微生物遗传与变异.doc

第九章 微生物的遗传和变异 遗传和变异是生物的本质 各种生物亲代的性状传给下一代的现象称为遗传。 亲代与子代之间，子代各个体之间在形态结构或生理机能方面的差异称为变异。遗传是相对的，而变异是绝对的。 研究生物遗传与变异的科学称为遗传学。 微生物的遗传在本质上与高等生物基本相同，但又有其自身的特点，主要表现在： 1. 微生物细胞个体小，结构简单，容易受环境条件影响，个体容易发生变异，加之微生物繁殖速度快，有利于自然选择或人工选择变异株。 2. 微生物的化学组成简单（如病毒只有蛋白质，核酸，部分有脂质和多糖）有利于从分子水平进行遗传本质的研究。 3. 微生物繁殖快，世代时间短，可大大缩短实验时间。 4. 微生物的变异容易识别，例如营养缺陷型突变体较容易在不同营养成分的培养基上培养检出。 基于上述特点，微生物被广泛用作分子生物学和分子遗传学的研究材料，这些研究结果又大大推动了微生物学的发展。因此，微生物学目前已成为生物科学的前沿学科。第一节 遗传变异的物质基础 决定微生物遗传的物质是什么，这个生物学上的重要问题直到本世纪40年代通过用细菌和病毒作实验，才从根本上解决。一、 细菌的转化实验：证明遗传物质是核酸的实验有三个： 1. 细菌的转化实验 2. 噬菌体的侵染 3. 病毒的拆开和重建实验（TMV）1928年英国的细菌学家格里菲斯首先发现了肺炎球菌的转化现象。格里菲斯（Griffith）做了如下试验：肺炎球菌有光滑型（S型）和粗糙型 (R型) 两种不同类型，每类型中又有不同血清型： S RS（光滑型） S R（粗糙型） RS RR型活菌 注射健康的小白鼠 鼠不死 S 型活菌 注射健康的小白鼠 鼠死亡S 型60加热杀死菌体 注射健康小白鼠 鼠不死S 型60加热杀死菌体 混合注射健康白鼠 鼠死亡 R型活菌 从中分离出活的S 型菌 Griffith 称这一现象为转化现象，至于转化因子是什么，Griffith没有作出回答。 1944年美国科学家Avery 等人在Griffith的工作基础上，做了如下实验: 培养后分离出现S型菌R菌多种蛋白酶处理S型菌灭活细胞破碎液 + + 出现S型菌培养后分离R菌不处理S型菌灭活细胞破碎液 + + S型菌灭活细胞破碎液 没有S型菌出现培养后分离R菌DNA酶处理 + + 上述试验证明了生物体内决定遗传的物质是DNA。二、DNA的结构与复制： 华特生和克里格（Watson and Crick）1953年提出了DNA双螺旋的结构模型，对DNA分子的空间结构，DNA的自我复制，DNA的相对稳定性与变异性以及DNA对遗传信息的储存与传递等都有了较好的解释，从而为分子遗传学奠定了基础。 DNA由四种核苷酸组成，每一种核苷酸均含环状碱基，脱氧核糖和磷酸根三种组分。四种核苷酸的差异仅在于碱基不同。四种碱基即： 腺嘌呤（A），乌嘌呤（G），胸腺嘧啶（T），胞嘧啶（C）。 四种碱基构成四种核苷酸： 腺苷酸、乌苷酸、胸腺嘧啶核苷酸和胞嘧啶核苷酸。 DNA分子就是许多由单个核苷核形成的多核苷酸长链。两条多核苷酸链彼此以一定空间距离，在同一轴上互相盘旋而形成一个双螺旋式扶梯，扶手代表两条磷酸、糖链，每条链均由脱氧核糖磷酸脱氧核糖磷酸交替排列构成。每条长链的侧面是碱基，由脱氧核糖同它们连接，两条链的两个碱基之间则以氢键连接，宛如一个梯蹬。氢键的连接很弱，但数量很大，可以维持稳定的螺旋结构。 由氢键连接的碱基组合称为碱基配对，即A-T配对，G-C配对，表现为特异性的互补关系，DNA分子中共有四种碱基对，即A-T,T-A,G-C,C-G。A-T之间有两个氢键，G-C之间有三个氢键。 一个DNA分子含有几十万或几百万碱基对。各对碱基上下之间的距离为0.34nm。每个螺旋包含10对碱基，共长3.4nm。 为了确保细胞DNA 中的核苷酸碱基顺序在传代中精确不变，以保持所有属性的遗传，在细胞分裂前，DNA必须精确复制。其复制过程首先是DNA的双链从一端开始，氢键逐渐裂开，分离成两条单链，通过碱基配对逐渐建立起完全互补的一套核苷酸单位，新连接上的多核苷酸链与原有的多核苷酸链重新形成新的双螺旋，这样在DNA聚合酶的催化下，一个DNA分子最终复制成两个结构完全相同的DNA分子，从而准确控制了物种的遗传性状。复制后的DNA分子，各由一条新链和一条旧链构成双螺旋，所以称为半保留复制。三、遗传因子基因1. 什么是基因：在生物学上，细胞是生命的基本单位，而基因则是遗传的基本单位。一切具有自主复制能力的遗传功能单位都称为基因。它的物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的DNA片段。 一个DNA分子含有许多基因，不同基因分子所含碱基对的数量，（一个基因平均一般约含1000个碱基对）和排列顺序都不相同，从而控制了不同的遗传性状。如果一个基因的碱基组成或排列顺序发生变化，那么这个基因将失去其正常功能，并导致生理缺陷，性状改变或死亡。遗传学中对这样一个完整的基因功能单元也称为顺反子（或作用子）。 结构基因：用于编码酶的结构 主要基因基因 调节基因：用于调节酶的合成 重复基因：DNA片段重复种类 插入顺序IS因子 跳跃基因：可在DNA上转 移位置的基因 转座子Tn因子2、微生物中基因的存在形式： 染色体：染色体含有大量不同的基因，少到三个，多到几百个或几千个，是遗传信息的主要储藏场所。 质粒：质粒是较小的环状DNA分子，或游离于染色体外，或与染色体结合。质粒所决定的遗传性状不象染色体基因那样所决定的性状为细菌生活所必须。所以质粒的消失不会导致菌体死亡。质粒可作为基因转移的载体。 线粒体 链线粒体基因组可编码一些为线粒体呼链所需的酶 存在真核生物中，它们携带着相应的基因。 叶绿体 酵母菌2m质粒 它是酵母菌进行分子克隆和基因工程的载体 卡巴颗粒（共生生物） 3、 基因的表达 基因贮存的遗传信息是不是都能够通过传递过程全部地同时表达出来呢？不是这样的.在生物的生命活动中，有些基因是随生物的生长发育的不同时期，分期表达的。（1） 等位基因及其表达： 等位基因是指染色体上位置相同的基因。等位基因在细胞中的存在与表达有以下几种形式： a. 对抗性的：只有一个基因能够表达 在真核生物 显性基因表达 （ b. 非对抗性的：两个显性，两个隐性。 等位基因 在M.细胞中的存在 与表达 在原核细胞中 在完全单倍体原核细胞中，等位基因的 概念是指决定某一性状的基因在野生型菌株和突变型菌株中是否都存在。 (2) 结构基因和调节基因 一个基因决定一个酶，这是早期生化遗传学的理论。而酶是怎样产生的？它是由DNA上的碱基顺序通过转录和翻译产生的。因此，人们把DNA上决定多肽形成的碱基顺序称为结构基因。 研究工作的进展发现：有些碱基顺序片段并不能直接转录，翻译成多肽，而是对结构基因的功能起调节，控制作用。DNA上这类调节，控制结构基因功能的碱基顺序片段称为调节基因。 (3) 操纵子和操纵基因： 一个操纵子是一段DNA碱基顺序，包括一个操纵基因和一个或几个结构基因。 操纵子的模型是雅各布和莫诺1961年提出的，根据这一模型基 因有结构基因，调节基因，操纵基因和启动基因之分，基因的活动受调节系统控制，而这种控制又与环境因子有关，如乳糖操纵子。 乳糖操纵子是负调控模型。 大肠杆菌中乳糖操纵子负调控模型 在负调控中，调节基因产物不与操纵基因结合时，结构基因表达。与乳糖操纵子相比，大肠杆菌麦芽糖操纵子是正调控的典型例子，这里麦芽糖是诱导物，激活蛋白只有与麦芽糖结合时才能与DNA的特殊结合位点结合，促使RNA聚合酶开始转录。 在正调控中，调节基因产物激活蛋白只有与启动子结合时，结构基因才转录。四、遗传信息的传递： DNA上贮存的遗传信息需要通过一系列物质变化过程才能在生理上或形态上表达出相应的遗传性状。在遗传信息的传递中，主要的形式是DNA上贮存的遗传信息通过RNA的中间作用指导蛋白质的合成。这就是分子遗传学中的“中心法则”。反转录V.是违反中心法则的特殊例子。它从 RNA DNA RNA 蛋白质。 遗传密码：组成蛋白质的aa有20种，而组成核酸的碱基只有四种，那么，四种碱基的排列顺序如何发出将20种aa按照特定的顺序合成特定的蛋白质信号呢？人们通过理论推算和实验证明，三个碱基决定一个aa，遗传密码如下表： 20 种氨基酸的遗传密码表第一位碱 基第二位碱基第三位碱 基UCAGU苯丙氨酸（Phe）苯丙氨酸（Phe）亮氨酸（lea）亮氨酸（lea）丝氨酸（ser）丝氨酸（ser）丝氨酸（ser）丝氨酸（ser）酪氨酸（Tyr）酪氨酸（Tyr）终止密码（UAA）终止密码（UAG）半胱氨酸（Cys）半氨酸（Cys）终止密码（UGA）色氨酸（Try）UCAGC亮氨酸（lea）亮氨酸（lea）亮氨酸（lea）亮氨酸（lea）脯氨酸（pro）脯氨酸（pro）脯氨酸（pro）脯氨酸（pro）组氨酸（His）组氨酸（His）谷氨酰胺（Gln）谷氨酰胺（Gln）精氨酸（Arg）精氨酸（Arg）精氨酸（Arg）精氨酸（Arg）UCAGA异亮氨酸（1lea）异亮氨酸（1lea）异亮氨酸（1lea）甲硫氨酸（Met）(起始密码AUG)苏氨酸（Thr）苏氨酸（Thr）苏氨酸（Thr）苏氨酸（Thr）天门冬酰胺（Asn）天门冬酰胺（Asn）赖氨酸(lys)赖氨酸(lys)丝胺酸（Ser）丝胺酸（Ser）精氨酸（Arg）精氨酸（Arg）UCAGG缬氨酸（Val）缬氨酸（Val）缬氨酸（Val）缬氨酸（Val）丙氨酸（Ala）丙氨酸（Ala）丙氨酸（Ala）丙氨酸（Ala）天门冬氨酸（Aspn）天门冬氨酸（Aspn）谷氨酸（Glu）谷氨酸（Glu）甘氨酸（Gly）甘氨酸（Gly）甘氨酸（Gly）甘氨酸（Gly）UCAG 多个密码子决定一个aa的现象称为简并密码。AUG 为起始密码，UAA， UAG， UGA为终止密码。第二节 细菌的基因重组 凡是把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子的重新组合后，形成新遗传个体的方式，称为基因重组或遗传重组。重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新的遗传型个体。 重组是分子水平的概念，可以说是遗传物质在分子水平的杂交。而一般所说的杂交是细胞水平的杂交 转化 转导 原核微生物基因重组 接合基因重组包括 原生质体融合 有性杂交 真核微生物基因重组 准性生殖 原核微生物的基因重组包括：一、转化 转化是游离DNA片段的转移和重组，这些游离的DNA片段称为转化因子。 遗传转化是指同源或异源的DNA分子（质粒DNA和染色体DNA）被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达水平的基因转移过程。转化后的受体菌，称为转化子。 转化的条件是：受体菌必须是感受态才能接受转化因子，感受态既可以是自然的，也可以是人工的。转化因子通常是双链DNA。 感受态：受体菌最容易接受外源DNA片段并实现转化的生理状态称为感受态。 细菌感受态的出现是因为它们能合成一种感受态因子，这种因子是一种蛋白质，能使转化因子结合在细胞表面。 转化包括如下步骤： 感受态的出现转化因子的吸附与掺入转化因子的整合转染：用噬菌体DNA转化细菌称为转染。它与转化不同的是，转染不产生具有杂种性质的转化子。自然转化CaCl2处理法人工转化转化分为电穿孔法二、转导： 通过缺陷噬菌体为媒介，把供体菌的DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者获得了前者部分遗传性状的现象称为转导。 缺陷噬菌体：带有细菌DNA片段而失去了部分自身DNA的噬菌体称为缺陷噬菌体。 完全转导 普遍转导 流产转导转导分为 低频转导 局限转导 高频转导 1普遍转导： 噬菌体在组装时可以误包供体菌的任何基因（包括质粒），从而使受体菌实现各种性状的转导，称为普遍转导。 完全转导：得到稳定转导子的转导。 流产转导：得到不稳定转导子的一类转导。在流产转导中，转导子通过细胞分裂形成两个子细胞时，只有其中一个获得供体基因，而另一个细胞并没有获得供体基因，因而仍属受体基因型。流产转导的结果导致单线遗传。 转导子：获得了由噬菌体携带来的供体菌DNA片段的受体细胞称为转导子。 转导因子：在转导中被转移的染色体片段。沙门氏菌亮氨酸缺陷型（leu-）的普遍转导和流产转导见图。 2局限转导：（专性转导） 通过某些部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中的转导现象。 噬菌体DNA可以组合到宿主细胞染色体上，这种组合有特定位点，噬菌体整合在gal基因和bio基因之间，正常切割时只切下噬菌体DNA。 不正常切割时，切割下来的片段带有部分DNA和旁边的宿主染色体DNA（gal基因和bio基因）。 不正常切割的DNA被外壳蛋白色被，当这种V.粒子从寄主细胞释放出来，再感染缺陷型受体菌时，可能出现： dgal感染 gal- 缺陷型受体菌，使gal- 变为gal+ 。 bio感染 bio- 缺陷型受体菌，使bio- 变为bio+ 。局限转导又分低频转导：出现较少转导子的转导过程。如上述dgal 的转导频率只有10-4 10-6。这种转导是溶源性细菌经诱导后释放出的噬菌体进行的转导。 （专性转导） 高频转导：在局限转导中出现较多转导子的过程。缺陷噬菌体和噬菌体使缺陷型细菌（如gal）发生双重溶原后经UV.诱变出现大量转导子的现象。 三、接合： 通过供体菌和受体菌细胞间的直接接触而传递大段 DNA的过程称为接合。已发现接合现象的微生物有（1）细菌：大肠杆菌，沙门氏菌，志贺氏菌，赛氏杆菌，弧菌，固氮菌，克氏杆菌，假单胞菌。（2）放线菌：链霉菌，诺卡氏菌。 1接合的发现 细菌的接合现象是美国科学家Lederberg 1946年用两株大肠杆菌的营养缺陷型证实的。A+B+C-D-,A-B-C+D+分别接种在基本培养基中不长，混合培养在基本培养基中时，有菌生长，有菌生长说明两菌之间进行了遗传物质的重组。为了排除转化引起的生长，有人又做了如下试验 左右两边的缺陷型菌株的DNA可以通过滤板，但菌体不能通过，细菌不能接触。经过一段时间以后，左右两边分别接入基本培养基，两边的菌都不生长，排除了转化的可能。 后来科学工作者们在电镜下看到了E.coli的接合现象，它们是靠性菌毛进行接合的。2.F因子与接合：F因子是E.coli中的致育因子（性别因子），是一种性质粒，由环状DNA组成。F因子以以下几种状态存在于E.coli细胞中。F+：细胞中含有游离的F因子，称为雄性菌株。Hfr：细胞中的F因子整合在染色体上，称为高频重组菌株F：当Hfr菌体内的F因子不正常切割而脱离细菌染色体时，可形成游离的但带有一小段细菌染色体基因的F因子，此称 F。雌性菌株不含F因子称为F。当 F+ F F+ F 2 F+ F F 接合时，出现如下几种结果：F F 2 F Hfr F Hfr F Hfr + F（多数） 2 Hfr（少数）当Hfr与F-菌株接合时，Hfr染色体由环状变为线状，整段线状染色体移至F-细胞内大约要100分钟，在转移时，由于振动等种种原因。线状染色体转移时容易发生断裂，由此人们设计了中断杂交法来作大肠杆菌染色体的遗传图谱。中断杂交实验如下图：四、原生质体融合 通过人工的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合并产生重组子的过程。称为原生质体融合或细胞融合。 原生质体：植物细胞，细菌细胞去掉细胞壁后的球状体称为原生质体。检出重组子菌落（A+B+）长出菌落发生融合原生质体（A+B-）（A-B+）混 合原生质体（A+B-）原生质体（A-B+）细胞（A+B-）细胞(A-B+)微生物细胞融合的研究开始于1976年，其一般原理和主要过程是：第三节 真菌的基因重组一、有性杂交 杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。 有性杂交：指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种方式。 凡能产生有性孢子的酵母和霉菌都可用有性杂交的方法进行育种。 酵母细胞有三种交配型： MATa和MAT，这两种细胞能够相互交配形成第三种交配型MATa/。 MATa/细胞不能与MATa和MAT中的任何一种交配。一般情况下，菌株MATa和MAT为单倍体，菌株MATa/为二倍体，但有时也不一定，故不能仅仅从染色体的倍性来判断细胞的交配型。例如：一株交配型MATa的酿酒酵母：产酒力强，利用麦芽糖和葡萄糖能力弱，以A+B-表示另一株交配型MAT的面包酵母：产酒力弱，利用麦芽糖和葡萄糖能力强，以 A-B+表示 酿酒酵母是利用山芋和糖蜜作原料进行酿酒，若此菌既可利用山芋，糖蜜，又可利用麦芽糖和葡萄糖的话，则酿酒酵母酿酒以后，还可用于家庭和工厂生产面包，从经济效益上讲是很合算的，为此用杂交的方法获得了理想菌株。 通过杂交产生了四个子囊孢子，其中两个是亲本型，两个是重组型。挑取这些重组单倍体接斜面，逐个测定其接合型和遗传性状。 酵母菌杂交育种的过程如下：1从两亲本中获得单倍体菌株：将双倍体细胞接种于生孢子培养基产生子囊孢子 加液体石蜡研磨破子囊 离心让孢子悬浮在石蜡层中 涂平皿获得单倍体菌落单倍体酵母菌和双倍体酵母菌在形态上有区别，可区别开来。双倍体单倍体细胞大，椭园形小 球形菌落大，形态一致小 形态变化多液体培养繁殖快，细胞较分散繁殖慢，细胞较聚集生孢子培养基上培养形成子囊不形成子囊 2测定甲、乙两亲本菌株单倍体的接合型和遗传性状。 3选取不同优良性状和不同接合型的甲、乙两菌株进行杂交。 4在杂交菌株中选出符合需要的优良菌株保藏。二、准性生殖：准性生殖是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。它可使同一生物的两个不同来源的体细胞经融合后，不通过减数分裂而导致低频率的基因重组。准性生殖包括： 菌丝联结。异核体形成。核配。体细胞交换和单配体化 四个阶段。1.菌丝联结：两个不同性状的菌丝相互联会。 2异核体的形成： 当具有不同性状的两个细胞或者两条菌丝相互联结时，导致在一个细胞中或一条菌丝中并存有两种或两种以上不同遗传性状的核。 在异核体中，由于两种遗传型不同的核并未融合，因此能分离出两个亲本型菌落。但由于两个亲本菌株的细胞质发生了融合，所以在分离出来的亲本型菌落中能表现出由母细胞细胞质控制的遗传性状。 3核配： 异核体菌丝在繁殖过程中偶尔发生两种不同遗传型核的融合，形成杂合细胞核，杂合细胞核是双倍体。 4体细胞交换和单倍体化： 杂合二倍体只有相对的稳定性，在其繁殖过程中虽不进行减数分裂，但在有丝分裂中可以发生染色体交换和染色体单倍化，从而形成各种分离子。 第四节 基因突变和诱变育种一、基因突变 微生物的变异包括基因突变和基因重组。1.突变：指DNA上的核苷酸顺序发生了稳定的，可遗传的变化。 基因突变：DNA链上一对或少数几对碱基发生改变而引起。突变包括 染色体畸变：DNA链的大片段损失。 自发突变：在自然条件下发生的基因突变，细菌的自发突变频率为10-5-10-7 突变分为 诱发突变：利用物理化学因子处理微生物使其产生的突变。 回复突变：突变菌株发生突变，回复到出发菌株的状态。 2.微生物突变体的种类： 突 变 A色素突变体：如赛氏杆菌产生红色素 不产色素菌株 突 变 B无荚膜突变体：如肺炎球菌有荚膜 无荚膜菌株 突 变 C营养突变体：如E.coliTrp+（色氨酸） E.coliTrp-（色 AA缺陷型） 突 变 D发酵突变体：如E.coli发酵乳糖 E.coli不发酵乳糖 E抗性突变体：如抗药物，抗噬菌体，抗辐射突变体等。3.突变的机制： 突变的机制可概括为： 突变机制：转换：DNA上一个嘌呤被另一个嘌呤或 碱基置换 者一个嘧啶被另一个嘧啶所替代 颠换：DNA上一个嘌呤被一个嘧啶替代或者一个嘧啶 被另一个嘌呤替代 点 突 添加 DNA分子中多了或少了一个或变 几个碱基，导致编 码aa三联密码发生了改变，从而引起突变。诱 缺失发 移码突变 如：GGG AAA UUU AAA CCC 突 甘 赖 苯丙 赖 脯 变 加一个碱基后就变成了： AGG GAA AUU UAA ACC C 精 谷 异亮 终止 添加：abc X defg 缺失：abc D efg 畸变（染色体大损伤） 重复：abc abc de （由X射线等的辐射烷 移位：abc par de化剂，亚硝酸等引起） 倒位：abc fed g （1）移码：在自然条件下，DNA分子中发生了一对或少数几对核苷酸的增加 或缺失导致移码。 自 （2）转位因子：在染色体和质粒上有一段顺序能从一个位点发 转到另一个位点， 导致碱基顺序发生变化引起突突 变。变 （3）互变异构效应：T也会以稀有的烯醇式出现，DNA复制到达这位置时T 就 会与G配对。 （4）环出效应： 4突变体的筛选： （1）青霉素浓缩法： 完全培养基：基本培养基中加入了天然物质（蛋白胨，酵母膏等），能满足各种营养缺陷型M.生长的培养基。 基本培养基：只含有野生型菌生长繁殖所必须养料的合成培养基叫基本培养基。 用基本培养基培养细菌，并在其中加入青霉素，由于青霉素只能抑制生长着的细菌，故只杀死在基本培养基中生长的野生型细菌，而营养缺陷型突变体因不能在基本培养基中生长，青霉素对它们不起作用而被保留下来。 （2）菌丝过滤法：把霉菌和放线菌的孢子放在基本培养基里生长，这时只有野生型菌会萌发长出菌丝，而缺陷型孢子不会长成菌丝，通过过滤可除去野生型菌丝，而保留突变体孢子。( 3 )梯度培养法：这种方法适用筛选抗性突变体。二、诱变育种诱变育种就是利用物理，化学等诱变因素，诱发基因突变，然后根据育种目标，从无定向的突变株中，筛选出某一优良性状的突变株。1、物理诱变： UV. X-射线 用得较多，用得最多的是UV. r-射线1）物理诱变因素有： 快中子 -射线 激光（近来在研究使用）2）辐射诱变机制：AUV诱变机制：a. 引起DNA链的断裂，破坏核糖与P之间的键联。b. 胞嘧啶和鸟嘌呤的水合作用。使H键断裂c.形成胸腺嘧啶（T）二聚体，使 H键断裂BX-射线，r-射线作用机制： X-射线，r-射线照到细胞上，可以直接打击核酸，使核酸电离，造成DNA分子断裂，或者碱基间的氢键断裂，或者使碱基降解。另一方面是细胞中的水分子受到辐射后产生自由基，自由基使核酸产生次生电离。3）辐射剂量：辐射剂量= 辐射强度 时间UV诱变育种时，通常是用15瓦紫外灯下30cm处用照射的不同时间来表示紫外线的剂量。亦可用15瓦紫外灯固定时间改变距离表示。 X-射线 伦琴/秒 用 伦琴/分 表示。（即单位时间所吸收的射线能量） r-射线 伦琴/时4）影响辐射效应的因素：A 氧效应：较高的氧分压能提高对X-射线的效应，但对UV影响不显著。B 光复合作用：把经UV照射后的微生物暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象称为光复活作用。所以微生物经UV处理后应在暗处培养。 经照射后的DNA的损伤也可在暗处被活细胞内的修饰酶系统修复。C. 某些药物对辐射诱变有保护和消除作用。 丙酮酸 再照射 琥珀酸 + 细菌一起培养 死亡率降低，说明有保护作用。 葡萄糖2、化学诱变： 许多有机和无机药物对M.都有诱变作用。但效果较好的只有：亚硝酸、羟胺、乙烯亚胺、硫酸二乙酯，氮芥、亚硝基胍、吖啶黄、吖啶橙、碱基类似物等。（1） 几种化学诱变剂的作用机制：A 亚硝酸 亚硝酸是作用于含有NH3基的碱基，引起碱基对的转换。腺嘌呤（A）经氧化脱氨后变成次黄嘌呤， 次黄嘌呤有烯醇式和酮式二种状态， 当它处于烯醇式（He）状态时与T配对，处于酮式时与C配对： He A He ： （正常） ： HNO2 (烯醇式) T T HK HK HK ： （酮式） C G ： CB 羟胺 羟胺作用于胞嘧啶，经羟胺作用后的胞嘧啶不与乌嘌呤（G）配对，而是与腺嘌呤配对，这样C：G碱基对就转化成了T：A碱基对。 C C:A A:TC：G 羟胺 G G:CC 碱基类似物5-Br尿嘧啶 5-Br尿嘧啶的结构与胸腺嘧啶类似，它可代替T与A配对，5-Br尿嘧啶可以以酮式和烯醇式两种形式存在，且出现烯醇式的机率更多，而烯醇式的5-Br尿嘧啶与G配对，导致A：T转换成G：C。 5-Bue (烯醇式) 5-Bu 5-Buk（酮式）正常态 A A ： A TT ： 5 - Bu：A Buk Bue 当5 - Br尿嘧啶以烯醇氏形式存在时 便与Buk G配对。 G ： C （2） 化学诱变的处理程序：A. 制备诱变剂：大多数诱变剂是不稳定的化合物，应在使用时临时制备。B选择适当的处理剂量 所谓处理剂量是指处理因素对微生物的生物学效应。可分为：致死剂量：将微生物全部杀死的剂量亚致死剂量：将M大部分杀死，只留下很少的活菌体，如杀死99%以上，存活不到1%，或者杀死90%以上，存活在10%以下。 弱致死剂量：杀死一大半，存活一小半，如杀死50-70%，存活30%-50%诱变处理一般选用亚致死剂量。C选择适当的pH值和温度D终止反应：一般采用大量稀释的方法，亦可加化学物质使诱变剂的作用停止。（3） 最常用的几种化学诱变剂的处理参数：诱变剂名称性状作用浓度处理时间（分）缓冲液终止反应方法亚硝酸无色液体0.01-0.1mol5-10分pH4.5 1mol磷酸缓冲液pH8.6 0.07molNa2HPO4硫酸二乙酯无色液体0.5-1% (v/v)孢子 0.1% (v/v)15-20分孢子18-24小时pH7磷酸缓冲液硫代硫酸钠或大量稀释N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍黄色固体0.1- 1mg/ml孢子3mg/ml15-60分孢子90-120分pH6.0 1mol磷酸缓冲液或Tris缓冲液大量稀释羟胺0.1-5.0%数小时或生长过程中诱变稀释3. 突变体的筛选 （1）初筛：对单个菌落进行有关性状的测定，常用平板法，从中选出性状优良的菌落。 （2）复筛：对初筛出的菌株进行有关性状的进一步扩大测定，复筛一般在摇床上进行。三、突变率：突变率就是每一个细胞每一世代中发生突变的机率。不同微生物或者同种微生物在不同的情况下突变率不同。一般来说，自发突变的机率约为每个细胞每十万次分裂到千万次分裂产生一次突变。用10-5-10-6表示。第五节 微生物与基因工程一基因工程原理（一）概念：基因工程是指在基因水平上的遗传工程，它是用人工方法将所需要的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来，在离体条件下进行切割后，把它和作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，以让外来的遗传物质在其中“安家落户”进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新育种方法。（二）基因工程步骤： 1分别提取供体细胞DNA和载体质粒DNA 2用专一性很强的限制性核酸内切酶对上述供体DNA和体质粒进行切割，使其露出粘性未端便于连接。 3用“退火”的方法进行体外重组，即把供体细胞的DNA片段和质粒DNA片段放在试管中，在5 6温度下混合“退火”。两DNA的粘性未端上的碱基发生互补，靠氢键连接。 4外加连接酶，使供体DNA片段与质粒DNA片段的裂口处被缝合，形成有复制能力的环状重组DNA即“杂种质粒” 5把“杂种质粒”与感受态受体细胞混合进行转化，将供体菌的遗传基因导入受体细胞内。 6“杂种质粒”进入受体细胞后通过自主复制而扩增并使受体细胞表达出供体DNA所固有的部分遗传性状。这就是“工程菌”。 7从上述大量的“工程菌”中筛选出符合需要的个体。二微生物与克隆载体： 基因工程中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括六大类：质粒载体噬菌体载体柯斯质粒载体 M13噬菌体载体真核细胞的克隆载体 人工染色体（一） 、质粒克隆载体质粒载体的特性（1）具有独立复制起点（2）具有较小的相对分子质量（3）具有较高拷贝数（4）具有便于选择的标记（5）易于导入细胞（6）具有安全性 质粒pBR322质粒pBR322是环状双链DNA分子，由4361bp组成，可插入外源DNA大小5kb左右，外源DNA若超过10kb质粒在复制时就会不稳定。(二)、噬菌体克隆载体噬菌体载体是基因工程中一类很有价值的克隆载体，具有如下优点：1.它的分子遗传学背景十分清楚；2.噬菌体载体的容量较大，一般质粒载体只能容纳10多个kb，而噬菌体载体却能容纳大约23kb的外源DNA片断；3.具有较高的感染效率，其感染宿主细胞的效率几乎可达100%，而质粒DNA的转化率却只有0.1%。（三）、柯斯质粒载体柯斯质粒载体（cosmid vector）即粘粒载体，是由噬菌体的粘性末端和质粒构建而成。柯斯质粒载体的优点：1.具有噬菌体的高效感染力，而在进入宿主细胞后不形成子代噬菌体仅以质粒形式存在；2.具有质粒DNA的复制方式，重组DNA注入宿主细胞后，两个cos位点连接形成环状DNA分子，如同质粒一样进行复制；3.具有克隆大片段外源DNA的能力，这是柯斯质粒的最大优点。柯斯质粒本身一般只有57kb左右，而它克隆外源DNA片段的极限值高达45kb，远远超过质粒载体及噬菌体载体的克隆能力。（四）、 M13噬菌体载体M13是大肠杆菌丝状噬菌体，其基因组为环状ssDNA，大小为6407bp。感染雄性（F或Hfr）大肠杆菌并进入细胞后，转变成复制型（RF）dsDNA，然后以滚环方式复制出ssDNA。野生型M13不适于作为克隆载体，因此人们对野生型M13进行了改造，构建了一系列M13克隆载体。M13载体克隆外源DNA的能力较小，一般只适于克隆300400bp的外源DNA片段，它的突出优点是，特别适合用于制备克隆基因的单链DNA。因此，它主要被用于制备测序用单链DNA模板、特异的单链DNA探针，定位诱变等。（五）、噬菌质粒载体噬菌质粒（phagemid或phasmid）是由丝状噬菌体和质粒载体DNA融合而成，兼有两者优点，这类载体具有来自M13或f1噬菌体的基因间隔区（内含M13或f1噬菌体复制起点）和来自质粒的复制起点，抗药性标记，一个多克隆位点区等。噬菌质粒载体在应用上具有如下优点：1.载体本身分子小，约为3000bp，便于分离和操作；2.克隆外源DNA的容量较M13噬菌体大，可克隆10kb外源DNA片段；3.可用于制备单链或双链DNA，克隆和表达外源基因。（六）、真核生物的克隆载体酵母质粒载体酵母质粒载体都是利用酵母的2m质粒和其染色体组分与细菌质粒pBR322构建而成的，能分别在细菌和酵母菌中进行复制，所以又称为穿梭载体。（七）、人工染色体酵母人工染色体（teast artificial chromosome,YAC）是一类目前能容纳最大外源DNA片段人工构建的载体。三微生物与基因工程工具酶（一） 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ）或简称为限制性酶（restriction enzyme）是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。1、限制性核酸内切酶的命名与分类根据限制酶识别和切割DNA的特点，可将限制酶分为、三种类型。型和型由于无切割特异性或特异性不强，故不用于基因工程。型限制酶的限制修饰系统分别由限制酶和修饰酶两种不同的酶组成，仅需Mg2作为辅助因子，切割位点位于识别位点之内或在附近，特异性最强，用处最大，是基因工程重要工具酶，通常所说的限制性核酸内切酶，即指此类酶。2、限制性核酸内切酶的基本特性型限制酶的识别序列通常由4-8个碱基对组成，它们具有二重旋转对称轴，这些碱基对的序列呈回文结构（palindromic structure）。所有限制酶切割DNA后，均产生含5磷酸基和3羟基的末端。限制酶作用所产生的DNA片段有以下两种形式：（1）、形成粘性末端（cohesive end）（2）、形成平末端（blunt end）（二）、DNA连接酶DNA连接酶（DNA ligase）与限制性内切酶一样，也是由微生物产生。主要来自T4嗜菌体和大肠杆菌。DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5端磷酸与3端羟基之间形成磷酸二酯键。它既能催化双链DAN中单链切口的封闭，也能催化两个双链DAN片段进行连接。DNA连接酶主要有两种：一种是T4DNA连接酶，另一种是大肠杆菌DNA连接酶。四、微生物作为克隆载体的宿主（一）、宿主的基本要求与性质 对于克隆基因而言，一个理想宿主的基本要求是：A.能够高效吸收外源DNA;B.具有使外源DNA进行高效复制的酶系统；C.不具有限制修饰系统，故不会使导入宿主细胞内未经修饰的外源DNA发生降解；D.一般为重组缺陷型（RecA）菌株，使克隆载体DNA与宿主染色体DNA之间不发生同源重组；E.便于进行基因操作和筛选；F.具有安全性。宿主细胞应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。（二）、原核生物宿主目前几乎所有的有关重组DNA的研究工作均利用大肠杆菌作为克隆基因的宿主。但它是条件致病菌，故存在潜在的致病性。