病害导致水稻结实率下降，千粒重降低，水稻减产最高可达50%2。在我国，此病最早于1934年由魏景超报道。20世纪70年代以来，随着氮肥施用量的增加，矮秆、多蘖和密植等栽培技术的推广，水稻纹枯病的发展蔓延加快，危害也日益严重。20世纪90年代中期对我国南方稻田的调查结果表明，水稻纹枯病的发病面积是稻瘟病的2.07倍，在我国南方稻区的许多地方纹枯病已成为水稻的第一大病害。成为水稻稳产、高产的重要障碍。因此，如何有效地控制水稻病害的发生与危害，保障水稻稳产高产在土地面积不断减少以及人口数量却不断增多的今天显得尤为重要。1.1.1 水稻纹枯病的病原及融合群引起水稻纹枯病的病原菌有性态为Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk称瓜亡革菌，属担子菌亚门真菌。在田间一般只表现无性世代3；Julian et al., 1998）。无性态Rhizoctonia solani Khn称立枯丝核菌，属半知菌亚门真菌4。致病的主要菌丝融合群是AG-1占95%以上，其次是AG-4和AG-Bb(双核丝核菌)。典型的水稻纹枯病菌属于AG-1 IA亚群。据Lanoiselet等（2007）报道，至少有三种不同的Rhizoctonia spp.可导致水稻产生类似纹枯病的症状，但对比分析发现，只有R. solani可形成典型的纹枯病症状。1.1.2 水稻纹枯病的危害、防治及其存在问题水稻纹枯病是遍及全球的水稻病害5。该病是1905年在日本被佐佐木忠次郎博士首次发现，随后在菲律宾和斯里兰卡等地也相继报道了此病，20世纪50年代前的一段时期，此病曾一度被称为“东方病害”，60年代后，对此病的报道才陆续见诸于世界各地。对于水稻纹枯病的防治的研究成为目前首要工作。1.1.2.1 抗病品种的选育目前尚未发现高抗或免疫品种，应利用中抗品种加强育种工作。近年来，国内外学者在抗病种质资源筛选、抗病遗传规律、分子标记辅助选择技术和离体组织诱变、体细胞杂交和轮回选择等方面利用生物技术手段来提高水稻抗纹枯病水平的研究己取得很多进展。但是，目前尚没有找到抗水稻纹枯病的理想抗源，故抗病育种进展缓慢，还未能克隆来自水稻的抗纹枯病基因6。冯道荣等（2001）将多个几丁质酶基因和-1、3-葡聚糖酶基因一起转化水稻植株，获得整合有2-4个抗真菌基因的转基因水稻植株，该转基因水稻植株不但增强了对纹枯病的抗性，同时也增强了对稻瘟病的抗性，首次证明了多个几丁质酶基因之间或与-1、3-葡聚糖酶基因之间在水稻中有协同的抑菌作用。1.1.2.2 生物防治 利用拮抗菌生物防治植物病害是当今植病界十分活跃的研究领域之一，并己显示出良好的应用前景。目前已发现许多生防菌能显著地抑制纹枯病菌的生长与繁殖。于艳敏等（2010）发现芽孢杆菌R13对水稻纹枯病病原菌有一定的抑制作用，抑菌率为67.8%。王国平等（2009）利用红豆杉中一种新内生真菌紫杉木霉Trichoderma taxi 菌株ZJUF0986与水稻纹枯病菌对峙培养，结果表明，该内生真菌能使纹枯病菌菌丝断裂或其内含物降解直至死亡，并且产生的活性代谢产物也能强烈抑制纹枯病菌菌丝的生长，显著降低病原菌的菌核萌发率。安徽省农科院植保所研制出新型农药多粘芽孢杆菌与井冈霉素复配物“克纹灵”，同时获得国家发明专利，该农药具有价格低、防效高、无污染、无残留等优点，为我国生物防治水稻纹枯病开拓了一条新路。目前对拮抗菌的生防机理还不是十分明确，对如何提高拮抗菌在大田条件下的防治效果的许多关键技术问题还没有解决，一些在室内测定实验中表现出强烈拮抗能力的菌体，在实际应用中却未能发挥有效的拮抗作用11。 1.1.2.3 化学防治 利用化学农药防治水稻纹枯病是目前最主要的防治措施6。近年来，国内外使用的抗菌素农药（如有效霉素和井冈霉素等）以及有机砷化合物中的甲基砷酸锌、甲基砷酸钙、甲基砷酸铁和甲基硫化物等，不但能有效抑制菌丝生长、侵染、防治病斑扩展，而且可抑制菌核的形成，具有良好的防治效果5。但药剂防治有一定的局限性，只能杀死裸露于寄主体表的病原菌体，对沉在水中或土中的病原菌核却不起作用，并且污染环境，增加生产成本，长期单一使用某一药剂还会导致病原菌产生抗药性。1.1.3 水稻纹枯病菌（R.solani AG1-IA）的群体遗传学研究1.1.3.1 水稻纹枯病菌的遗传特性水稻纹枯病菌的遗传结构十分复杂，不同菌株间存在丰富的遗传多样性，对环境的适应能力很强，该病菌不同菌株间或同一菌丝体的细胞间，经常不断的发生细胞融合，进行以核为单位的基因交换，因此，融合后的菌丝体为具有多核的异核体，这种异核现象能增强病菌的致病性7。据推测，菌丝融合是一种遗传因子控制的现象3，当具有亲和力的两根菌丝接触后，接触处细胞壁溶解，便合二为一。因而该病菌的菌丝体常常是多核的，而且它在一般条件下很难产生有性孢子，孢子的生命力也十分弱（Rosewich et al., 1999）。1.1.3.2 影响水稻纹枯病菌群体遗传结构变化的因素（1） 随机遗传漂变随机遗传漂变是指病原菌小群体内，由于抽样误差造成群体中等位基因频率，特别是基因型组合频率显著下降的过程。群体越小，随机漂变对群体等位基因频率的影响越大。随机遗传漂变的效应是促进群体分化，包括建立者效应和瓶颈效应。建立者效应是指某一处群体中少数几个个体迁移到另一个地方，繁殖形成一个群体。这个群体的遗传特性和基因频率可能和原群体差异很大。瓶颈效应是指少数个体在自然或人工的影响下存活下来，以后由这些个体繁衍成一个群体，这个群体的某个基因的频率可能和原群体大不相同。水稻纹枯病在20世纪50年代前曾一度被称为“东方病害”，60年代后，对此病的报道才陆续见诸于世界各地，并且形成了区域间病菌群体整体上存在大量变异的现象。由此可见随机遗传漂变在该病原菌群体进化中的作用显而易见的。（2）基因流动基因流动（Andrivon et al., 1992; Milgroom et al., 1995）是指基因在生物群体间的移动，这种移动可以是单向的，也可以是双向的。基因流动的方式主要包括真菌个体在群体间的移动和配子运动等。（3） 突变突变是导致植物病原真菌群体遗传多样性的基本因素。田间植物病原真菌群体中菌株的自发突变频率是很低的。由于很多突变体在田间不能存活，检测未存活的菌株还缺少有效方法，因此田间真菌的突变频率不易准确估测，有关R. solani AG1-IA突变频率的报道还很少。（4） 重组生物个体间通过重组（Brasier, 1988）可以快速形成新的基因组合，提高植物病原真菌群体适应环境改变的能力。大多数半知菌都可以通过准性生殖（菌丝融合）实现重组，从而具有一种快速形成新的基因组合的机制。立枯丝核菌在自然条件下很难产生担孢子，但是许多研究人员已经证实在大田条件下确实可以产生担孢子，只是生命力很脆弱，Rosewich et al.（1999）已经证实担孢子能够影响病原菌在田间的群体遗传结构。（5） 选择选择（McDonald, 1997）是导致群体结构发生巨大变化的重要因素。在自然条件和农业生态条件下，病原菌群体受多种多样的选择压力的作用。寄主的基因型以及环境条件对病原真菌的群体结构有显著影响，尤其是对专性寄生菌的作用更加明显。R. solani AG1-IA并非专性寄生菌，但是目前许多资料都证实了其群体结构也受到寄主的影响以及具有明显的地理分化现象。2 研究内容2.1 材料与方法2.1.1 材料2.1.1.1 菌株材料水稻纹枯病菌：于8-9月份纹枯病发生盛期，从山东临沂、济宁、济阳和东营等地采集水稻纹枯病标本，常规分离法进行分离培养，经菌落形态观察、菌丝融合测定、ITS序列比对等分析，将鉴定为R. solani AG1-IA的菌株保存，用于本实验。来自福建的水稻纹枯病菌株由华南农业大学周而勋老师提供。2.1.1.2 植物材料水稻材料：选用中等抗纹枯病的水稻品种农大108，购于山东农业大学。2.1.1.3 其它材料PDA培养基，PDB培养基，LA培养基，LB培养基，WA培养基2.2 方法2.2.1 纹枯病菌分离培养采用改进的组织分离法，将各地采集的水稻纹枯病干制样本，自来水冲洗干净，培养皿25恒温保湿12-24h，待组织表面开始出现白色菌丝时，剪取带菌丝的组织块（约5 mm5mm）放置在灭菌滤纸上干燥10min，然后放入提前1h滴有链霉素的水琼脂（WA）平板上，25恒温黑暗培养12-24h，组织块周围就会长出具有丝核菌特征的菌落，菌落达到d=2cm大小时，从菌落边缘切取菌块在WA培养基上进行单菌丝纯化。分离用的培养基是水琼胶，自然pH。水琼胶倒平板后，翻转平板放入温箱培养72h，除去表面水层，然后在平板上等距离滴加5滴链霉素溶液（浓度为20mg/ml）。分离的菌株经过单菌丝尖端移植，纯化，在显微镜下观察菌丝形态，将具有典型丝核菌特征的分离物保存在PDA试管斜面上，在4冰箱中保存备用。2.2.2 纹枯病病菌致病力测定各菌株致病力测定参照陈涛等（2010）的方法。水稻种子用次氯酸钠表面消毒后，分别播种在装有灭菌土的花盆内，温室内生长，至45叶期时，取倒二叶和倒三叶，75%酒精叶片表面消毒后，截取中间部位12cm长的叶段，放在装有湿纱布的瓷盘内。待测菌株于25，黑暗培养3d，用5mm的打孔器打取菌圆饼，接种到叶片中部，用保鲜膜覆盖保湿，放置在25，光照黑暗交替（12h/12h）的生化培养箱内，1d后，用挑针除去菌圆饼，3d后测量并记录病斑长度，计算病斑长度与叶片长度的比值，并以该比值作为菌株致病力的评价标准。每菌株接种5张叶片，计算5张叶片的平均值，接种PDA培养基为空白对照。用DPS 9.50软件对所测数据进行统计分析。2.2.3 菌丝融合群测定根据培养性状，将确定为Rhizoctonia的菌株采用玻片对峙培养法（Kronland et al., 1988）进一步进行融合群测定。首先将保存的菌株在PDA平板上于25恒温黑暗培养2d后，分别从标准菌株和待测菌株的菌落边缘打取5mm大小的菌圆饼，倒置于载玻片上，两菌株相距1cm, 并将载玻片放置在含有湿润滤纸的培养皿内，25黑暗培养12h后，培养观察各菌株与标准菌株菌丝融合情况，按照完全或不完全融合划分类群。以已经确定为AG1-IA的菌株LY1-3-1作为标准菌株。菌丝融合情况参照Sneh（1991）的融合鉴定标准分为3种类型：（1）完全融合：接触细胞的细胞壁溶解，细胞质融合，互有引诱现象。（2）不完全融合：接触细胞间细胞壁溶解，某一细胞细胞质流入另一细胞内，且造成双方融合及其邻近几个细胞发生畸形，原生质减少或消失，有杀死反应，一方引诱另一方。（3）接触融合：接触细胞壁不溶解，接触的两细胞无异常反应，各自菌丝按原来方向继续生长。属于前两种情况的菌丝融合方式视为相同融合群。2.2.4 供试菌株基因组DNA的提取所有供试菌株首先移植到PDA平板上，在25生化培养箱内黑暗培养2d后，用5mm打孔器取菌圆饼置于含100ml的PDB液体培养基的三角瓶内，在25，140rpm的恒温摇床上振荡培养5d，过滤菌丝，用滤纸将菌丝吸干，采用CTAB法提取基因组DNA，用于PCR扩增。提取所需试剂：（1）CTAB提取液: CTAB(g) 4g 1M Tris-Hcl（pH=8.0） 20ml 0.5M EDTA (pH=8.0) 8ml Nacl(g) 16.364g用去离子水补足到200ml，灭菌备用。（2）氯仿异戊醇：按体积比24:1混合。（3）饱和酚氯仿异戊醇：按体积比25:24:1混合。（4）TE缓冲液： 1M Tris-Hcl（pH=8.0） 5ml 0.5M EDTA（pH=8.0） 1ml 用去离子水补足到500ml，灭菌备用。 （5）50TAE缓冲液 基因组DNA提取步骤：（1） 取0.2g左右的菌丝在液氮中迅速研磨成干粉状。（2） 把粉末转入1.5ml离心管中，加入600mlCTAB提取液（65提前水浴5min），上下颠倒数次使之混匀。（3） 65水浴保温4050min,每10min轻轻颠倒混匀一次。（4） 冷却至室温，加入等体积的氯仿异戊醇（24:1）轻轻混匀10min。（5） 离心（10000rpm，10min）,去沉淀，将上清液转入另一离心管。（6） 加入等体积异丙醇（-20），轻轻颠倒混匀，室温放置1020min。（7） 离心去上清（10000rpm，10min）。（8） 加入200l 70%乙醇洗涤2次，去盐控干。（9） 加入400l TE缓冲液，溶解沉淀，再加入2l RNase A，37水浴40min。（10） 用等体积饱和酚氯仿异戊醇（25:24:1）抽提2次，离心（10000rpm，10min），取上清液，转入另一离心管中。（11）等体积氯仿异戊醇（24:1）抽提，离心（10000rpm，10min），将上清液转入另一离心管中。（12）上清中加入2体积无水乙醇，混匀，-20冰箱中放置30min。（13）离心（10000rpm，5min），沉淀DNA。（14）沉淀用75%乙醇（-20）洗涤23次，37保温箱中干燥后融于100l TE缓冲液中，4备用。将提取的DNA用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，紫外灯下观察所提取DNA的完整性和纯度，将提取成功的菌株DNA溶液保存于-20冰箱中。2.2.5 AG1-IA融合群SSR标记体系的建立及遗传多样性研究将分离得到的玉米、水稻纹枯病菌AG1-IA融合群菌株进行遗传多样性分析，只要从两个方面进行：（1）分别对来自不同地区的AG1-IA融合群进行SSR分析，目的是为了探讨来自玉米和水稻寄主上纹枯病菌的遗传分化与地理位置之间的关系；（2）探讨纹枯病菌的致病力的差异与遗传分化的相关性。2.2.5.1 微卫星标记所需引物SSR-PCR反应所需的10对引物来自Zala et al.（2008）。由上海生工生物技术有限公司合成。引物的信息情况如表1所示。表1微卫星位点引物信息 Table.1 The information of microsatellite loci引物名称重复类型产物长度(bp)退火温度()引物序列(53)TC01(CTG)7104-14350F: CATGCTCATTTGCGACATCTR: AACAACAGCAAGGGCCATCTC02(TGC)11184-19350F: GATGGCCCTTGCTGTTGTTR: CGTTTACGCATTCTGGCTTTTC03(CAG)5 + n + (CAG)4+ n + (CAG)4262-30150F: CTCATTTGCGACATTTGAGCR: TACCCATTCTGGCTTTTTGCTC05(GATGAA)3239-26650F: TGTCCAACAAGACAGTTCGR: AACCGAGCCCTTAGCTCTTCTC06(CAG)11220-23250F: CAGAGATACGTCCAGCAACGR: ATGCTCATTTGCGACATCTGTC07(GAAGAG)3+n+ (GAA)413915450F: AGAATGAGATGCGGAATGTGR: TCTTGGGCTAACTCTTGTTGGTC10(AGC)914717450F:AGCCTCATCAGATATGACGTGAR: TTGGGGTTGTTGATACTGAGGTC11(CTTTT)6 (ATTTT)319922450F: TGCAGAACCATAGGACTGGR:TGACAGACAGGACAGCTACTGGTC12(CT)5TTCCCTT(CTC)414515750F: CCACACAGTGGCTAAAACCTCR: CACCTTGTTCGCTTTATTGGTC13(AGAGGA)316217450F: AACGCATCGACTTCTGGTTCR: GAGTCCCGTAAACCCATTTG2.2.5.2 SSR-PCR扩增反应体系 表2扩增反应体系（20l体系）Table.2The reaction system of PCR (20l)2Power Taq PCR MasterMix5lForward primer0.5lReverse primer0.5lDNA模板1lddH2O8lTotal15l2.2.5.3 SSR-PCR反应程序参考Zala et al.（2008）的扩增程序进行PCR扩增，循环条件为：96，2.5min；96，30s，50，30s，72，30s，30个循环；72，5min；4保存备用。2.2.5.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（1） 所需试剂及配制30%Acr-Bis： 丙烯酰胺（Acr）： 29.0g 亚甲双丙烯酰胺（Bis）： 1.0g加去离子水，定容至100ml，过滤，棕色瓶贮存于45TBE： Tris 碱： 54g 硼酸： 27.5g 0.5M EDTA (pH=8.0)： 20ml去离子水定容至1L, 高压灭菌备用。10%过硫酸铵（AP）；N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）；10%乙醇；0.2%AgNO3（m/v）；2%NaOH（m/v）；10%冰乙酸；甲醛（2） 电泳（a）洗板：用洗涤液反复擦洗四块玻璃板，再分别用自来水和去离子水冲洗干净，最后再用无水乙醇将玻璃板擦洗两次，晾干。（b）浓度为 9%聚丙烯酰胺凝胶的制备配胶（20ml）：30%Acr-Bis 6ml 5TBE 4ml 10%AP 200l TEMED 15l (视外界环境而定)去离子水 9.88ml（c）夹板：将架子放在水平桌面上，分别将长玻璃板和短玻璃板固定在架子上，注意调整好，防止漏胶。（d）灌胶：将配制好的9%的胶用移液枪加到夹板内，边加边轻轻敲打玻璃板，以防止产生气泡，加满后将梳子完全插入，凝固30 min，注意避光免产生气泡。（e）预电泳：先用微量移液枪将留有气泡的点样孔的气泡驱赶，然后插上电源，调整80V预电泳30 min。（f）点样：用移液枪取2l PCR产物加到加样孔中。（g）电泳：100V电泳23h，结束后，取下凝胶进行染色。（3） 银染步骤（a）固定：把经冷却的胶板置于盛有200ml，10%乙醇的大培养皿中，摇床振荡1520min。（b）洗胶：把经固定液处理的胶放入含200ml去离子水的大培养皿中，清洗2次，每次24min。（c）染色：将胶置于含有 200ml，0.2% AgNO3的大培养皿中，摇床振荡20min。（d）洗胶：用去离子水清洗一次，动作要快，时间控制在5s以内。（e）显色：在大培养皿中加入100ml 2% NaOH和400l 甲醛，混匀后放入胶，染色时间自己控制，直至出现清晰条带为止。（f）终止：在大培养皿加入100ml ，10% 冰乙酸，终止反应，最后再用去离子水清洗2次。（g）条带统计。2.2.6 数据统计根据PCR扩增产物在凝胶上的位置，采用1、0二元数据计数法，有带记为1，无带记为0。应用NTSYS-PC 2.1软件（Rohlf, 2000）对种群进行UPGMA聚类分析。按照电泳图谱中同一位置上DNA条带进行统计，记录清晰、稳定出现的扩增带，根据分子量大小对扩增结果读带，以二倍体形式记录（De Assis et al., 2008），从大到小依次为A、B、C等，利用POPGENE 1.32 （Yeh et al., 1997）软件进行遗传多样性分析。分析时，首先假设R. solani AG-1 IA群体为二倍体（De Assis et al., 2008），在假定种群处于Hardy-Weinberg平衡状态下，对全部种群和各单个种群分别进行遗传参数分析，分别计算多态位点百分率（P）、观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、基因多样性指数（Neis）、Shannon信息指数（I）、表观杂合度Ho和预期杂合度He、种群内近交系数FIS 、总近交系数FIT、种群间分化系数FST、Neis遗传距离（D）和遗传相似度（I）。3 结果与分析3.1不同地区水稻纹枯病菌融合群鉴定3.1.1 水稻纹枯病菌菌丝融合鉴定从山东临沂、济宁、济阳和东营等采集水稻纹枯病病菌，经组织分离法共得到135株纹枯菌，其中初步确定为AG1-IA融合群的共有110株，其余的为Rhizoctonia sp. 从中选取61株用于下面实验，菌株的详细信息如表3。对各分离物在PDA平板培养，依据菌落形态、菌核形态和颜色及菌核形成快慢等特点，可将丝核菌分为不同类型。其中R. solani AG1-IA在7-10d即可形成褐色菌核，菌核球形或不规则形状，散生或集结成菌核块（图1）。将初步确定为AG1-IA融合群的菌株与标准菌株对峙培养，测定菌丝融合情况。结果发现，同一类群内菌丝可以发生完全或不完全融合（图2A-B），不同类群间菌丝不存在相互吸引现象，菌丝接触点也不能发生菌丝融合。表3 水稻纹枯病菌供试菌株及来源Table.3 Origin of tested isolates Rhizoctonia solani on rice菌株来源菌株来源RLY15-5山东省临沂市B272广东省新兴县RLY14-4山东省临沂市B249广东省遂溪县RLY15-2山东省临沂市B240广东省茂名市RLY14-2山东省临沂市B297广东省陆丰县RLY1-4山东省临沂市B255广东省遂溪县RLY11-3山东省临沂市GD118广东省珠海市RLY17-2山东省临沂市B265广东省从化市RLY8-4山东省临沂市B275广东省台山市RLY7-3山东省临沂市B287广东省江门市RLY7-1山东省临沂市B250广东省遂溪县RLY11-1山东省临沂市RJY2-4山东省济阳县RLY16-3山东省临沂市RJY1-1山东省济阳县RLY12-1山东省临沂市RJY-20山东省济阳县RLY3-1山东省临沂市RJY23-3山东省济阳县RLY5-1山东省临沂市RJY18-1山东省济阳县RLY10-1山东省临沂市RJY17-5山东省济阳县RLY2-3山东省临沂市RJY19-2山东省济阳县RLY12-3山东省临沂市RJY8-3山东省济阳县RLY9-1山东省临沂市RJY-13山东省济阳县RLY16-2山东省临沂市RJY21-1山东省济阳县RJY15-3山东省济阳县RJY7-1山东省济阳县RJY12-4山东省济阳县RJY14-2山东省济阳县RJY6-2山东省济阳县RJY1-4山东省济阳县RJY-3山东省济阳县RDY-5山东省东营市RDY-8山东省东营市RDY-4山东省东营市RDY-2山东省东营市RDY-23山东省东营市RDY-13山东省东营市RDY-15山东省东营市RDY14-2山东省东营市RDY-20山东省东营市RDY-9山东省东营市RDY-17山东省东营市RDY-11山东省东营市RDY-1山东省东营市RDY24-2山东省东营市图1水稻纹枯病菌形态特征Fig1. Colony characteristics of Rhizoctonia solani AG1-IA on PDA图2 待测水稻纹枯病菌与AG1-IA标准菌株（LY1-3-1）融合群菌株的融合 Fig2. Fusion between the isolates of Rhizoctonia spp.with standard strain3.1.2 5.8S rDNA-ITS序列分析R. solani中存在部分桥梁菌株如AG-BI，这类菌株可与多个融合群发生融合（黄江华等，2002）。为验证融合群测定的准确性，从不同地理来源的水稻纹枯病菌菌株中，随机选择15株作为代表菌株，扩增其5.8S rDNA-ITS序列后测序（Carling et al., 2002; Lehtonen et al., 2008; Budge et al., 2009），与GenBa