脑缺血再灌注损伤后氧化应激对自噬调控机制的研究硕士论.docVIP

上海交通大学医学院2008 级硕士研究生学位论文 脑缺血再灌注损伤后氧化应激对自噬调控机制的研究导师 姓 名：卞留贯 教授研究生 姓 名：王文静学号：1087209099专业：神经外科学答 辩 时 间：2010 年5 月上海交通大学医学院2008 级硕士研究生学位论文 脑缺血再灌注损伤后氧化应激对自噬调控机制的研究导师 姓 名：卞留贯 教授研究生 姓 名：王文静学号：1087209099专业：神经外科学0 究 方 向：脑缺血再灌注损伤 0 键 词：脑缺血再灌注；自噬；氧化应激；Beclin1； LC3；NAC申请学位级别：硕士0 辩 时 间：2010 年5 月 0 养 单 位：上海交通大学医学院附属瑞金医院 基 金 资 助：上海市科委重点课题资助项目 （项目编号：09JC1409700;10JC1410700） 上海市科委生物医药重点课题资助项目 （项目编号：10411954200） 上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期： 年 月 日上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密，在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密。 （请在以上方框内打“”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期： 年 月 日日期： 年 月 日上海交通大学硕士学位论文脑缺血再灌注损伤后氧化应激对自噬调控机制的研究0 要 目的探讨缺血再灌注损伤后早期自噬激活的作用机制及氧化应激 对 早 期 自 噬 变 化 的 调 控 ， 探 讨 抗 氧 化 剂 N- 乙 酰 -L- 半 胱 氨 酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）和自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)在缺血性脑血管疾病方面的应用价值，为缺血性脑血管疾病新的药物治疗提供理论依据。方法 采用线栓法制作小鼠短暂性大脑中动脉闭塞(temporarymiddle cerebral artery occlusion，tMCAO)模型。实验分为假手术组(sham组)、缺血再灌注组（ischemia/reperfusion，I/R组）。后者随机分tMCAO+生理盐水、tMCAO+rapamycin和tMCAO+NAC。tMCAO+rapamycin组于术前20分钟侧脑室立体定向注射rapamycin，tMCAO+NAC组于脑缺血术后立刻腹腔注射NAC，tMCAO组于脑缺血术后立刻腹腔注射同容积生理盐水。在脑缺血60分钟后，分别再灌注1小时，3小时，6小时，12小时，24小时，Western blot检测缺血侧皮质和纹状体自噬相关蛋白LC3 I、LC3II和Beclin 1的表达。利用双氢溴乙啶(Dihydroethidium，DHE)染色检测细胞内ROS水平及对自噬活性的影响，借助荧光显微镜观察NAC或雷帕霉素(Rapamycin)条件下的自噬变化。NAC和Rapamycin分别干预缺血再灌I上海交通大学硕士学位论文注24小时小鼠，脑片2,3,5-氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC)染色观察脑梗塞面积。结果 与假手术组比较，缺血再灌注损伤后1小时Beclin 1开始升高，6小时LC3 II/ LC3 I开始升高。与对照组相比，NAC干预后LC3 II/ LC3 I和Beclin 1表达趋势明显升高。DHE染色结果显示缺血再灌注损伤1小时后即开始出现ROS活性增高，经NAC处理后可被部分抑制。TTC染色提示NAC或rapamycin处理后可减小梗塞面积。结论本结果提示小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后自噬表达上调可能是一种保护机制，氧化应激的激活与自噬表达相互影响，抗氧化剂或自噬诱导剂可以通过激活细胞的自噬途径保护神经细胞，减小脑梗塞面积，减轻缺血神经元的损伤。关键词： 缺血再灌注损伤，氧化应激，自噬，LC3，Beclin 1，NACII上海交通大学硕士学位论文THE REGULATION OF OXIDATIVE STREE ON AUTOPHAGY AFTER CEREBRAL ISCHEMIA REPERFUSION INJURYABSTRACTObjective To discuss the activation of autophagy and changes of early-phase autophagy in which the mechanisms of reactive oxygen species(ROS) involved. Discover the Antioxidant N-acetyl L-cysteine (NAC) or the autophagy inducer rapamycin in ischemic cerebrovascular disease of the application.Methods The temporary focal cerebral ischemia was induced by occlusion of the left middle cerebral artery by applying a modified intraluminal filament technique. Animals were divided into sham group and ischemia/reperfusion group (ischemia / reperfusion, I / R) (+ saline), the latter divided into temporary middle cerebral artery occlusion (tMCAO) group, tMCAO + NAC group and tMCAO + rapamycin group randomly. tMCAO + NAC group was treated by intraperitoneal injection of NAC after MCAO, then rapamycin was injected intracerebroventricular 20 min before MCAO. After 60 minutes in focal cerebral ischemia, the reperfusion was performed at 1, 3, 6, 12 and 24 h. The expression of LC3 I, LC3 II and Beclin 1 in the cortex and striatum after ischemia-reperfusion were determined by immunoblotting analysis at each time point. The level of ROS was detected by staining technique with dihydroethidium (DHE). Effects of antioxidant N-acetyl-L-cysteine (NAC) or rapamycin on antophagy were evaluated using fluorescence microscope. The total infarct volume of slices was determined by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC) staining after 24h reperfusionIII上海交通大学硕士学位论文under the conditions of focal cerebral ischemia and durg adminstrationResults Compared with the sham-operated group, the expression of Beclin1 and LC3 II/ LC3 I was increased at the point of 1h and 6h after focal ischemia reperfusion respectively, while upregulation treated by NAC. The results of DHE staining were that the level of ROS enhanced at 1h after focal ischemia reperfusion, while down regulated after received injections of NAC. According to TTC staining, the treatment with NAC or rapamycin prevented the expansion of the infarct.Conclusion The degree of autophagy and ROS were up-regulated after focal ischemia-reperfusion injury, which may be a kind of protection. Mutual influence happended between activation of oxidative stress and autophagy. Antioxidants or rapamycin possibly increased the expression of autophagy to protect neurons and attenuated ischemic neuron injury.KEY WORDS reperfusion injury, oxidative stress, autophagy, LC3,Beclin 1,NACIV上海交通大学硕士学位论文目 录中文摘要英文摘要缩略语表论文正文第一部分: 脑缺血再灌注损伤后自噬相关蛋白的表达及调控机制引言1材料与方法7实验结果16讨论23参考文献28第二部分：局部脑缺血再灌注损伤后ROS激活及对自噬调控引言31材料与方法36实验结果40讨论53参考文献57附录60致谢71攻读学位期间发表的学术论文目录72V上海交通大学硕士学位论文缩略语表缩略词英文全称中文全称AMPK5-AMP-activated protein kinase5-AMP 激 活性蛋白激酶ATGAutophagy-related gene自 噬 相 关 基因3-MA3-methyladenine三 甲 基 腺 嘌呤BHBcl-2 homologyBcl-2 同源结构域BSABovine serum albumin牛 血 清 白 蛋白CMAChaperone-mediated autophagy分 子 伴 侣 介导的自噬CNSCentral nerve system中 枢 神 经 系统DHEDihydroethidium双氢溴乙啶DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthylenediamine tetraacetic acid,disodium乙 二 胺 四 乙酸二钠EGTAEthyleneglycol-bis(-aminoethyl)-N,N,乙 二 醇 双 (2-N,N-tetraacetic acid氨 基 乙 基 ) 四乙酸HEPESN-2-hydroxyethyl-piperazine-N-2-ethanesulfonicN-2- 羟 乙 基acid哌 嗪 -N-2- 乙磺酸HNE4-hydroxy-2-nonenal4- 羟 基 -2- 丙烯醛JNKC-Jun N-terminal kinasec-Jun 氨基端激酶LC3Microtubule-associated protein1 light chain3微 管 相 关 蛋白轻链 3MAPKMitogen-activated protein kinase丝 裂 原 活 化蛋白激酶NACN-acetylcysteineN- 乙 酰 -L- 半胱氨酸O.D.Optical density光密度VI上海交通大学硕士学位论文PAGEPolyacrylamide gel electrophoresis聚 丙 烯 酰 胺凝胶电泳PBSPhosphate buffered saline磷 酸 盐 缓 冲液PCDProgrammed Cell Death程 序 性 细 胞死亡PI3KClass III phosphatidylinositol 3-kinase 型 磷 脂 酰肌 醇 三 磷 酸激酶PMSFPhenylmethyl sulfony1 fluoride苯 甲 基 磺 酰氟PNPPP-nitrophenyl phosphate对 硝 基 苯 磷酸PVDFPolyvinylidene difluoride聚 偏 二 氟 乙烯膜ROSReactive oxygen species活性氧SDSSodium dodecyl sulfate十 二 烷 基 硫酸钠TEMEDN,N,N,N-tetramethylethylenediamine四 乙 基 乙 二胺tMCAOTemporary middle cerebral artery occlusion短 暂 性 大 脑中动脉闭塞TOR kinaseTarget of rapamycin kinase雷 帕 霉 素 靶点激酶TBITraumatic Brain Injury创 伤 性 脑 损伤TrisTris(hydroxymethyl)aminomethane三(羟甲基)氨基甲烷TTC2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride2，3，5-氯化三苯四氮唑Tween-20Tween-20吐温-20VII上海交通大学硕士学位论文第一部分： 脑缺血再灌注损伤后自噬相关蛋白的表达及调控机制引 言脑血管疾病是神经系统的常见疾病和多发病，是人类严重病残和死亡的重要原因之一，其中又以缺血性脑血管疾病的发病率居首位。流行病学调查显示缺血性脑卒中的发病率大约为 2.54，死亡率为 3。严重的后遗症及很高的死亡率一直困扰着医疗界，多年来缺乏新型的有效治疗药物。自噬作为存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的胞内降解途径，与神经元存活/死亡密切相关，其在脑缺血再灌注损伤过程中参与的复杂调控机制已经成为目前神经系统疾病研究的重点之一。1. 自噬1.1 自噬的概念脑缺血可以引起大脑神经元不可逆性损伤和死亡。在细胞死亡的过程中，可能发生凋亡性程序性细胞死亡（Apoptosis），自噬性程序性细胞死亡(Autophagy)和细胞坏死（Nercrosis）三种类型1。凋亡的主要形态学特征表现为细胞皱缩，染色质边集，核 DNA 降解，残余的细胞被吞噬细胞消化，被称为型程序性细胞死亡。近年来，另一种新的细胞死亡方式自噬性程序性细胞死亡吸引了科学家们的关注被称为 II 型程序性细胞死亡。通过电镜可以看到膜状结构的自噬体和其他亚细胞结构以及荧光显微镜观察到点状聚集物的形成（如图 1 所示）。自噬这一概念最早由 Christian de Duve 于 1963 年提出，一份全新的国际性杂志Autophagy已在2005 年 4 月份出版，2007 年召开第一次自噬国际会议。针对目前自噬检测缺乏统一标准的问题，Autophagy杂志在 2008 年第二期，刊登了主编 Daniel 联合世界 上 200 多名自噬研究领域专家撰写的综述文章 Guidelines for the use andinterpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes。目前，自噬继凋亡之后已逐渐成为学科各领域研究的重要发展方向。1上海交通大学硕士学位论文图 1 自噬电镜及荧光显微镜的图片Figure 1 Images of electron microscopy and fluorescence microscopy in autophagy1.2 自噬的形成及分类1.2.1 自噬的形成过程自噬首先通过粗面内质网的非核糖体区域、高尔基体等来源的自噬体膜脱落形成杯状分隔膜，包绕在被降解胞质内容物周围，分隔膜逐延伸，将要被降解的胞浆成分完全包绕形成自噬体(autophagosome)，自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体并借助于蛋白水解酶降解其内成分，之后自噬体膜脱落再循环利用2 (如图 2 所示)。图 2 自噬体的形成过程 Nat Rev Drug Discov 2007, 6: 304-312Figure 2 The formation process of autophagosome Nat Rev Drug Discov 2007, 6:304-3122上海交通大学硕士学位论文1.2.2 自噬的分类 根据细胞物质运送到溶酶体内的途径不同，已确定自噬主要有3种形式：大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬3。大自噬(Macroautophagy)，又称巨自噬，即我们通常所指的自噬，是非溶酶体来 源的双层膜结构包裹胞浆内容物和变性坏死的细胞器形成自噬体，接着是在细胞骨 架蛋白驱动下自噬体与溶酶体的融合，形成自噬溶酶体，溶酶体利用自身的蛋白水解酶降解自噬体内细胞物质。大自噬通常在外界环境压力或者内环境变化刺激下激活，一方面利用降解成的核苷、氨基酸和脂肪酸合成新的大分子和ATP，维持细胞的正常代谢和生存，另一方面它可以选择性地清除某些细胞成分，维持细胞自我稳态。自噬相关蛋白的发现可以让我们使用分子生物学手段以这类蛋白为靶点来调控自噬，从而搞清楚巨自噬在病理条件下所起的作用4。小自噬(Microautophagy)又称微自噬。与大自噬不同，小自噬通过溶酶体膜自身变形来包裹和降解胞浆内容物。小自噬主要参与细胞在正常情况下细胞器的降解5，此外小自噬还可以选择性降解细胞内多余的细胞器，如某些药物可以诱导过氧化物酶体增生，而小自噬则可以选择性的降解这种细胞器来维持细胞器的正常数目6。由于目前还没有很好的手段来调控小自噬，还不清楚这种自噬在人类疾病中所起的作用。分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy,CMA) 与前两者不同，没有形成膜性结构的过程即不发生囊泡转运，其典型特点是具有选择性。首先由胞浆中分子伴侣识别底物蛋白分子的特定氨基酸序列并与之结合后，溶酶体腔中的另外一种分子伴侣介导底物在溶酶体膜的转位，进入溶酶体腔中的底物在水解酶作用下分解为其组成成分，被细胞再利用7。2. 自噬的调控机制2.1 参与自噬体形成的两个泛素样蛋白系统在哺乳动物细胞自噬的自噬泡形成过程中与自噬相关基因（ATG)有关，即依赖于两个泛素样结合系统Atg12-Atg5 和 Atg8 系统。Atg 蛋白根据功能的不同分为四类：(1)Atg1 复合体，整合 TOR 激酶的信号，该复合体参与自噬体形成的起始、3上海交通大学硕士学位论文成核、延伸8。(2)Beclin 1/ PI3K(Vps34)复合体，参与自噬的成核阶段9。(3)两条泛素样接合系统，Atg12 和 LC3(LC3 与酵母 Atg8 蛋白同源)。在自噬体形成的起始阶段，Atg12 结合 Atg5，并促进 LC3 与磷脂酰乙醇胺的结合来促进自噬体的延伸10。(4)Atg1 和 Atg9 调控的再循环通路。Atg1 和 Atg9 蛋白调控其他 Atg 蛋白在自噬体形成过程中在自噬体内外的穿梭作用11。其中 Atg3、Atg5、Atg7、Atg10、Atg12 和LC3 (microtubule 2 associated protein 1 light chain 3 , MAP12LC3) 参与组成了这两条泛素样蛋白加工修饰过程。Atg12 首先由 E1 酶 Atg7 活化，之后转运至 E2 酶 Atg10，最后与 Atg5 泛素化结合，形成 Atg12-Atg5 复合物也称为自噬体前体( autophagosomal precursor) 。这一复合物结合于形成中的自噬小体的外膜，帮助其延伸，在自噬小体完全形成后即脱落。另一泛素样结合系统包含 Atg8 及其靶向分子磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)。Atg4 是一种半胱氨酸天冬氨酸酶，它首先将 Atg8 羧基端部分氨基酸残基裂解，显露其氨基乙酸末端，使 Atg8 通过酰胺键与 PE 结合。结合之后，Atg8 即紧密附着于自噬小体膜上。2.2 参与自噬调控的相关蛋白 2.2.1 LC3 微管相关蛋白 LC3（ Microtubule-associated protein1 light chain3 ,MAP-LC3)是酵母细胞自噬相关基因 Atg8 的类似物，它们在氨基酸序列上有 28的同源性。LC3 前体( Pro-LC3) 形成后，首先在 Atg4 同源物的催化下，其 C 末端 5 个氨基酸残基被切割下来，加工成胞浆可溶性形式 LC3I，并暴露出其羧基末端的甘氨酸残基，LC3I接着在哺乳动物 E1 泛素样酶 Atg7 和 E2 泛素样酶 Atg3 的催化下，经泛素样加工修饰过程与（PE）结合修饰成膜结合形式 LC3II。LC3II 定位于自噬体和自噬溶酶体膜上，因此是自噬体的标志分子。电泳过程中，LC3II 的迁移速率要快于 LC3I。因此，在 LC3 的免疫印记中，通常出现两条带：LC3I 的表观分子量为 18kD，LC3II的表观分子量为 16kD。LC3II 的数量及 LC3II/LC3I 的含量与自噬体的数量成正相关。当哺乳动物细胞发生自噬时，细胞内 LC3 的含量及 LC3I 向 LC3II 的转化均明显增加。因此，通过检测细胞内 LC3II 或者 LC3II/LC3I 的含量，可以方便地判断细胞自噬的活性变化。4上海交通大学硕士学位论文2.2.2 Beclin 1 哺乳动物 Beclin 1 蛋白是一个分子量为 60kDa 包含四个特异性结构域的蛋白：(1)Bcl-2 结 合 域 （ aa88-150 ）， (2) 卷 曲 结 构 域 (aa150-244) ， (3) 进 化 保 守 结 构 域(aa244-337)，(4)核输出信号结构域(aa180-190)，该结构域主要负责 Beclin 1 从胞核到胞浆的运输，只有胞浆中的 Beclin 1 蛋白参与自噬的调控12。目前的研究观察到Beclin 1 蛋白主要分布在高尔基体、内质网、线粒体膜和细胞核膜周围13。Beclin 1作为酵母 Atg6/Vps34 基因的同源物，同时也是型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(classIIIphosphatidylinositol 3-kinase，Class PI3K)复合体的组成部分，通过磷脂酰肌醇磷酸化，产生三磷酸磷脂酰肌醇(PI3K)。PI3K 在自噬前体复合物的形成以及自噬小体膜的来源中发挥重要作用14。所以 Beclin 1 是哺乳动物一个特异性的自噬调控蛋白。自噬抑制剂 3-MA 通过抑制 PI3K 发挥对自噬的抑制作用。2.2.3 TOR 激酶 自噬调控的一个靶点是 TOR 激酶(Target of Rapamycin kinase)。在存在生长因子和营养过剩的情况下，酪氨酸激酶受体通过 PI3K/Akt 信号通路活化 TOR 激酶来抑制自噬(如图 3 所示)。图 3 自噬条件下 mTOR 激酶的调控机制 Autophagy 2009, 5: 221-223Figure 3 The regulation of mTOR kinase under the conditions of autophagy Autophagy 2009, 5:221-2235上海交通大学硕士学位论文3. 自噬在缺血性脑血管疾病中的意义自噬是存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的胞内降解途径，正常条件下自 噬也有基本活性，旨在降解多余的蛋白以及细胞器来维持细胞的稳态。在营养缺乏 或能量需求高时，为了产生更多的能量和营养，自噬活性会大大提高。在脑缺血再 灌注损伤过程中伴随着营养缺乏，能量降低、氧化应激，感染，蛋白凝聚物聚集等 病理变化，此时自噬激活，表达上调14，之后诱导自噬体形成，并和溶酶体融合来 降解膜磷脂和胞质内蛋白质及受损伤的细胞器，降低细胞凋亡和坏死的程度，为细 胞提供营养和维持细胞生命活动所需的能量，保持细胞内环境的稳态。同样在多种 病理情况下如感染、癌症、神经退行性变以及衰老、心脏病等，自噬起到了防护作 用。然而当缺血再灌注损伤的程度超过了自噬吞噬防护能力，溶酶体活性升高大量 释放水解蛋白酶，加剧破坏细胞结构，自噬性的细胞死亡就占据了上风，此时自噬 会使这些病理进程加重15。因此自噬都在缺血再灌注损伤过程中维持神经元存活还 是加剧死亡尚未有定论。鉴于此，本文通过建立小鼠的短暂性局灶性脑缺血再灌注 模型，模拟人类缺血性脑血管疾病的作用机制，利用分子生物学技术及免疫荧光染 色等自噬研究方法检测检测脑缺血再灌注损伤过程中自噬相关蛋白LC3及 Beclin 1的表达变化，探讨自噬在缺血性脑血管疾病的调控表达机制，为缺血性脑血管疾病 的治疗提供新的研究方向。6上海交通大学硕士学位论文材料和方法1. 实验动物成年雄性健康 CD-1 小鼠 36 只，体重（25-30）g，清洁级，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。动物分笼饲养，保持相对湿度（55-65）%、温度（20-25），室内 12h 明暗光线自动切换，自由饮水，标准鼠饲料喂养。2. 主要试剂2.1 生化试剂：甘氨酸（glycine）、焦磷酸钠（sodium pyrophosphate；NaPPi）、-磷酸甘油（-glycerophosphate）、对硝基苯磷酸二钠（p-nitrophenyl phosphate，disodium；PNPP-Na）、矾酸钠（sodium orthovanadate；Na3VO4）、抑肽酶（aprotinin）、亮肽素（ leupeptin ）、胃酶抑素（ pepstatin A ）、乙基苯基聚乙二醇（(Octylphenoxy)polyethoxyethanol；Nonidet P-40，NP-40）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin ；BSA）、四乙基乙二胺（N,N,N,N-tetramethylethylenediamine ； TEMED）、蛋白分子量标准（Markers）、苯甲基磺酰氟（phenylmethyl sulfony1 fluoride；PMSF）和吐温-20（Tween-20）均为 Sigma 公司产品。3-(N-吗啉代)丙磺酸（3-(N-morpholino) propane sulfonic acid；MOPS）、三羟甲 基氨基甲烷（tris-hydroxymethyl aminomethane；Tris）、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸 （N-2-hydroxyethyl-piperazine-N-2-ethanesulfonic acid；HEPES）、乙二醇双(2-氨基 乙基)四乙酸（ethylene glycol-bis(2-aminoethyl)-N，N，N，N-tetraacetic acid；EGTA）、 电泳用甘氨酸（glycine）、封闭用 BSA（fraction V）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、-疏基乙醇（- mercaptoethanol）、二硫苏糖醇（DL-dithiothreitol；DTT）、 盐酸苯甲脒（benzamidine hydrochloride）、丙烯酰胺（acrylamide）均为 Amresco 公司产品。甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylenebisacrylamide）, 2，3，5-氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)为 Fluka，Sigma-Aldrich 公司产品。7上海交通大学硕士学位论文PVDF 膜（polyvinylidene difluoride, PVDF 0.22m），RIPA Lysis Buffer 为 Millpore Biotechnology（Santa Cruz, CA, USA）公司产品。氮兰四唑（ nitroblue tetrazolium chloride ；NBT）， 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸 （5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate；BCIP）为 Promega（Madison, WI, USA）公 司产品，均为 50 mg/ml 的二甲基甲酰胺溶液。PMSF，双氢溴乙啶(Dihydroethidium，DHE)为碧云天产品。Cocktail 为 Thermo scientific 产品。其它常用试剂均为国产分析纯2.2抗体，试剂盒用于 Western Blot：兔抗-Beclin 1Sigma Biotechnology兔抗-LC3Sigma Biotechnology鼠抗-actinSanta CruzECL 化学发光试剂盒Pierce Biotechnology抗兔 IgG 二抗（HRP）Pierce Biotechnology抗鼠 IgG 二抗（HRP）Pierce Biotechnology用于免疫荧光：鼠抗-NeuNMilliporeAlexa- 488 标记荧光羊抗兔二抗Invitrogency3 标记荧光羊抗鼠二抗Jackson2.3试剂配制(1)匀浆缓冲液1RIPA、1 Cocktail、1PMSF 按照 100:1：1 比例配成匀浆缓冲液，其中 1Cocktail、1PMSF 临用前加(2) 蛋白上样缓冲液（5SDS） 0.5 mol/L Tris-HCl（pH6.8）、二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）、SDS 、溴酚蓝、 8上海交通大学硕士学位论文甘油 混匀后，分装于1.5ml离心管中，4保存。(3) 电泳缓冲液25 mM Tris (pH 8.3-8.8)、190 mM 甘氨酸、0.1 % SDS。 (4) 电转移缓冲液（半干转） 48 mM Tris (pH 8.3-8.8)、39 mM 甘氨酸、20 % 甲醇。 (5) 洗涤缓冲液（TBST） 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、100 mM NaCl、0.1 % Tween-20。 (6) 洗涤缓冲液（PBS） 2700 mM NaCl、 53mM KCL、203mM Na2HPO4、35mM KH2PO4。.(7) 封闭液（5 % 脱脂奶粉的 TBST 缓冲溶液） 脱脂奶粉、 TBST 溶液 (8) 0.01 M 柠檬酸钠 柠檬酸钠、超纯水(9) 10%BSA(牛血清白蛋白)无菌条件下，称取 10g 牛血清白蛋白，用 0.01M PBS 定容到 100ml，调 PH 值为 7.4，用直径为 0.45m 的滤膜过滤除菌，4冰箱保存。(10) 一抗及二抗工作液用于 Western blot：兔抗-Beclin 1 ：用 1TBST 稀释，比例为 1：1000兔抗-LC3 ：用 1TBST 稀释，比例为 1：1000鼠抗-actin ：用 1TBST 稀释，比例为 1：500抗兔 IgG 二抗（HRP）：用 1TBST 稀释，比例为 1：2000抗鼠 IgG 二抗（HRP）：用 1TBST 稀释，比例为 1：2000用于免疫荧光：兔抗-Beclin 1 ：用 1PBS 稀释，比例为 1：500兔抗-NeuN ：用 1PBS 稀释，比例为 1：200Alexa- 488 标记荧光羊抗兔二抗：用 1PBS 稀释，比例为 1：5009上海交通大学硕士学位论文cy3 标记荧光羊抗鼠二抗：用 1PBS 稀释，比例为 1：500 (11) 4%多聚甲醛多聚甲醛、100 mM PBS(pH 7.4)、100 mMNaOH。60加热溶解后，自然冷却，4保存(12) 2%TTCTTC、生理盐水。避光 4保存(13) 7%水合氯醛水合氯醛、超纯水。避光保存。(14) 0.3%Triton X-10030% Triton X-100、0.1M PBS，两者混合，37-40水浴中 2-3 小时，使其充分混匀。(15) DHE 染色液原液为 100mg/ml 用 DMSO 稀释的，现在的储存液为 0.5mg/ml，然后按照 1:100PBS 稀释成 5g/ml 的工作液。(16) 氯胺酮和盐酸噻拉嗪混合麻醉剂氯胺酮原液 100mg，用 NaCL 稀释成 100mg/10ml 的工作液，同时加入盐酸噻 拉嗪 10 mg，按照 100l /10 mg 腹腔注射。3. 仪 器 设 备M651 手术显微镜德国 Leica 公司VMS-LDF2 激光多普勒测量仪英国 Moor 公司AL104 电子天平梅特勒-托利多仪器上海有限公司VEX130 超声波细胞破碎仪美国 SONICS 公司-80超低温冰箱美国 Thermo Scientific Forma 公司PH 计美国 Thermo Scientific Forma 公司Microfuge 22R 台式微量冷冻离心机 美国 Beckman Coulter 公司超纯水制取器美国 Millipore 公司垂直板凝胶电泳系统美国 Bio-Rad 公司10上海交通大学硕士学位论文Biotek synergy2 多功能酶标仪美国 BioTek 公司垂直板凝胶电泳系统美国 Bio-Rad 公司EG1160 石蜡切片机德国 Leica 公司37隔水式恒温培养箱上海一恒科技有限公司60电热恒温水箱上海一恒科技有限公司DM 2500 正置荧光显微镜德国 Leica 公司Nikon Eclipse A1 激光共聚焦显微镜日本 Nikon 公司4. CD-1 小鼠短暂性局灶性脑缺血/再灌注模型的建立按线栓法16建立 tMCAO 模型（如图 4 所示）。实验动物随机分为 2 组:假手术组(sham 组)、缺血再灌注组。每组 9 只。缺血再灌注组以氯胺酮和盐酸噻拉嗪混合麻醉剂 (100l /10 mg)腹腔注射。麻醉后剪开头皮，暴露前囟，用激光多普勒血流仪测量并记录双侧大脑中动脉血流(位置大约在前囟旁 3 毫米)，结果取三次平均值。之后小鼠仰卧于手术台上，四肢固定，在胸骨柄和下颚之间颈部做约 1.5cm 手术正中切口，在手术显微镜下逐层分离并暴露左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉( ECA)和颈内动脉(ICA)并短暂结扎。从颈外动脉( ECA)或颈总动脉(CCA)分叉处剪一切口，插入预先制备的硅胶包被的 7-0 线栓，结扎分叉处缝线后剪