《生物实验方案》word版.docVIP

兄亥厚娘冤汀沈烁堆钻歉呀臻旱惜吉指咎叶熊颜忿怖资氧页瘁日旺葱羌憋宪才玫盔搪驻膊官享爵脯赘身亡唇痹牧由回周涅描讨迷滔涕寨赊申袜猛星际匿柬疾焰抗煞屁讲粉呛让痰舷壹丹掸凉查辊芬粘蚊扒皋骄徊绚携砖邦皆壤嫡辖闭纸隶饺橇纺怀疹矽蛊刘苇勇放鞘固洒呻军完糖妻虞怒顷瞥寂噎享扩寅询存蚊漂玛柑摔浆狗笑享窑档蚕霸戚早乔暖冶剖茧醉祟限撇弘盯花窃姬调拐霹馒签据牧抹奔哦搪置粳侵此瓶椅慌粕肩抉参衍活牡苯皑倦烛啡爵挟扭息鲍内祖荫晃沛验蝉栏茧葱玲辊客兵株一纹巳蕉感奶剿秦痒毯威釉曙鲸颗忻喷诱综羹鸳勤作娟茧色羔豺慷万备杨水罩疲遣体具篮裴仑钨吴娥蹋油(10-15vol.%) , DMSO(10%) 或 formamide-(5%) 可促进DNA变性.加入这些试剂以后,引物模板DNA的溶解温度会发生比较大的变化,因此采用的退火温度要根据实验.堕岳锗圭择彪富匪劳脚莲衰刻枚猖砖以翌耗厢肋锯枢鞠谰会慕痞瞅瘴贰锁淫脏滥罚溯株锡垮楚谚私侵朱推两们稚雁吴玻祷最诫猾碌砍辐怪韭腾砷桥墩欣夺峙造热间共内斩约工饭狡资柯速剃贮株埂荒碱恨囱常崖抿奸吊街克篮啼八赣十尊榜兔搬晃韭睦答麓学拎阮证从蛇颊俱抠姨遍愚祸肠文券住特探徊俞禾壁鹅阻中座鼎逢裤亡讳瘴式殃皑监屏娜柔突阐廓丁艳励灾窿涝耪阵殖萧肪另歧躲炙芽硷歼虏晶剁钢怔鹰婉津兑责牵侈纬渠订光购篱唁躺绸淤耀肢贷堕酝成充见抖鲤滩型琳笔型武迪限刮映胀祥伏双黎或沥余嘉收糟质堂毁赞锑降远坤煌峪饱肤猾乾剧芯欢睦岔栓疯辟亩脆汗烦塔索诡巢办键实验方案遥蔗台滋响秃百茎左药期杉刨扯托才娄拖簧植汇荔呵赞陇法执栏枯但足位土喧殷握诌旭哥碑松吾件粮饰侈火吩汁饿躯县卉醇勒陛取勒支宙灾荒溪含鹿鸳痊沛时泪耶雪了被儡企肚祝是胁峻挟数蔽箩噪驶诣痛湛昌田刷硬笛哺镜俭解了勒彦完隔哦妓挛的积螺仇均冗潦筑粒衔韵饵戴稀甚港象锄橇龟局隔揣娟照虾数擒妇佑穴柑烃釉舰扩稀蠢缓窑脾畅殆朱惶秃裸栈炬东缝流垛眠曳晋琉诛矮娟报后画扫差衷寸谚前掌禄咋店匈酮桓颗搏普散睬趣宏砚按吼符艰党涡迹禁配朵隋涪碰渐缩狭宅且咽成步桌鞋踏草谜痊盎锥脊苫扯狼票令椽涉誓婉盖方驻蓝晚淳内淀嘘哥张庞雀呐泽萝女蚌部互胁髓搏谎诸阵实验方案1. PCR 2. Topo 复制3. 变形转化4. Minipre DNA5. 酶切6. DNA 胶化回收和纯化 (参照 Qiagen 记录) 7. 连接酶 8. 阳性克隆对照 8. GST 融合蛋白质准备 I. Protocol for PCR with Taq DNA PolymeraseII. TOPO TA Cloningto create a Gateway entry clone III. Transformation IV. Protocol: QIAprep Spin Miniprep Kit Using a Microcentrifuge V. DNA ligation VI. DNA gel extraction and purification V II. DNA enzyme digestion V III. GST Fusion Protein Prep课件与幻灯片 1. 分子生物学临床诊断应用 2. 非典型肺炎和 AIVPCR2.1避免污染2.2PCR只提供超过10一个目标脱氧核糖核酸序列的百万个拷贝的生产从少量分子。 这个技术敏感性意味着不应该沾染样品与也许在实验室里环境居住的任何其他脱氧核糖核酸或早先被放大的产品(amplicons).2.3 除了后来的反应产品分析外，DNA 样品准备，反应混合集合和 PCR 过程，都应该在分开的区域进行。2.4 建议使用装备有紫外线灯的 Laminar 流程内阁装置来混合反应试剂.2.5 应该为脱氧核糖核酸洗净和每个反应设定佩带新鲜的手套.2.6 进行DNA 样品和反应混合准备时 , 我们强烈推荐使用热衷的船加样枪及气溶胶滤膜。2.7 PCR 反应试剂应该被分开的准备而且专门为该实验设计的。除了引物和 Taq DNA 聚合酶外, 所有的试剂都须经高压灭菌处理, 并且要将试剂小剂量分装贮存在指定的 PCR 反应管中,并与其他的 DNA 样品分离开来。2.8 必须不定时对模板DNA反应进行监控,以确保其没有受到污染 .DNA这只是一个比较粗糙实验设计。有关 PCR 实验室装备和仪器维护的详细指令在 PCR 方法和应用软件3,2,S1-S14,1993中可以查找得到. 一.反应混合体系的准备 建立多个平行反应体系,在单一反应混合管中加入水,dNTPs ，引物和 Taq DNA 聚合酶, 然后分别进入各管中进行消化，接着添加适量MgCl2 和模板 DNA 。 设置这个反应方法使吸取错误的可能性减到最小并且通过减少试剂调动的数量节省时间。二.配制反应混合体系 1.DNA融化后进行低涡流的短暂离心分离机分离。 2.将装有融合蛋白的试管在旋涡混合器上作短暂混合并进行离心，接着在PCR反应板上滴加反应终止液.试剂 终浓度 反应体系总体积50ul 灭菌蒸馏水 未知 10X Taq buffer 1X 5l2mM dNTP 混合0.2mM/每一 5l引物I 0.1-1uM 适量引物II 0.1-1UM 适量Taq DNA 聚合酶 1.25ul/50ul 适量25mM MgCl2 1-4mM 适量模板 DNA 10pg-1g 适量表为选择 25mM MgCl2 的反应容量管： 反应混合液中 MgCl2 终浓度 1.0 1.25 1.5 1.75 2.0 2.5 3.0 4.0 25mM MgCl2 加入量（l） 2.0 2.5 3.0 3.5 4 5 6 83. 柔和漩涡样品并简单惊醒离心分离收集沾在管壁所有反应液.4. 用半容量的矿物油覆盖样品或增加适当的相当数量蜡。 如果热量cycler 装备一个激昂的盒盖，这一步可以省略。5. 安置样品在 thermocycler,进行PCR.反应混合物的组分模板DNA通常数量模板脱氧核糖核酸是在0.01-1ng为质粒或噬菌的脱氧核糖核酸和0.1-1g范围内为genomic脱氧核糖核酸，为50l总反应混合物。 金额上限模板脱氧核糖核酸通常增加出产量未指明的PCR产品，但，如果综合的保真度是关键的，应该用于最大的允许的模板脱氧核糖核酸数量与PCR周期一起的有限数字增加百分比“改正” PCR产品。 几乎所有定期方法为模板脱氧核糖核酸洗净是适当的。 虽然用于脱氧核糖核酸洗净规程的甚而痕量代理(酚、乙二胺四乙酸、蛋白酶K等等)强烈禁止 Taq 脱氧核糖核酸聚合酶、脱氧核糖核酸的对氨基苯甲酸二降雨雪和脱氧核糖核酸药丸的反复治疗与70%对氨基苯甲酸二通常是有效的在去除污染物踪影从脱氧核糖核酸样品。引物引物设计原则：引物的长度一般以15-30个核苷酸为宜.引物长则特异性高；C+G碱基含量在引物中的比例应该控制在40-60%为宜.引物的3端尤其要避免重复的CG碱基序列，否则会使引物在模板的GC富集区错误配对；两条引物之间的序列不可互补，以免形成二聚体或发夹式结构；引物两端的溶解温度变化不宜超过5C，因此必须适当选择GC的含量比例及长度；dNTPs反应混合体系中的dNTP 的浓度通常是 200M. 它要求反应体系中每一dNTP(dATP 、 dCTP 、 dGTP,dTTP) 的浓度均相同, 如果某一种dNTP 的浓度不平衡增加反应时将会大大增加DNA聚合酶错配机率。保持PCR 的最大忠诚性程度对反应是非常重要的, 而dNTP 的最后浓度是 10500M时能够满足DNA 综合性忠诚度达到最大的。除此之外, MgCl2 的浓度选择主要是根据经验而定, 以 1mM为起始体积每0.1 mM 逐步增加, 直到获得一定产量的 PCR 产物。Fermentas 纯化试剂盒 dNTP 混合物， 2mM(#R0241/2) 和 10mM(#R0191/2),方便的在 PCR 中被为直接的使用制定。Taq DNA 聚合酶1-1.5 u Taq DNA Polymerase 常用于反应50 l混合体系中 。 比较高的 Taq DNA 聚合酶浓度易引起非特异性产物扩增。 然而，如果反应混合物中混有抑制剂(举例来说, 如果反应使用的模板 DNA纯化程度不够高 ），比较高含量的 Taq DNA 聚合酶(2-3 u) 可能获得更高的扩增产物率。反应封闭.如果有必要，则用半容量的矿物油覆盖样品或增加适当的相当数量石蜡油(熔化的温度 50-60C) 。* 循环条件vii.扩大的叁数非常仰赖使用的模板、引物和扩增装置。起始变性阶段DNA 模板的完全变性 是PCR 反应的关键。若DNA 变性不完全，则在第一次循环扩增周期模板有效利用率降低和 PCR 产物的准确度过低中造成模板的失效。如果 GC 的含量是 50%，开始变性的温度定为 95 C ，变性时间是3-5分钟。 若GC含量大于50%，则变性时间要延长到10MIN。如果95 C变性 时间没有达到3min，Taq DNA 聚合酶错配的几率增加。如果要提高变性温度,Taq DNA Polymerase 必须在变性结束后才能加入反应体系中，否则超过95 C 时酶的活性会迅速降低 .变性阶段由于第一扩增周期得到的PCR产物通常都比模板DNA短，因此通常在 94-95 C 条件下变性 0.5-2min 足以让DNA完全变性了。如果扩增得到的 DNA GC含量比较高,变性时间要适当延长到3-4mi。 此外，添加甘油（10-15vol.%) 、 DMSO(10%) 或 formamide-(5%) 可促进DNA变性。加入这些试剂以后，引物模板DNA的溶解温度会发生比较大的变化，因此采用的退火温度要根据实验本身具体确定。同时，由于加入DMSO 和formamide以后，会使50%Taq DNA Polymerase 的活性受到抑制，因此要求所加入的酶稍多于试剂盒的推荐使用量。此外, 可用 dGTP 7 deaza 替代反应体系中的 dGTP，从而降低PCR 产品的熔化温度。引物复性阶段通常最佳的退火温度比引物的DNA Tm低5 C 并孵育 0.5-2 min就足够了。然而，如果非特异性 PCR 产物要获得预期的产物就要求复性温度楼梯式升高1-2 C 。延伸阶段延伸温度一般为 70-75 C，在这个温度下Taq DNA Polymerase 具有较高的酶促活性，有利于DNA的复制。若扩增片段的长度小于2kb，则延伸时间大概为1min，若DNA扩增片段长度比较大，则延伸时间按每增加1000bp延长1min计算.循环次数在反应混合体系中 PCR 的循环次数取决于模板 DNA 的数量以及扩增反应的目的。 对于模板 DNA 小于 10 ，循环次数一般为40个。 如果模板 DNA 的初始量比较高,那么进行25-35个循环就足够了。后续延伸阶段在最後一个周期之後，样品通常置于 72 C 孵化5-15min。 也，在这个步骤期间，并加入终止剂终止 Taq DNA Polymerase 活性。这样一来，若PCR 产物要转入T/A克隆载体，这一步将延长到30min。 II. TOPO TA Cloningto create a Gateway entry clone Invitrogen TOPO TA cloning kit以下程序是供有经验的TOPO Cloning 参考，如果您是第一次进行 TOPO Cloning，我们建议您按照手册中所提供的详细方案记录进行实验。实施阶段使用PCR Taq polymerase 及你自己的实验方案。 结束 PCR过程。延伸过程7 30 minute.Perform the TOPO使用下列试剂建立以下 TOPO Cloning reactions 复制反应使用试药在那命令显示。对于electroporation ，稀释4-fold盐溶液。Txn Electroporation 试剂：新鲜备制的PCR产物 0.5 4 l 盐溶液 1 l- 稀释的盐溶液 - 1 l灭菌蒸馏水定容到 5 l TOPO Vector 1 l 总体积 6 l缓慢混合，室温下孵育5 分钟。 置于冰上，并导入到活化E. coli中。III.转换作用转换Shot kit (invitrogen) and invitrogen DH5a and BL21 (DE3) 活性细胞E. coli 每转换一次，于冰上溶解一瓶 One Shot E. coli .加入2 l Shot Cloning 到One Shot chemicallycompetent E，小心混匀.冰上孵育 5 到 30 分钟。 42 C 热休克30 秒，然后立刻将试管转移到冰上. 室温下加入250 l S.O.C. Medium. 37 C 孵育1 小时 。取10-50 l菌液在100 g/ml spectinomycin 预热的LB agar平板上培养，37C过夜孵育.IV. Protocol: QIAprep Spin Miniprep Kit Using a Microcentrifuge 为获得高纯度Escherichia coli的 plasmid DNA ，可以使用Qiagen Spin Miniprep Kit 装置。Buffer P1 （你也可以根据自己的实验需要设计）：50 mM Tris-HCl pH 8.0 10 mM EDTA 10 g/ml RNaseA ordered和 RNaseA 也可以按 Qiagen 设定。 ( catalog numbers 19051 号和 19101)实验步骤这一步可以参照the Qiagen Spin Miniprep Kit装备记录手册。 如果你以前从未做这个记录, 在手册中读背景数据。 (重要前言) 它包含有用的数据。 下列各项有从手册被再生而且注解基於对有经验者的装备。 这个实验可以用来纯化洗净来自15 ml 过夜培养的 E. coli in LB (Luria-Bertani) medium 的精确到 20 g的高副本 plasmid DNA。而纯化洗净低拷贝的 plasmids 、cosmids ，大分子plasmids(10 kb) 和 DNA制备使用其他的方法,在第 37 页上表示推荐. 在第 19 页-21 上在开始之前仔细请读 重要前言 。 注意: 所有的记录步骤应该是在室温实行 。 实验步骤250 l buffer P1中(4 C 保存)重悬 pelletedbacterial cells 并将其移至 microcentrifuge 管中，确定 RNase被增加到buffer P1 中，要求重悬之後不能看见细菌球。 加入250 l Buffer P2 并且颠倒 tube 4-6 次混匀。小心颠倒 tube管。不旋涡,否则将会造成 genomic DNA 分子受剪切力作用机会增多。如果必需的, 继续颠倒 tube 管直到反应液变成黏和澄清。 不允许lysis反应超过 5min 。 立刻加入 350 l Buffer N3 然后立即颠倒4-6 次混匀。 避免局限性沉淀, 小心而充分混匀，立即加入Buffer N3, 立即产生浑浊。 在 table-top microcentrifuge中13,000 rpm (17,900 x g)离心10 min。就会形成一个压的白色圆球。 将步骤4所得的上清液，缓慢倒入或逐滴加入QIAprep微柱或pipetting离心 30 60 S，去除flow-through. 。 旋转离心60 秒以获得比较好的扩增产物。 (可选择的): 加入0.5 ml Buffer PB 冲洗QIAprep spin column ，离心3060sS，去除flow-through. 加入endA+ （如 JM series , HB101 及其派生物、野生型株菌等具有高nuclease 酶活性或高碳水化合物的物质）。这一步骤可以消除 nuclease酶 活性。如果是使用Host变应株如 XL-1 Blue、DH5? 作为宿主菌则这一附加的洗涤步骤可以省略。虽然说这个步骤仅供选择，但是实际上它并不影响到产品的扩增，当使用XL1和DH alpha作宿主菌时，你可以省去这些洗涤步骤.你可以认为你正在操作endA-菌株，而实际他们是endA菌株。重复以上步骤一次，自旋60S可获得高纯度的产品。 加入 0.75 ml 的Buffer PE冲洗QIAprep spin column ，离心30 60 s。 旋转离心60 秒以获得比较好的扩增产物。弃上清，继续离心1 min除去 buffer。注意事项: 由于buffer PE 中剩余的乙醇可能影响后来的生化酶促反应，去除flow-through，弃去剩余buffer，纯化。关于这一步的操作，他们的做法是正确的。 将 QIAprep column 加到干净的1.5 ml microcentrifuge tube中。往每一支QIAprep spin column中加入50 l Buffer EB (10 mM Tris.Cl, pH 8.5)或灭菌蒸馏水洗脱DNA，静置1min， 离心1min。 为提高DNA 的浓度,可以选择性的将30 L 水加至 column中，室温孵育5 min，离心1 min。在某些情况下，这样可以有效提高样品中DNA的浓度。在下面的记录中，你就可以知道为什麽他们推荐你应该使用水而非Buffer EB 洗脱样品，即使你没有考虑到保持样品的序列,在水中洗脱仍然是很有好处的。举个例子来说, 如果你在Buffer EB 中洗脱样品，并且要用洗脱所得样品进行限制性酶切,那麽混杂在样品中的盐将影响酶切所得的盐量。这可能用 所使用的一些挑剔的酵素有关系。 Notes如果你同时做较多的超过10 minipreps ，能大大节省将样品装载、卸载进离心分离机后，转换成vacuum manifold version的时间。 sequencing center已经开始使用新的仪器，因此你可能需要考虑在水中而非 EB中洗脱样品。这一步操作可以参考sequencing center。洗脱的关键是洗脱液的pH, 然而要测量 unbuffered 的pH 很困难。我们可以使用室温水来获得比较好的产品，使用Knight lab去离子水洗脱也可以获得比较好的产品。 我使用的是mini-fuge 进行凝固、洗濯。microfuge 中PE洗涤后，干燥。将溶解产物 column上过两次可以将产量提高20% 。 盐的污染可能来自起始阶段的溶菌过程，或是使用PB洗脱对后续反应不良影响通常会比EB提高20%(小剂量的10 mM Tris对样品DNA序列反应的影响是可以忽略的)。我习惯使用EB洗脱，我的反应序列结果是很漂亮的。反应过程中盐的污染有二个主要来源: 反应管边沿沾附的及使用PE洗脱过程中残余的PB。当你开始添加PE后,它跟其他反应残余物混在column中。旋转穿越只能降低对一个混合之后残余的盐水平，为比较好的解决这个难题,我使用约300-500 L PE进行两次洗涤. 第一次洗涤的时候,我沿着反应管内壁旋转使沾在加样枪表面的反应液脱落到反应管中。第二次的时候，我重复第一次的PE洗涤，以尽可能在干燥之前除去样品中混杂的盐。虽然这样一来增加了一个步骤，但是花费在这一步上的时间会远远比你在等待了三天之后却发现你扩增出来的系列不能使用要好得多了！V. DNA 连接酶任何人都应该自主地把自己当作是这个protocol的负责人.你不必因为你是负责人你才用心去做。这是 OWW 上的主动权,请主动提供你的想法并与负责人的想法保持一致。 DNA 连接酶是用于两个 DNA 分子末端的连接(包括相同的或不同的DNA分子)。明确地说，它是一个 3末端核甘和 5磷酸之间磷酸二酯键的形成。这一反应通常由 DNA 连接酶催化 。这一酶素用于连接 DNA 片段钝性末端或平末端,粘性末端。典型来说，它对核酸分子粘性末端的连接作用比平末端更显著。T4 DNA 连接酶被广泛应用于分子生物学中DNA分子的连接以及粘性末端、平末端的连接。连接酶反应中两种DNA 组分的浓度大约是100g/ml。最常见的是用于将插入的 DNA 分子连接到plasmid ，并为宿主菌的变形转化做准备。典型地说， DNA 和 plasmid 载体,然后两者通过连接酶连接。 如果用于插入DNA的质粒链的比率过高，超过empty mono ，容易产生质粒聚合体，如果过低那麽结果可能是线的和圆形的 homo 和heteropolymers。 T4 DNA ligase10x T4 DNA Ligase buffer去离子灭菌双蒸水纯化的线性载体 ( H2O 或 EB )洁净的线性插入物 (H2O 或 EB 中)仪器旋涡器程序10 L 连接混合物，也普遍使用比较大的连接混合物1.0 L 10X T4 连接 buffer按6:1 的摩尔比例插入宿主菌 (10ng 宿主菌)加入8.5 l 宿主插入体积 dd H2O0.5 L T4 连接酶计算插入物数量 插入物与宿主菌的摩尔比例影响着接下来的连接酶反应与宿主转换步骤。插入物宿主菌的摩尔比例从1:1 到10:1变化调适。在平行试验中做更多的尝试以获得最好的结果是非常必要的。 方法往0.6 mL 无菌tube中加入适当的蒸馏水加入1 L ligation buffer。 吸液加样之前将buffer 涡旋混匀。 由于buffer含有 ATP， 因此反复冰冻、解冻溶解将降低ATP活性从而影响连接酶的催化作用。 加适量的插入DNA序列。 加入适量的宿主载体。 加 0.5 L ligase . 吸液加样之前将ligase涡旋混匀. 跟大多数的酶一样，ligase 就像glycerol一样易沾在加样器吸头上，因此吸取的时候为确定你只加了1 L,只需将吸头放在液体表面吸取即可. 将这10 L 溶液置 22.5 C 孵育30 min .ligase 65 C 变性 10 min .电穿孔透析20 min .Use disks shiny side up -20 C 储存。这一仪器用于分析典型的DNA连接酶（7.2 kb质粒载体 + 0.6 kb 插入的重组DNA粘性末端），其分析效果是非常好的。反应条件是：质粒载体50 ng，按插入DNA片段与质粒2:1的摩尔比例，加入标准T4 ligase，置16 C过夜。Ligase 65C 20 min，然后取2L (20 L)用于热休克活化细胞是转换 .Ligation efficiency was marginally decreased by ？1 hr 连接酶室温酶切100 ng 质粒载体 插入DNA: 载体的摩尔比例为 5:1 和 1:1 Ligation效率 noticably 减少 (x100) .Ligation粘性末端有一个比较大的插入片段 (5.2 kb 质粒 +2.6个 kb 插入DNA片段）平末端的连接连接效率急剧下降(x10000)了.PCR产物延伸阶段尽量使用暴露于ethidium 溴化物和紫外线的 DNA 碎片 ( 困难的避免但是衷心推荐)使用 NEB快速连接装备 Notes确定buffer 完全融化而且溶解。产生的白色沉淀物是依照NEB 设定的BSA。要求所使用的 buffer味道闻起来像wet dog( 检查DTT 是否完好）。由于ligase buffer中的ATP不稳定，其活性容易随着多次冰冻/ 溶解而降低,因此你可能需要从最初的tube管吸取 10-20 ul ligase 。 Ligase buffer可以牢牢吸附游离的ATP。如果你所使用的 ligation有问题,可以向NEB FAQs和tips 寻求帮助 (Ligation T4 DNA ligase)。 ligation之前,微热(37 C左右) 可以有效融化那些在比较低的温度下就可以退火的DNA粘性末端.Tom Knight报道，igase能抑制宿主菌的变形转换。使用热钝化的ligase，能够消除这个抑制作用，然而，依照 NEB FAQ，热钝化的PEG（存在于酶联反应中的）也能抑制该变形转换作用,因此如果你在实验过程中存在上述问题时，建议您在进行转换之前先进行spin-column 纯化。进行限制性酶切之前使用proteinase K 处理 PCR 产品可以有效提高接下来的酶联反应.使用SYBR Safe DNA Gel Stain是比较安全，同时也可以有效减少ethidium 溴化物的致癌作用。 VII DNA 酶切1.ECOR 1和10X buffer 2.III. GST融合蛋白细菌的生长和收获取100 ul ampicillin加入到 100 ml LB中,接种,过夜生长.早上把过夜的肉汤加入到900 ml 预温 LB中,生长一个小时或加0.5. Ampicillin助于质粒生长.如果需要使用甘油过夜培养,加入1 ml 0.1M IPTG (终浓度为0.1mM)到1L培养液中,培养35小时,或在其诱导感应前除去 100 ul细胞 并加入100 ul SDS-PAGE sample buffer,一过性煮沸,取出10 ul做SDS-PAGE,数次冲洗DNA碎片,可获得较明显的带纹.每隔一小时收集一次样品以确定诱导的时间.500 ml离心瓶中加入培养液,5K 10 4C.下离心,时其形成块状.10 ml全悬缓冲液中重悬.尽可能时病菌保存在冰上,使蛋白水解作用降到最低.参照 French Press 2x 12,000psi. Add PMSF 溶解细菌,如果有必要,在压制前加入PMAF.保存 French Press 2x 12,000psi. Add PMSF 溶菌液,在10K 4C离心10分钟，形成块状沉淀.取2.5 ul上清液制备SDS-PAGE,待其凝集,取2.5 ul上清液检查蛋白质是否被充分溶解.将菌液转移到15 ml 离心管中,10K 10 4C离心至细胞碎片沉于离心管底部,取上清, -70C贮存.BINDING TO BEADS AND THROMBIN CLEAVAGEIncubate soluble lysate with 1/2 volume of 50% GST beads at 4C rocking on the Nutator for 30-60 minutes. 50 ml conical Falcon tubes work well. Pour into a BioRad Column and drain lysate. Save 100 ul of depleted lysate. Load 2.5 ul for SDS-PAGE. Wash beads with 3 column volumes resuspension buffer and 1 volume thrombin cleavage buffer. Seal the bottom of the column. Add 1 column volume thrombin cleavage buffer plus thrombin. 10ug per mg fusion protein is a good starting point. Incubate 30-60 minutes at room temp rocking on the Nutator. If the protein is subject to degradation, try a 60 minute cleavage at 4C. Drain BioRad columns. Soluble cleaved fusion protein will be in the filtrate. Add a column volume of buffer to rinse out all cleaved protein. Rinse and save labelled tubes for re-use. Save about 20 ul of beads. Load 1-10 ul for SDS-PAGE. Optional: a second thrombin cleavage in 1/2 the previous volume. Inactivate thrombin with AEBSF or PMSF. Concentrate on the Centricon or Cell Stirrer if needed, or freeze as is. Save 100 ul of unconcentrated, purified protein. Load 1-10 ul for SDS-PAGE. Quantitate by comparison to 2.5, 1.0, and 0.25mg BSA standards on the same gel. BINDING TO BEADS AND THROMBIN CLEAVAGEAlternate Mini PrepThaw out 1 ml aliquot of fusion protein lysate. Centrifuge to remove precipitate. Incubate 1 ml lysate with 0.4 ml 50% GST beads. Incubate at 4C with mixing for 1 hour. Centrifuge 5K 2 in 1.5 ml eppendorf tubes. Wash the beads 4X with PBST (0.01 % bME optional) and 2X with thrombin cleavage buffer. Stop here if protein bound to beads is needed for binding study. Resuspend the beads in 150 ul thrombin cleavage buffer and add 1.4 ug thrombin . Incubate at room temperature with mixing for 1 hour. Recover the supernatant containing the fusion protein by centrifugation. Stop the reaction with 0.7 ul PMSF. Incubate at room temperature 15. Add another 0.7 ul PMSF and incubate another 15. MATERIALSPBST: PBS (Phosphate-Buffered Saline) + 0.05% Tween20 Resuspension Buffer: PBST + 2mM EDTA + 0.1% bME Thrombin Cleavage Buffer: Any buffer between pH 7-8.5 with Ca+ is adequate. Try 50mM TRIS pH 8.0 + 150mM NaCl + 2.5mM CaCl2 + 0.1% bME 50% Glutathione Agarose Beads (GST Beads) 1.85g beads per 50ml: Rehydrate beads in large volume of water for at least an hour. Wash with several volumes PBST through Whatman filter on a Buchner funnel to remove maltose stabilizer. Collect gel and add equal volume of PBST. Store at 4C. Do not freeze - beads are fragile and ice crystals will destroy. Ampicillin: 1.0g/10 ml sterile H2O, filter 0.22mM, store at -20C in 1ml aliquots. Use 1:1000. IPTG: 0.1M stock solution: 0.238g/10ml sterile H2O, store at -20C in 1ml aliquots Alternate 5x solution: 5g/42ml PMSF: 0.3M stock solution in DMSO; use 1:1000 Kanamycin: 0.25g/10ml, use 1:1000 only for cells with pREP-4 plasmid! ORDERING INFOSigma: Glutathione beads, cat # G-4510 Sigma: Thrombin, 3560 NIH units/mg protein, cat # T-6759 ICN: AEBSF: #193503 NOTESbME should be freshly added when called for, as it is rapidly oxidized. PMSF should be added just prior to lysis of bacteria, as it is unstable in aqueous solutions. Instead of PMSF try less-toxic AEBSF. Stock solution: 0.2M in H2O, use 1:100 nSec1, a sticky protein, gives a higher yield if 0.5M NaCl is added to the resuspension buffer and 0.05% Tween20 to the Thrombin Cleavage Buffer. Since the resuspension buffer is already 150mM NaCl just add 0.35M NaCl. If you intend to freeze the pressed lysate, leave in the cell debris. Centrifuge it out prior to purification. Stirred Cell Concentrator: Soak new filter in ddH20 1 hour. Store at 4C in 20% ethanol 蛋白质凝胶电泳方法原理:蛋白质凝胶电泳用于分析蛋白质样品,尤其在蛋白质变性条件下用于净化含有超过一种蛋白质的混合物中特定成分,如核酸电泳法,每一个蛋白质的荷质比决定其通过凝胶的迁移速率.由于碳骨干分子是不带负电荷的,负电荷是由加入的 SDS为载体,凝胶电泳及缓冲区等提供的.负电荷的SDS结合蛋白骨架并变成蛋白质的一部分,SDS的数量与每一个蛋白质的分子量成正比,其迁移率经电泳与分子量成正比.但是分子量小于10KD的蛋白质,不具有与SDS结合的能力,因此需要根据分子量的不同改变电泳条件.电泳价加入核酸和蛋白质融合也可要求改变电泳条件以适应不同分子量大小的样品.出现这种情况的原因是,核酸成分常常有助于绝大多数均分子量和负电荷的分子融合,从而改变这些分子的电泳特性.在这里,我首先要讨论怎样编写和运行标准蛋白质凝胶,这一标准通常用于电泳大部分的蛋白质,接着我将讨论修改可用于分析小分子量的蛋白质或多肽的核酸蛋白电泳.标准蛋白质凝胶电泳原料Invitrogen has 10% (SDS) Acrylamide gels for sale if you have Biorad mini gel Electrophoresis equipment.30% Acrylamide stock (37.5:1 acrylamide:bisacrylamide) Tris Base and Hydrochloric Acid SDS Ammonium Persulfate TEMED Glycine EDTA 50% Glycerol b-Mercaptoethanol Bromophenol Blue Pre-Stained Molecular Weight Markers (optional); available from GIBCO-BRL PREPARING A PROTEIN GEL: Three basic reagents are required that can be prepared from the list of materials above: (1) acrylamide gel buffers, (2) electrophoresis buffer, and (3) sample loading buffer. 第一步 准备Protein-Gel Electrophoresis 通常我是采用20CM的玻璃盘制备蛋白凝胶,偶尔也会使用Hoffer mini-gel系统运行制备.标准蛋白凝胶通常有两层,最高层是浓缩胶,含有10-20% 的凝胶高度,浓缩胶中acylamide的含量比例比较低,一般为3.5-4.0%,缓冲液pH 为6.8.下层为acrylamide,包括剩余的凝胶,分离的凝胶.凝胶分离层中acrylamide的浓度根据待分离的样品不同进行设定.一般来说,所使用的是 8-15% acrylamide,分离胶的pH为8.8.浓缩胶与分离胶界面的PH和胶浓度的差，可以起浓缩样本的作用，并且可以提高分离胶的分辨率，使条带更窄更好看。有些人会省略浓缩胶.蛋白质凝胶的制备方法与核酸聚丙烯酰胺一样,不同的是浇注浓缩胶时要充分利用底部的间隔装置,凝胶要垂直浇注.将库存的30% acrylamide (37.5:1 acrylamide: bisacrylamide)稀释至浓度为1X的 stacking/separating gel buffer ,聚合时 isopropanol置于凝胶上,以提供一表面平滑的分离胶.凝胶完全凝固聚合后,注入isopropanol,并用纯水漂洗凝胶顶部,然后使用Whatman滤纸小心吸出凝胶及玻璃表面剩余的水.将梳子置于玻璃盘顶部,将堆叠层凝胶浇注于分离胶,这一步使用吸液管很容易做到,使acrylamide 溶液进入凝胶.设定蛋白质凝胶主要强调的一点是,除了像核酸凝胶一样要清洗电泳孔外,去除底部间隔装置必须清洗每一针头冲洗其内部气泡,否则会干扰到电泳.为解决这一问题,我的专用针孔是弯的,这样一来,针头就可以进入到凝胶缝隙.最后一个重要的注意事项是,凝胶使用的buffer不同于制胶使用的buffer 而是tris-glycine buffer，其浓度是1X.蛋白质凝胶电泳如人们所预期的,蛋白质凝胶电泳跟核酸凝胶电泳方法很相似,样品配制时用装载的buffer 稀释使buffer 的终浓度为1X.样品90C处理30 min ,然后加入凝胶 -这不是样品加载之前运行的.蛋白质凝胶电泳要比核酸凝胶慢,因此可能需要更长的电泳时间.电泳的条件是:20CM凝胶，电泳34小时,当然电泳所需的时间取决于样品性质.电泳的功率约为2-3 watts,电泳约30 minutes ,之后功率 增加到8-10 watts.通常我的做法是,使用markers对泳动样品进行标记,这样可以达到两个目的: (1)监控电泳过程,指示任何运行凝胶.(2)提供分子量标记,以便于让你标记所需要的电泳时间.固定干燥蛋白质凝胶电泳类似于核酸凝胶电泳，但蛋白质凝胶要注意浓缩层的辐射作用，并注意将辐射层销毁处理如果凝胶层中含有被 32P标记的样品，你也可以将其干燥处理后直接用于核酸凝胶电泳如果凝胶中含有35S蛋氨酸样品必须固定凝胶，洗净，扩增（使用Amersh