大学生科研-电磁辐射对大鼠学习记忆能力的影响及相关机.doc

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承 德 医 学 院大学生科研计划申请书项目名称：电磁辐射对大鼠学习记忆能力的影响及相关机制研究研究类别：应用基础申请单位（学生）：护理系申 请 人：徐阳星、张晓蒙、李玲玲、张品指导教师：李玉红、路国兵申报日期：2010年4月10日项目名称电磁辐射对大鼠学习记忆能力的影响及相关机制研究起止时间2010-4至2011-2申请经费1500.00元研究类别应用基础预期水平国内先进课 题负责人姓 名部 系 年 级所学专业徐阳星08护理本科护理指导教师职 称学 历学 位年 龄专 业教授研究生博士39病理学助理研究员研究生硕士27分子生物学项目内容摘要电磁辐射是继“三废”污染之后的第四大环境污染源。近年来随着移动通讯技术的飞速发展，移动电话微波电磁场使环境电磁场的分布特征日趋复杂，它对健康的影响越来越引起人们的重视。因此，对移动电话可能带来的健康风险进行评估是当前迫切需要解决的问题。移动电话产生的电磁场主要是指经极低频电磁场调制的频率在8002000 MHz的电磁场，平均功率密度约为6002170W/cm2，本课题模拟移动电话微波电磁辐射（900MHz），以2000W/cm2的功率密度对大鼠进行近场辐射，模型建立后，通过水迷宫检验电磁辐射对大鼠学习记忆能力的影响，通过透射电镜观察大鼠海马突触超微结构变化，利用免疫荧光组化、免疫印记等方法检测NMDAR表达情况，进而了解电磁辐射对大鼠学习记忆能力的影响。对阐明电磁辐射的生物学效应具有重要的理论价值，为电磁辐射的防护提供理论依据。一、立论依据（包括科学意义、应用背景、国内外研究现状分析、参考文献）随着科学技术的迅猛发展，在人类生存坏境中出现了越来越多的通讯、广播及其它电子设备，电磁污染对健康的危害日益受到人们的关注。目前来看，首先迫切需要解决的问题应是环境中人们接触机会较广、有一定潜在威胁的低场强电磁辐射，尤其是移动电话射频辐射的生物学效应问题1。由于神经元的易受损性、成熟神经元的不可再生性及其他未知因素，中枢神经系统对电磁辐射具有相当大的敏感性。 学习记忆是受多种因素调节的复杂生理过程，其中海马在学习记忆和控制神经行为活动中起关键作用。有研究表明，海马毁损会导致学习记忆功能障碍。LTP（long-term potentiation)是公认的研究与学习记忆有关的突触可塑性的重要实验模型。NMDAR是配体和电压双重依赖的离子通道，在形成 LTP过程中起关键作用2。国外主要侧重于电磁辐射对各种疾病致病性的研究，例如肿瘤、心血管疾病等。国内目前已有的实验研究报道已涉及低场强电磁辐射影响脑高级功能的多个方面，包括学习、记忆、情绪、睡眠等3。但具体是脑内哪一亚区在特定频率和场强的电磁辐射时主要受到相应影响？其具体的作用机制如何？目前还未完全阐明。因此，研究电磁辐射对人类精神方面及学习记忆能力的影响，寻找正确、有效的防治措施和方案对我们来说有重要的意义。参考文献：1史长华，路国兵，李玉红.电磁辐射对大鼠学习记忆能力和海马神经元形态的影响. 承德医学院学报，2009, 26（4）：356-358.2Jarrard LE. Selective hippocampal lesions and behavior: effects of kainic acid lesions on performance of place and cueJ.Behav Neurosci, 1983, 97(6)：873-889.3隋建锋，范郑丽.电磁场的神经生物学效应及机制研究进展.坏境与职业医学，2009,26(4)：409-416.二、研究内容（说明具体研究内容、拟解决的关键问题和创新点）1. 研究内容本项目拟从以下几方面进行研究：（1） 学习记忆障碍动物模型的建立用多功能电磁辐射检测仪功率密度均为 2000W/cm2。分别将试验大鼠装入自制暴露鼠笼，固定体位，头部接受频率为900 MHz 的连续微波辐射，每天将六个辐射组大鼠分别暴露20 min, 40 min, 1h, 2h, 3h, 4h ,连续暴露30天。假辐射组微波辐射功率密度为 0W/cm2。空白对照组大鼠不做任何处理。（2） 观察并检测大鼠的学习记忆功能 行为学检测（水迷宫实验）30d后，将各组的大鼠放到事先准备好的水迷宫中，观察各组大鼠的行为表现并记录大鼠走水迷宫的反应情况及完成全程所需要的时间。 形态学检测（硫堇染色） 采用硫堇染色法检测其海马神经元形态变化（3）突触超微结构观察与定量分析通过透射电子显微镜观察海马CA1区突触超微结构。（4）NMDA受体蛋白水平的表达检测 用免疫荧光组化的方法检测NMDA受体表达情况 提取海马组织总蛋白，采用 western-blotting法检测NMDA受体蛋白表达情况。2. 拟解决的关键问题电磁辐射对实验大鼠的学习记忆能力产生何种影响？其具体的作用机制如何？3. 创新点本研究首次从突触结构可塑性和功能可塑性两方面入手，研究电磁辐射对大鼠学习记忆能力的影响及具体的作用机制。三、研究方案（包括研究方法、实验方案、技术路线）研究方法和实验方案1. 学习记忆障碍动物模型的建立用多功能电磁辐射检测仪功率密度均为 2000W/cm2。分别将试验大鼠装入自制暴露鼠笼，固定体位，头部接受频率为900 MHz 的连续微波辐射，每天将六个辐射组大鼠分别暴露20 min, 40 min, 1h, 2h, 3h, 4h,连续暴露30天。假辐射组微波辐射功率密度为 0W/cm2。空白对照组大鼠不做任何处理。2. 大鼠的学习记忆功能检测（1）用Morris水迷宫测试各组大鼠的空间记忆能力 定位航行试验：辐射结束后第1d让大鼠自由游泳2min以适应周围环境。从辐射结束后第2d开始，连续4天对大鼠进行训练，每天训练4次，每次90s，随机选择东、南、西、北4个入水点，将动物面向池壁放入水中，记录动物寻找并爬上平台所需时间即逃避潜伏期。如果动物在90s内未找到平台，则将其引至平台，逃避潜伏期记为90s，将动物在平台上停留10s，再将大鼠放回起始点进行下一次训练。辐射结束后第6d对大鼠进行正式测试，记录逃避潜伏期和轨迹图。 空间探索实验：辐射结束后第7d撤去平台，记录60s内经过平台象限的次数，即为空间探测次数。 可见平台试验：为排除感觉或运动功能障碍对空间记忆学习的影响，最后进行可见平台试验。（2）海马组织形态学观察 各组大鼠连续辐射30天后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，快速断头取脑，脑组织于-24恒冷箱切片机中冠状连续切片，片厚5m，每隔6张取1张。行神经元尼氏体硫堇染色，二甲苯透明，中性树胶封固，于光镜下观察海马形态学变化。3. 突触超微结构观察与定量分析取试验大鼠断头取脑，迅速剥离海马，置于 2.5% 戊二醛溶液中。将其切成长轴垂直于海马皮层层次的长条形的组织块，继续在 2.5% 戊二醛溶液中预固定4 h，磷酸缓冲液冲洗，1%饿酸固定1 h，磷酸缓冲液冲洗，梯度酒精脱水，每级 7 min，无水丙酮置换，国产环氧树脂定向包埋，金刚刀超薄切片机切片切片 30 nm 50 nm。用柠檬酸铅、醋酸铀对切片进行双重染色，于透射电镜下观察海马神经毡区突触的数量和分布情况。观察时每组选取15个以上视野，拍摄Gray型突触40个以上。用 MIAS4.0 病理图像扫描分析系统对突触界面曲率、突触间隙宽度、突触后致密物质厚度和突触活性区长度进行定量分析。4. NMDA受体亚基NR1、NR2B在大鼠海马区的表达检测 采用免疫荧光组化法检测NMDA受体亚基NR1、NR2B在大鼠海马区的表达。大鼠腹腔麻醉，多聚甲醛灌注固定，断头取脑，冰冻切片机连续冠状切片，切片厚40m。对切片进行免疫荧光组化染色，二抗均选用FITC标记的羊抗小鼠IgG，通过激光扫描共聚焦显微镜观察NR1、NR2B、GluR1和GluR2在大鼠海马结构中的表达和分布情况。 采用免疫印迹法（weastern blots）检测NMDA受体亚基NR1、NR2B在蛋白的水平。称取海马组织，提取总蛋白，BCA法进行蛋白浓度定量，应用Western-Blot方法对大鼠海马组织GluR1的蛋白水平进行检测。上样量40g，10%SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，抗体孵育，采用化学发光法显色，用quantity one软件对蛋白条带灰度值进行分析。技术路线 提取组织总蛋白突触超微结构定量观察Western blotting法探讨电磁辐射对大鼠学习记忆的损伤机制水迷宫实验硫堇染色形态学检测行为学检测透射电镜观察NMDA受体表达检测电 磁 波 辐照Wistar大鼠免疫荧光组化四、预期目标（1）探明电磁辐射对大鼠学习记忆能力的影响，从突触结构可塑性和功能可塑性两方面综合解释电磁辐射对学习记忆的损伤机制。（2）熟练掌握免疫印记、免疫荧光组化等相关实验方法。（3）在指导老师的帮助下发表研究论文。五、研究进度安排（要求具体详细、切实可行）（1）2010-4到2010-6，造模，取材。（2）2010-7到2010-9，学习记忆功能检测，形态学观察（3）2010-10到2010-12，电镜观察，NMDAR蛋白表达检测（4）2010-12到2011-4，处理数据，撰写论文。六、经费预算年 度金 额使用说明2010-20111500用于购买实验动物，试剂等。七、参加人员及分工姓名性别专业职务分工张晓蒙女护理本科学生造模取材徐阳星男护理本科学生形态学检测李玲玲女护理本科学生电镜观察张品女护理本科学生NMDAR蛋白检测负 责 学生 所 在部 处 系意 见 （盖 章） 年 月 日 专 家 评审 委 员会 意 见负责人签字： 年 月 日大 学 生科 研 领导 小 组意 见（盖 章） 年 月 日 袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁膃蒃蕿袆肈蒂蚁虿肄蒁蒁羄羀肈薃螇袆肇蚅羃膅肆莅螆肁肅蒇羁羇膅薀螄袃膄蚂薇膂膃莂螂膈膂薄薅肄膁蚆袀羀膀莆蚃袆腿蒈衿膄腿薁蚂肀芈蚃袇羆芇莃蚀袂芆蒅袅螈芅蚇蚈膇芄莇羄肃芃葿螆罿芃薁羂袅节蚄螅膃莁莃薈聿莀蒆螃羅荿薈薆袁莈莈螁袇莇蒀蚄膆莇薂袀肂莆蚅蚂羈莅莄袈袄蒄蒇蚁