植物细胞工程2(中国药科大学生物工程所有课件).ppt

第四节 植物原生质体培养技术 除去纤维素外壁且具有生活力的裸体植物 细胞称之为植物原生质体。 影响原生质体产量和活力的因素 1、材料的来源 2、前处理 3、酶处理 4、渗透压 1、材料的来源 l叶片 l愈伤组织 l培养细胞 2.前处理 A、材料用黑暗处理、低温处理和不同光质照射 B、消毒 C、保证酶解充分进行，促使酶溶液渗入到叶片的细胞 间隙中。 3、酶处理 l纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶 酶解时间 酶浓度 酶解温度 酶处理效果 4.渗透剂 在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其 作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。 糖溶液系统 盐溶液系统 l机械法 l酶消化法 原生质体分离 A、两步法分离植物原生质体 先用果胶酶离析植物组织，使植物细胞从组织中分离 出来，然后收集细胞洗涤后用纤维素酶解离细胞壁获得原 生质体 B、一步法分离 把一定量的纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对材料 进行一次性处理。 原生质体活力测定 目测法目测法 活体染色法活体染色法 荧光染料活体染色法荧光染料活体染色法 第五节 植物细胞融合技术 （体细胞杂交） l在外界因素作用下，使两个或两个以上植物细胞合并成 一个多核细胞的过程。 Fusion phases of oat protoplasts (Avena sativa) 1978年德国科学家梅歇尔 斯等人把马铃薯(potato)和 番茄(tomato)的原生质体 融合获得了体细胞杂种“泡 马豆”（pomato) 一、诱导融合的方法 无机盐诱导融合 高pH-高Ca离子 聚乙二醇(PEG)法 PEG结合高钙-高pH诱导法 电融合技术 无机盐诱导融合: NaNO3法 n1972年： Carlson诱导原生质体融合获得首例杂种 植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。 NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原 生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起 不足：诱导频率不高。 1973年：Keller用pH10.5的50 mM CaCl2溶液在37 时，诱发烟草叶肉原生质体融合。 优点：杂种产量高。 不足：高pH值对细胞有毒害作用。 高pH-高Ca离子法 PEG法特点： 融合频率高 可重复性强 诱发融合无特异性 毒性较低 植物+植物 植物+动物 动物+酵母 PEG法 PEG法原理 PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生 质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚 。在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷 重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导 致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正 性电荷部位相连而导致融合。 - +-+- 桥梁 +- PEG被洗掉 +- 电荷重排 +- 原生质体膜接触 +- 融合 示意 图 最为常用。 具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体-滴加 PEG溶液，摇匀，静置-滴加高钙-高pH溶液，摇匀， 静置-滴加原生质体培养液洗涤数次-离心获得原 生质体细胞团-筛选-再生杂合细胞 PEG结合高钙-高pH诱导法 电融合法 二、原生质体融合的过程 l包括3个主要阶段： 1、凝聚作用阶段，其间两个或两个以上的原生质体的质膜彼此靠近 2、在很小的局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，在两个原生质体之 间细胞质呈现连续状态，或是出现桥 3、由于细胞质桥的扩展，融合完成，形成球形的异核体或同核体。 三、杂合体的鉴别与筛选 （一）杂合细胞的显微镜鉴别 （二）互补法筛选杂合细胞 （三）采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体 （四）根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别 遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等 位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正 常。 l 如亲本1：叶绿体缺陷型 亲本2：光致死型 两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白 色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长 抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质体对抗生 素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种 细胞。 如： 亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基上不能 超过50个世代 亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上生长 杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长， 而亲本和其它细胞死亡 小小 结结 l植物体细胞杂交即原生质体融合，是获得胞质杂种的理想途 径 l体细胞杂交在远缘育种与新物种、新资源创造中具有深远意 义 l原生质体融合技术主要有PEG融合和电融合 l杂种的成功培养是建立在原生质体的培养技术上的，选择和 鉴定是获得细胞杂种的关键 l提高融合效率和培养重复性是该技术研究的重点 l细胞杂种是体细胞遗传研究的良好体系 转基因植物（Transgene plant）是指利用植物遗传工程进行DNA重 组，将优良的目的基因稳定的整合到植物的基因组中，并在子代中 得到有效的表达，获得具有新的遗传性状的植物体。 第七节 植物转基因技术 （一）农杆菌转化法 根瘤 又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）。 农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合的环状DNA 分子，有三个功能区，T-DNA 区、病毒区(Vir 区)和冠瘿 碱代谢基因的编码区。在T-DNA 区和Vir 区基因的协同作 用下，农杆菌完成侵染植物细胞和转移T-DNA 的过程。 Ti质粒 n一、细胞转化方式 转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的 染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部 分。 lT-DNA（transferred-DNA） 冠瘿碱（opine）的作用 冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来的，是农杆菌的 碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿 碱。 l毒性基因（vir） 决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移 ， 进入和整合。 l冠瘿碱代谢基因 分别编码代谢冠瘿碱的酶。维持农杆菌 生长。 Ti 质粒的改造 除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因 为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物； 除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成 大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长； 安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作； 安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物基因的启动子 和polyA化信号序列； 安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。 除去 Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度； 农杆菌叶盘转化法的操作 n用打孔器从消毒叶片上取得叶圆片，在过夜培养的对数 期的已构建好的农杆菌工程菌的菌液中浸数秒后，置于 培养基上共培养2-3天，待菌株在叶盘周围生长至肉眼可 见菌落时再转移到含有抑菌剂的培养基中除去农杆菌， 与此同时该培养基中加入抗生素进行转化体筛选，经合 适的培养基培养得到愈伤组织，再得到再生植株。 农杆菌转化的优点： 1.农杆菌转化方法是一种生物转化系统，因而具有主动性。 2.通过农杆菌转化系统获得转基因植株还具有拷贝数低。转基因 较少沉默以及转基因片段较长等优点。 农杆菌转化的缺点： 1.有致瘤的危险 2.不是单子叶植物的寄主。 （二）基因直接导入法 n(1)DNA直接吸收到植物细胞：DNA直接吸收进入原生质 体的方法分为物理法和化学法两大类。其中，物理法主 要是电穿孔法，化学法主要是聚乙二醇法。 n(2)显微注射法：该技术是直接将外源DNA注射进入细胞 核中而不降低DNA的活力。目前它已变成直接引入外源 小分子、大分子、细胞器和病毒粒子进入动植物细胞的 技术。 n(3)脂质体介导的DNA转移：脂质体可将核酸转移到原生 质体，也可将核酸等导人具有细胞壁的完整植物细胞， 但是其机制目前尚不很清楚，融合可能是一种方式。 n(4)微弹轰击(粒子介导)基因转移法：是把一种高速的、 携带有DNA分子的粒子射向靶细胞，它穿过细胞壁和细 胞膜，释放所携带的DNA进人细胞内，在一定的条件下 ，可使靶细胞得到转化。 n（三）花粉管通道法 n花粉管通道法是将外源的DNA片段在自花授粉后的特定 时期注入柱头或花柱，使外源DNA沿花粉管通道进入胚 囊，转化受精卵或其前后细胞，转化率高达10%。这一 方法的建立开创了整株活体转化的先例，可以应用于任 何开花植物。 二、植物基因转化的受体系统 n 选择和建立良好的植物受体系统也是基因转化成功的关 键因素。植物基因转化受体系统是指用于基因转化的外 植体通过细胞或组织培养途径高效、稳定地再生无性系 ，并能接受外源DNA整合。 n 1原生质体受体系统： 植物原生质体是去除细胞壁后 的“裸露”细胞，又具有全能性，能在适宜的培养条件下 诱导出再生植株。可利用物理或化学方法改变细胞膜的 通透性，使外源DNA进入细胞并整合到染色体上且进行 表达，从而实现植物基因转化。 n2愈伤组织受体系统 外植体经组织培养所产生的愈伤 组织，是植物基因转化常用的受体系统之一。由于愈伤 组织是由脱分化的分生细胞组成，易接受外源DNA，转 化率较高。又由于愈伤组织可以继代扩大培养，因而由 转化愈伤组织可培养获得大量的转化植株。 n3种质系统 以植物的生殖细胞如花粉粒、卵细胞为受 体细胞进行基因转化的系统称为种质系统。 4胚状体再生系统 该系统是最理想的基因转化受体系 统，体细胞胚是由具有卵细胞特性的胚性细胞发育而来 ，接受外源DNA的能力强，是理想的基因转化感受态细 胞。 5直接分化芽受体系统 ： 这是由未分化的细胞直接分 化形成，体细胞元件系变异小，因此导入的外源目的基 因可稳定遗传。 三、转入基因的表达和分析 n选择标记基因检测法：使该基因的表达产物赋予转化的 植物细胞具有一种选择压力，而使未转化的细胞在施用 选择压力下不能生长、发育和分化。 n报告基因检测法：报告基因(reportergene)是指其编码产 物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成 功地导人受体细胞、组织或器官，并检测其表达活性的 一类特殊用途的基因。 利用转基因植物生产功能蛋白和工业原料 利用植物生物反应器生产医用蛋白 利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂 利用植物生物反应器生产工业原料 利用转基因植物生产功能蛋白和工业原料 高等植物基因工程 转基因植物作为生物反应器的优势如下： 植物易于生长，农田管理成本相对低廉，操作技术要求也不高 绝大多数植物的表达产物对人和牲畜无毒副作用，安全可靠 植物具有完整的真核表达修饰系统，利用转基因植物生产的重组蛋 白药物和疫苗在分子结构和生物活性上，与人体来源的蛋白质相似 利用植物生物反应器生产医用蛋白 借助于根瘤农杆菌介导的转化系统，将小鼠抗体的轻链和重链编 码基因分别置于两种烟草植物体内表达，然后两种重组植物品系进行 杂交，产生的子代植物能同时合成小鼠的轻链和重链两种多肽。从这 种转基因烟草的叶子里可检测到完整的抗体分子，含量为叶细胞蛋白 总量的1.5%。实验结果表明，植物细胞的蛋白分泌系统能够有效识别 小鼠抗体前体的信号肽序列。 转基因烟草表达小鼠抗体 转基因烟草表达小鼠抗体 利用植物生物反应器生产医用蛋白 人葡萄糖脑苷脂酶（hGC）是治疗高歇斯症（Gausher disease） 遗传病的特效药，可能也称得上当今世界最昂贵的药物。每生产一个 剂量的hGC要消耗 2000-8000 只人类胎盘，因此这种药物一直供不应 求。美国VPI研究机构的专家将克隆的hGC基因经改造导入到烟草中， 并获得高效表达。在每克这种转基因烟草的新鲜叶片中，hGC的含量 竟高达1mg，也就是说，从一株转基因烟草中就能产生出传统工艺需 要消耗数千只胎盘才能获得的药物。 转基因烟草表达人葡萄糖脑苷脂酶 利用植物生物反应器生产食品或饲料添加剂 果聚糖是果糖的多聚体，可被人体肠胃中的微生物发酵，刺激双 歧杆菌生长，释放短链脂肪酸进入循环系统，保健价值高。3-6聚体的 果聚糖有甜味，是低能量的助甜剂，有助于降低体重，因此国际上果 聚糖的销售量很大。荷兰科学家把果糖基转移酶基因导入烟草和马铃 薯中，在获得的转基因植株中，果聚糖含量占8%（干重）以上，具有 良好的开发前景。 转基因烟草和马铃薯生产果聚糖 利用植物生物反应器生产工业原料 首批用于大规模生产并取得巨大经济效益的非食用性转基因植物 产品是工业用油，其中包括制造肥皂等去垢剂的十二碳月桂酸。油菜 通常产生十八碳的不饱和脂肪酸，但只要在其体内表达另一个特殊的 基因即可使转基因油菜改为合成月桂酸，并可使其含量提高到44%。 此外，鉴于油菜植物易生长且产量高的特点，人们还致力于用它来生 产其它工业用油，如可作润滑油和尼龙生产原料的芥酸以及用于麦淇 淋制作的6-十八碳烯酸等。 转基因油菜生产月桂酸 植物转基因技术在植物品种改良中的应用 控制果实成熟的转基因植物 抗病虫害的转基因植物 抗除草剂的转基因植物 改变花卉形状和颜色的转基因植物 抗环境压力的转基因植物 产高品质产物的转基因植物 控制果实成熟的转基因植物 蔬菜和水果成熟后，其组织呼吸速度和乙烯合成速度普遍加快， 并迅速导致果实皱缩和腐烂。控制蔬菜水果细胞中乙烯合成的速度， 能有效延长果实的成熟状态及存放期，为长途运输提供了有利条件， 具有重要的经济价值。 植物细胞中的乙烯由S-腺苷甲硫氨酸经氨基环丙烷羧酸合成酶 ACC和乙烯合成酶EFE催化裂解而成。科学家采用反义RNA技术封闭 番茄细胞中上述两个酶编码基因的表达，由此构建出的重组番茄的乙 烯合成量分别仅为野生植物的3%和0.5%，明显增长了番茄的保存期。 转基因耐贮藏番茄（左）和普通番茄（右） 科学家创造出抗肿瘤紫色西红柿 控制果实成熟的转基因植物 植物体内乙烯的生物合成机制 抗病虫害的转基因植物 昆虫对农作物的危害极大，全世界每年因此损失数千亿美元。目 前对付昆虫的主要武器仍是化学杀虫剂，它不但严重污染环境，而且 还诱使害虫产生相应的抗性。将抗虫基因导入农作物是植物基因工程 的得意之笔，能避免化学杀虫剂所造成的许多负面影响。目前，抗虫 作物已占全球转基因作物的22。用于构建抗虫害转基因植物常见的 外源基因有苏云金芽孢杆菌的毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀 粉酶抑制剂基因、凝集素基因、脂肪氧化酶基因、几丁质酶基因、蝎 毒素、蜘蛛毒素基因等40多个，其中毒晶蛋白基因、蛋白酶抑制剂基 因和凝集素基因应用最为广泛。 转基因抗虫棉和普通棉对照 我国培育的抗青枯病马铃薯正在大棚中繁殖 细菌毒素蛋白编码基因的植物转基因程序 抗除草剂的转基因植物 在大田里，尽管每年花费上百亿美元使用100多种化学除草剂，但 杂草的生长仍使农作物减产10%。目前使用的除草剂特异性不强，或 多或少会影响农作物的生长。利用转基因技术构建抗除草剂的重组植 物可望解决这一问题，其战略包括： 抑制农作物对除草剂的吸收 高效表达农作物体内对除草剂敏感的靶蛋白 降低敏感性靶蛋白对除草剂分子的亲和性 向农作物体内导入除草剂的代谢灭活能力 抗环境压力的转基因植物 长期的植物生理学研究结果表明，植物对盐、碱、旱、寒、热等 环境不利因素的自我调节能力很大程度上取决于细胞内的渗透压，提 高渗透压往往能改善植物对上述环境不利因素的耐性。为达到此目的 至少有两种战略可供选择：一是高效表达能提高植物胞内渗透压的同 源或异源蛋白；二是借助于蛋白质工程技术改变植物细胞内丰度较高 的蛋白质的氨基酸组成，如在不影响蛋白质结构与功能的前提下适当 提高脯氨酸残基的含量等。 产高品质产物的转基因植物 植物油大都是含有双键的不饱和脂肪酸，故在室温下呈液态。人 造黄油的制作是通过催化加氢使植物油熔点上升，这种工艺不但加工 成本很高，而且还会导致顺式双键转变为对健康不利的反式双键。利 用反义RNA技术，特异性灭活植物体内硬脂酰-ACP脱饱和酶的编码基 因，即可提高转基因油料作物中饱和脂肪酸的含量。 将不饱和脂肪酸转化为饱和脂肪酸 产高品质产物的转基因植物 一般粮食种子的储存蛋白中几种必需氨基酸的含量较低，例如禾 谷类蛋白的赖氨酸含量低，豆类植物的蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸含 量低，直接影响到人类主食的营养价值。将蚕豆中一种富含赖氨酸和 甲硫氨酸的蛋白编码基因植入玉米中，可显著提高其营养价值。马铃 薯和水稻的类似改良也在进行之中。 提高粮食中必需氨基酸的含量 09年10月23日，张鹏研究员主持的中科院先进工业生物技术创新基地重要方 向项目，利用小分子RNA干扰技术抑制甘薯淀粉合成基因的表达，得到一系 列直链淀粉与支链淀粉含量比例发生变化的甘薯新品种，直链淀粉含量可扩 展到之间，为改变薯类淀粉品质提供了全新的技术手段 产高品质产物的转基因植物 目前全世界有24亿人以大米为主食，约有1.3亿人因缺铁而引起贫 血，2.5-10亿人患有不同程度的维生素A缺乏症。为了增加稻米中的铁 质含量，从大豆芽中分离出铁蛋白编码基因，将之转入亚洲稻谷一个 普通品系中。结果发现，转基因稻谷能储存相当于普通稻谷3倍的铁质 研究还发现，普通稻米中含有一种植物酸，阻碍人的消化系统对铁的 吸收。瑞士科学家将来自水仙等植物的相关基因植入水稻中，不仅铁 的含量有所提高，而且维生素A的含量也丰富