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文档简介
紫外辐射损伤模型建立及治疗的研究摘 要CRM1是核运输受体importin beta超家族中的重要成员,主要负责一些生长调节蛋白以及肿瘤抑制蛋白包括p53、p21、 FOXO、 PI3K/AKT、 Wnt/-catenin、AP-1 、NF-kB 以及Nrf2等的核运输。Crm1的过表达与许多癌症比如前列腺癌、肝癌等的发生相关,因此引起人们很大的关注,多年来被认为是抗癌的重要靶点。Crm1的过表达会不但与癌症的发生有着重要的关系,还与一些慢性疾病如皮肤炎症的发生有关系。引起皮肤损伤的外界环境因子常见的主要是紫外线,紫外线主要来源于太阳光,紫外线分为UVA(320400nm)、UVB(280320nm)和UVC(280nm),其中UVA可达皮肤表皮及真皮,使皮肤老化松弛、色素沉淀及产生日光性角化症等;UVB可使皮肤红肿、脱皮,产生类似烧伤的症状,部分会被平流层的臭氧吸收;UVC危害最大,但会全部被臭氧吸收。近年来随着臭氧层被破坏,紫外线对人们的生活影响越来越大。紫外线引起的严重的皮肤损伤与ROS的产生有关,而Keap1-Nrf2-ARE信号通路在细胞防御过程中起着重要的作用,在近几年对Keap1-Nrf2-ARE细胞防御通路的研究主要集中在研究Nrf2的激活剂上,机制主要是与Keap1上的Cys151反应从而激活Nrf2,使得Nrf2进入原子核内诱导二相去毒酶等的表达,从而清除ROS,但是Nrf2会在Crm1介导下被运出核,所以研究Crm1调节剂来调节Crm1对Nrf2的核输出是另一种有效的激活细胞抗氧化防御通路的途径。本实验用白色豚鼠作为实验动物先建立动物UV辐射损伤模型,再用抗氧化活性较强的维生素E和维生素C联合使用来验证所建立的动物UV辐射损伤模型,最后运用动物UV辐射损伤模型来研究一种筛选得到的一种天然分子咖啡酸苯乙酯(CAPE)即CRM1调节剂的皮肤光保护作用。关键词:CRM1;UVB辐射损伤;Keap1-Nrf2-ARE通路;CAPE;核转运AbstractCRM1 is an important member of the nuclear transport receptor superfamily importin beta, primarily responsible for the nuclear transport of some growth regulator proteins and tumor suppressor proteins including p53、p21、 FOXO、 PI3K/AKT、 Wnt/-catenin、AP-1 、NF-kB and Nrf2, et. It causes a great concern for the overexpression of CRM1 being associated with the occurrence of many cancers such as prostate cancer and liver cancer, et. In these years it was considered to be an important target for anti-cancer. Overexpression of CRM1 not only has a significant relationship with the occurrence of cancer, but also has a relationship with a number of chronic diseases such as skin inflammation.The common external environmental factor that causes skin inflammation is ultraviolet. In our life the ultraviolet mainly comes from sunlight, and the ultraviolet is divided into UVA (320400nm), UVB (280320nm), UVC (280nm). UVA can reach the epidermis and dermis of skin, making the skin aging, loosing, pigmentation and generate solar keratosis psychosis; UVB makes the skin redness, peeling and produce a symptoms similar as burning damage, but some of them will be absorbed by the ozone in the stratosphere; UVC is the most harmful one, but it will all be absorbed by the ozone. In recent years, with the destruction of the ozone layer, ultraviolet impact on our life more and more.Ultraviolet-induced skin damage is associated with the generation of ROS, and the Keap1-Nrf2-ARE signal pathway plays an important role in the process of cellular defense. In recent years, studies on the Keap1-Nrf2-ARE cellular defense pathway mainly focus on the Nrf2 activator. Reaction with the cys151 on Keap1 to activate Nrf2 to get into the nucleus and induce the expression of many enzymes and factors is the mainly mechanism of Keap1-Nrf2-ARE pathway on cellular defense. However, Nrf2 will be transported out of nuclear in the CRM1-mediated nuclear export pathway, therefore finding a CRM1 inhibitor to inhibit the nuclear export of Nrf2 is another effective way to activate the cellular antioxidant pathway.In this research I firstly use white guinea pigs to establish the ultraviolet radiation damage animal model, and secondly use vitamin C & vitamin E to verify the ultraviolet radiation damage model, and in the end I use the ultraviolet radiation damage model to test the photoprotection effect of a natural CRM1 inhibitor caffeic acid phenethyl ester (CAPE) which is obtained by screening.Key words: CRM1; UVB radiation damage; Keap1-Nrf2-ARE pathway; CAPE; Nuclear transport第一部分:文献综述1. CRM1介导的核运输机制1.1 CRM1介导的核输出核膜为DNA复制、RNA转录及核小体的生产提供了一个隔离的细胞内环境,核膜双层膜是一种参与出了细胞凋亡和增殖以外的细胞周期调节的选择性物理屏障。RNA的核质运输、核小体、重要的转录调节剂、细胞周期抑制剂以及特异的药物靶标都通过核孔复合体1和转运受体分子紧密调节,这些调节物质被称为核质蛋白2(Fig 1.1)3。核质蛋白通过识别包含在每个蛋白质内的信号序列与货物蛋白结合,这些信号使其输入到核仁46,然后输入到细胞核(核定位信号)7,并输出到细胞质(核出口信号)811。所有物质运输入或运输出细胞核都要嵌入核膜横向结构,即核孔复合体(NPC)。NPC由大约30个核孔蛋白组成,嵌入在核膜双层膜中,每个NPC运输物质的能力,这取决于具体的核质蛋白及其货物。小分子蛋白或盐可以自由通过NPC,而大于45-60kDa的蛋白质不能自由通过NPC,需要可溶性核质转运受体或核质蛋白的协助。其中大多数核质转运受体属于核质蛋白-家族,每一个核质蛋白-识别唯一的一组货物蛋白或RNA。这种识别是通过货物蛋白上的核定位序列(NLS)和核出口序列(NES)实现的。Fig 1. CRM1介导核输出示意图目前有三种核质转运信号已被确定,包括被输入蛋白/识别的碱性氨基酸NLS序列12、包含更为复杂的PY-NLS的核质蛋白-213和识别疏水富亮氨酸输出信号的细胞核穿梭蛋白(CRM1)。CRM1结合并出口蛋白质和RNA,已被证明是唯一能够识别NES的转运受体14,15。CRM1所识别的NES信号序列是疏水氨基酸序列,包括异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸16。NES的共有序列为HX2-3HX2-3HXH,其中H代表一个疏水氨基酸,X代表一个任意氨基酸,下表数字表示潜在的重复数量16,17。此序列可存在于很多复杂的蛋白结构,例如-螺旋的蛋白质。在细胞核中RanGTP表现有高浓度,人们认为RanGTP的浓度梯度为核出口提供所需的能量18。NPC中12%-20%的核孔蛋白是由苯丙氨酸/甘氨酸重复结构域(FG-重复)构成19,而CRM1和其他输入蛋白-家族的核质蛋白拥有HEAT结构域(亨廷顿,延伸因子3、蛋白质磷酸酶2A和酵母PI3激酶TOR1),可以吸引并与核孔蛋白的FG-重复域相互作用,随着RanGTP浓度梯度引发的自由扩散,促进复合物移动通过NPC中心通道的核孔蛋白基质2。出口复合物在细胞核中形成,这些复合物有三个部分组成:RanGTP、CRM1、出口基质或货物蛋白20。CRM1结合在RanGTP或者货物蛋白的核出口信号序列上的能力很弱,但当后两者以协同方式共同结合在CRM1上时,亲和力提高了500-1000倍21,22。CRM1-RanGTP-货物基质复合物在细胞核中形成后便通过NPC出口到细胞质中。进入细胞质后,RanGTP被RanGTP酶水解为RanGDP,出口复合物分解为各独立元件,将基质或货物蛋白释放入细胞质中。CRM1通过NPC被回收进细胞核进行下一个循环。CRM1是一个无处不在的核输出受体蛋白,对于其结合的发生,货物基质必须含有富亮氨酸的核输出信号序列,由蛋白质磷酸化、去磷酸化或突变引起的货物蛋白的三维构象变化会使NES暴露并与CRM1结合2325,其他的蛋白质修饰,例如SUMO化、泛素化、乙酰化或蛋白质特有辅助因子结合也会通过暴露出口信号引发核出口16,26,27。所以我们可以通过设计抑制CRM1与NES结合的化合物来对一些与核输出有关的疾病进行研究与治疗。1.2 CRM1抑制剂的研究进展到目前为止已经有很多通过抑制CRM1对核输出进行抑制的化合物被分离出来。最早被分离出来的CRM1抑制剂是从链霉菌中分离出来的西霉素B(Table 1.2A),它与CRM1的半胱氨酸残基(半胱氨酸528)进行迈克尔加成反应,使半胱氨酸528烷基化,抑制CRM1与货物蛋白基质的NES结合,从而阻断核输出46。自此之后发现的CRM1抑制剂绝大多数都是通过修饰半胱氨酸52阻止CRM1与货物蛋白的NES结合来起到抑制作用的。后来人们又从黏杆菌纤维堆囊菌总分离出了Ratjadones(Table 1.2A),包括Ratjadone A、B、C、D47,其化学结构与西霉素B相似,同样与CRM1的半胱氨酸528进行迈克尔加成,阻碍CRM1与货物蛋白的NES结合从而达到抑制作用,该化合物在抗癌和抗真菌方面有重要作用。同样有抗肿瘤作用的化合物还有LMB(来普霉素)衍生物43等(Table 1.2B)。Daelemans发现了N-azolylacrylate类似物PKF050-638(Table 1.2A),这是一种可逆且具有高度特异性的CRM1抑制剂,同样类似于西霉素B,PKF050-638干扰了反应性位点半胱氨酸以阻碍CRM1与HIV-1 Rev蛋白的NES结合42,因此具有抗HIV的作用。同样具有抗HIV作用的化合物还有缬草烯酸45(Table 1.2A)等。Table 1.2A 几种抗癌与抗HIV化合物的对应结构化合物对应结构细霉素BLeptomycin B来普霉素衍生物LMB derivativesRatjadone细霉素家族的一员PKF050-638缬草烯酸ValtrateTable 1.2B 在多种癌症中作用于CRM1介导的核输出的药物靶标、肿瘤阻遏剂和细胞周期抑制剂3蛋白质功能所需修饰癌症类型参考文献视神经母细胞瘤蛋白肿瘤阻遏剂被细胞周期依赖性蛋白激酶磷酸化视神经母细胞瘤44APC肿瘤阻遏剂单基因突变导致移码或提前终止大肠癌48p53肿瘤阻遏剂被MDM2 E3泛素连接酶泛素化大肠癌、乳腺癌49BRCA1肿瘤阻遏剂BRAD1蛋白遮盖BRCA1的NES乳腺癌50p21CIP1细胞周期抑制剂HER2/neu基因突变并被Akt磷酸化;BCR-ABL易位并被Akt磷酸化;被蛋白激酶C磷酸化卵巢癌、乳腺癌、慢性粒细胞白血病51拓扑异构酶IDNA拓扑、药物靶标未知间变性星形细胞瘤、神经母细胞瘤52拓扑异构酶IIDNA拓扑、药物靶标被酪蛋白激酶2磷酸化多发性骨髓瘤53p27KIP1细胞周期抑制剂被hKIS磷酸化乳腺癌、急性髓系白血病54FOXO肿瘤阻遏剂被Akt激酶磷酸化乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤23InI1/hSNF5肿瘤阻遏剂NES内的保守疏水残基突变恶性横纹肌样瘤24BCR-ABL癌基因,酪氨酸激酶未知慢性粒细胞白血病55Galectin-3细胞增殖凋亡操纵子被酪蛋白激酶1磷酸化甲状腺癌、前列腺癌、乳腺癌56Bok促凋亡因子未知乳腺癌、Hela细胞57N-WASP/FAK肌动蛋白细胞骨架调节剂由17b-雌二醇刺激其被黏着斑激酶磷酸化,神经威奥德里奇综合征、乳腺癌、卵巢癌58核仁磷酸蛋白肿瘤阻遏剂288和290色氨酸残基突变(急性髓性白血病);NF-kB/RelA遮盖(乳腺癌)急性髓性白血病、乳腺癌59Hsp90分子伴侣未知乳腺癌60雌激素受体阻断细胞周期进入S期PI3激酶乳腺癌61Tob细胞周期抑制剂未知乳腺癌62RASSF2肿瘤阻遏剂MAPK/ERK-2磷酸化甲状腺癌、鼻咽癌63Merlin肿瘤阻遏剂未知神经纤维瘤64当下对已知的被CRM1运出核的蛋白质的研究有很多,如Table 1.2B中所列举的一系列在癌症中被CRM1运输出核的蛋白质,很可能是治疗众多癌症疾病的关键因素,通过siRNA和CRM1抑制剂来降低甚至消除CRM1的活性将会在治疗癌症中起到重要作用。但是在这些化合物中,也发现了很多的弊端。比如说LMB衍生物,它具有“脱靶”的毒性65。为了能更好的应用于临床,目前很多研究团队正在继续开发新的CRM1抑制剂,或者它具有低毒性可作为单剂使用,或者它可以与已知的CRM1抑制剂共同作用,降低毒性。相信经过不懈的研究开发,新型CRM1很快就会应用于临床。1.3 CRM1的货物蛋白2. Keap1-Nrf2-ARE信号通路2.1 Keap1-Nrf2-ARE信号通路的细胞防御机制核因子E2相关因子2(Nrf2)属于CNC亮氨酸拉链转录激活因子家族,被认为是该家族中活力最强的转录调节因子28,与抗氧化反应、抗炎反应及细胞保护作用等有关,在皮肤氧化性损伤方面有重要作用。Nrf2是一个CNC(CapnCollar)型碱性亮氨酸区域拉链(bZIP)转录因子,作为一个异源二聚体通过一种小的bZIP蛋白Mafs结合于抗氧化反应原件(ARE),并激活ARE依赖性转录(Fig 1.2A)29。Nrf2包含6个功能域,它们是物种间保守的特定Neh1-6(Nrf2-ECH同源1-6)结构域(Fig 1.2B)29,N末端的Neh2结构域介导与Nrf2胞质阻遏剂的结合30,Neh4和Neh5是协作结合到CREB结合蛋白的反式激活结构域31,Neh1结构域含有CNC型bZIP结构域,使Nrf2能够与小Maf蛋白的ZIP结构域形成一个异源二聚体。Fig 1.2Kelch2样ECH2相关蛋白1(Keap1)是Nrf2在细胞质中的结合蛋白,75kDa的富半胱氨酸Keap1通过结合与Nrf2结合对Nrf2进行负调节3234。Keap1有三个主要功能域:一个N末端的BTB(Broad complex,Tram-track,and Bric-a-brac)结构域,一个中央插入区域(IVR)和靠近C末端的一系列Kelch重复(Fig 1.2B)。Kelch结构域介导与Nrf2的Neh2结构域结合35,BTB结构域介导与泛素E3连接酶支架蛋白Cullin-3(Cul3)的联合36。Keap1通过与Nrf2结合并将将其锚定到细胞骨架肌动蛋白来阻止Nrf2进入细胞核30。在无压力的生理条件下,Keap1活动于细胞质下调Nrf2激活转录的能力。在氧化刺激下,ARE活化剂通过共价修饰Keap1使其失活,Nrf2摆脱Keap1介导的抑制作用并移动到细胞核,在核内诱导ARE定向基因的转录(Fig 1.2A),同时,包括MAPK、PI3K、PCK等的一些蛋白激酶可通过直接磷酸化Nrf2的方式促使其与Keap1分离,以此激活Nrf237。Nrf2包含一个双向NLS和一个富亮氨酸的NES,调节其穿梭于细胞核内外,同时它是CRM1的一个货物蛋白,会被活化的CRM1运出细胞核,所以通过抑制CRM1的活性可以使Nrf2在细胞核聚集38,从而激活ARE的转录,以达到抗氧化损伤的作用。2.2 Nrf2激活剂的研究进展目前通过调节Keap1-Nrf2-ARE通路治疗氧化性损伤的化合物有茶多酚(EGCG),姜黄素,莱菔硫烷等(Table 1.2.1)。EGCG是在绿茶中提取的天然产物,属于多酚类黄酮,Na等人66EGCG活化后可与谷胱甘肽结合,降低细胞中的谷胱甘肽浓度一激活蛋白激酶C和细胞外信号调节激酶等上游激酶,是Nrf2磷酸化,同时部分活化的EGCG可直接与Keap1的半胱氨酸残基反应使Nrf2解离,激活Nrf2-ARE通路。姜黄素是提取于姜黄中的天然产物,是非类黄酮多酚,可以清除体内超标的ROS、H2O2和NO等,使细胞的氧化还原处于动态平衡的状态,同时Demirovic等人67发现姜黄素可以对Keap1中的半胱氨酸151进行亲电修饰,使Nrf2脱离Keap1的束缚,从而激活Nrf2-ARE通路。莱菔硫烷也是一种天然产物,提取于十字花科植物中的硫代葡萄糖苷,Kems等人68发现它并不能直接吸收大于290nm的光,但它可以使谷胱甘肽水平下降,激活p38和JNK激酶,是Nrf2磷酸化,同时它可以直接降解Nrf2-Keap1共价化合物,激活Nrf2-ARE通路,起到抗氧化损伤的作用。通过以上可以发现,目前主要提取一些可以激活Nrf2-ARE通路的天然产物进行抗氧化治疗的研究,天然产物成本一般较低,并且呈现低刺激性,比较适用于治疗皮肤氧化损伤及皮肤炎症的治疗,但天然产物的药效也普遍不尽人意。而通过对这些天然产物的研究发现抗氧化损伤的重点在于ROS水平的调控、Nrf2-Keap1共价化合物的解离和细胞谷胱甘肽水平的调控,我们可以就这几点合成一些类天然产物的化合物,达到低毒甚至无毒高效的目的。Table 1.2.1 几种抗氧化天然产物的对应化学结构化合物化学结构EGCG姜黄素莱菔硫烷3. 紫外辐射对人皮肤的损伤以及防御我们日常生活中紫外线(UV)的主要来源是太阳光,太阳光中的紫外线有三种,包括UVA(320-400nm)、UVB(280-320nm)和UVC(200-275nm)(Fig 3)。Fig 3 UV照射示意图大气平流层中的臭氧可以吸收波长小于290nm的紫外线,即会吸收掉全部的UVC和少量UVB。UVA和UVB穿过臭氧层照射到皮肤上,会对皮肤造成辐射损伤,其效应机制很复杂,主要是以下两个方面39:(1)DNA能直接吸收入射光子,形成环丁烷嘧啶二聚体和6-4光产物,诱导DNA突变,导致肿瘤形成;(2)细胞内发色基团(DNA、尿刊酸、芳香族氨基酸等)吸收UV辐射的电磁能量后,与氧分子相互作用,产生活性氧簇(ROS),使细胞ROS水平提高,致使氧化-抗氧化平衡紊乱,产生氧化应激,引起皮肤炎症、晒伤、光老化及光致癌40。ROS的过量产生是UV导致皮肤炎症的重要因素,其介导的氧化损伤涉及DNA的分子修饰、脂质过氧化和分泌炎性因子等,同时还会抑制酪氨酸磷酸化,导致信号转到增加,多种转录因子活化,最终导致皮肤的组织病理学改变41。细胞膜上的受体激酶和磷酸酶是氧化应激的靶标,ROS可以通过多种途径作用于这些靶标,比如:ROS中的H2O2作用于表皮生长因子(EGF)的受体激酶结构域,引起EGFR升高,EGFR会抑制DNA双链断裂的修复过程,造成DNA的损伤,同时ROS可以激活磷脂酶A2和磷脂酶D,在EGF作用下提高细胞钙离子水平,引起细胞凋亡。UV辐射引起的细胞外ROS水平提高还会使膜结合蛋白酪氨酸激酶活化,激活促有丝分裂原蛋白激酶MAPK,使细胞内相应转录因子磷酸化,介导细胞凋亡68,69。而在细胞内,ROS可以抑制细胞周期素依赖激酶(CDKs),ROS浓度较高时会导致细胞生长停滞,而浓度的继续升高将诱导细胞凋亡。同时ROS中的H2O2可以与核酸特异位点的金属离子反应产生高活性OH,攻击胸腺嘧啶,对DNA造成损伤。ROS还会降细胞内的谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶等抗氧化蛋白酶灭活,使细胞无法维持正常的氧化还原平衡。细胞质主要靠谷胱甘肽(GSH)和硫氧化蛋白(TRX)维持较强的还原状态,而ROS的水平升高会降低GSH的水平,是细胞对氧敏感。进入细胞中的ROS会对蛋白进行修饰,改变蛋白质的结构,使其失活。其对各种蛋白的修饰位点主要包括丝氨酸的羟基和半胱氨酸的巯基。ROS在细胞外和细胞内都会对细胞产生影响,其对多种激酶及转录因子的修饰或损伤是引起皮肤氧化损伤及皮肤炎症的主要因素。因此治疗此类疾病的重点是怎样清除ROS,只要能够有效的调节细胞内外ROS的水平,相信对皮肤炎症疾病的治疗会有很大进展。1.4总结UV照射使人皮肤ROS水平提高,引起氧化应激,致使Keap1失活,随后Nrf2移动至细胞核启动ARE的转录。而在细胞核中存在CRM1,它会将Nrf2运输出细胞核,所以在这里,CRM1有阻碍Keap1-Nrf2-ARE抗氧化通路的作用。基于以上机制,CRM1抑制剂将会在治疗及预防UV辐射导致的皮肤炎症等疾病方面起到重要作用。目前已发现或制得的CRM1抑制剂主要是应用于抗肿瘤、抗HIV等疾病。例如:用于抗肿瘤的CRM1抑制剂有细霉素B46、LMB(来普霉素)衍生物43、Ratjadone47等,用于抗HIV的CRM1抑制剂有PKF050-63842、缬草烯酸45等。但是应用于抗炎症方面的CRM1抑制剂却很少,尤其是在皮肤炎症方面,几乎是一片空白,还有待继续研究,如果可以找到一个合适的化合物抑制CRM1转运Nrf2的活性,便可以持续激活Keap1-Nrf2-ARE通路,这将会对治疗皮肤氧化性损伤及皮肤炎症产生重要作用。1 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 实验动物纯白色豚鼠,200-300g,由大连医科大学实验动物中心提供。2.1.2 试剂与药品Hela细胞,NES-GFP表达质粒,DMEM培养基,FCS(小牛血清),PBS(磷酸盐缓冲溶液),胰酶/EDTA消化液,转染试剂(TransFast),2.1.3 主要仪器20L/200L/1mL微量移液器和Tip头,酒精灯,一次性塑料吸管,废液缸,血球计数板,35mm培养皿,转染管,1.5mL和4mL离心管,酶联免疫检测仪,观察用倒置显微镜,荧光共聚焦显微镜,2.2 紫外辐射损伤模型的建立2.2.1 最小红斑剂量的测定取一只纯白色豚鼠,体重200-300g。选取豚鼠两侧区域的皮肤进行辐射实验,每侧区域大小为8cm*4cm。先用剪刀将豚鼠两侧的毛发剪短,然后用电动理发器将两侧毛发剃至根部,然后涂抹剃须泡沫,将根部毛发软化,然后用剃须刀顺毛发生长方向轻轻将根部毛发刮净,最后用酒精棉轻轻擦拭刮净的皮肤,将豚鼠置于洁净的笼内饲养,喂食豚鼠鼠粮和饮用水。待去毛24h后,对去毛区域皮肤测量Lab值,然后对其进行UVB照射。将带有直径为1.5cm圆孔的盒子安装在UVB灯光上(使UVB辐射损伤形成的红斑呈圆形),对豚鼠去毛区域进行最近距离照射,取6个依次递增的照射剂量200mJ、400mJ、600mJ、800mJ、1000mJ和1200mJ,每侧区域照射3个剂量,照射结束后将豚鼠置于洁净的笼内饲养,喂食豚鼠鼠粮和饮用水。照射结束后的24h后,对6块照射区域进行拍照,并分别测量6块区域的Lab值。观察各区域产生的红斑量,肉眼所能观察到的最小红斑区域对应的照射剂量即为最小红斑剂量(MED),记录所测得的MED值。2.2.2 剂量依赖性炎症反应准备一只纯白色豚鼠,体重200-300g。选取豚鼠两侧区域的皮肤进行辐射实验,每侧区域大小为8cm*4cm。先用剪刀将豚鼠两侧的毛发剪短,然后用电动理发器将两侧毛发剃至根部,然后涂抹剃须泡沫,将根部毛发软化,然后用剃须刀顺毛发生长方向轻轻将根部毛发刮净,最后用酒精棉轻轻擦拭刮净的皮肤,将豚鼠置于洁净的笼内饲养,喂食豚鼠鼠粮和饮用水。去毛24h后,对去毛区域皮肤测量Lab值,然后对其进行UVB照射。将带有直径为1.5cm圆孔的盒子安装在UVB灯光上(使UVB辐射损伤形成的红斑呈圆形),对豚鼠去毛区域进行最近距离照射,取6个一次递增的照射剂量1*MED、2*MED、3*MED、4*MED、5*MED和6*MED,每侧区域照射三个剂量。照射结束后将豚鼠置于洁净的笼内饲养,喂食豚鼠鼠粮和饮用水。照射结束后的24h后,对照射区域拍照,并测量每块区域的Lab值,对比照射之前的Lab值,制作图表。2.2.3用于测定抗炎药物的具体实验模型经过以上实验摸索,最终建立了一个可用于测定抗炎药物的UVB辐射损伤模型:纯白色豚鼠,200-300g,两侧用刀剃法去毛。去毛24h后测量Lab值,在测量区域给药,两侧分别为给药组和平行组,每天固定时间给药,持续给药4天,第4天给药1h进行UVB照射,照射剂量为n*MED,照射结束24h后测量Lab值并拍照观察。2.3 VC&VE验证UVB辐射损伤模型准备一只纯白色豚鼠,体重200-300g。选取豚鼠两侧区域的皮肤进行辐射实验,每侧区域大小为8cm*4cm,记为A区域和B区域。先用剪刀将豚鼠两侧的毛发剪短,然后用电动理发器将两侧毛发剃至根部,然后涂抹剃须泡沫,将根部毛发软化,然后用剃须刀顺毛发生长方向轻轻将根部毛发刮净,最后用酒精棉轻轻擦拭刮净的皮肤,将豚鼠置于洁净的笼内饲养,喂食豚鼠鼠粮和饮用水。去毛24h候后,在A区域选取直径2.5cm圆形区涂抹50L VC&VE试剂,涂抹均匀,记为给药区,在B区域选取直径2.5cm圆形区涂抹50L蒸馏水,记为对照区,并记录此次给药时间,待其吸收后,将豚鼠置于洁净的笼内避光饲养,喂食豚鼠鼠粮和饮用水。此后每天在与此次同一时间给药,持续给药4天,在帝第4天给药结束1h后,对给药区和对照区进行UVB照射,照射剂量为5*MED,照射结束后将豚鼠置于洁净的笼内饲养,喂食豚鼠鼠粮和饮用水。照射结束24h后,测量给药区域与照射区域的Lab值,拍照并观察红斑情况,对比照射前去照射后Lab值制成图表。2.4 用于治疗UVB辐射损伤的药物2.4.1 AutoDock 获取受体及配体结构文件用ChemDraw设计一个小分子B,然后用DiscoveryStudio对小分子A进行优化,选择MMFF力场,进行能量最小化,保存为“B_DS.pdb”。从网站上下载“CRM1.pdb”文件,用EditPlus将其改为只有蛋白质的结构,保存为“A.pdb”。 准备受体分子PMV菜单,打开受体分子“A.pdb”,Residue框中输入HOH*,Atom框中输入*,选中所有水分子,并为受体分子加H,保存文件。 准备配体分子PMV菜单,隐藏A分子,将文件类型由PDBQT改为PDB并打开B_DS分子,开始初始化。ADT菜单,设置活动键的数量,同时指定设定活动键时移动最少的原子。保存为PDBQT格式文件。 准备柔性残基文件ADT菜单,打开之前编辑好的A分子,合并没有极性的H,设置ARG8的残基为柔性并设置其可扭转建的数量。保存柔性残疾文件“A_flex.pdbqt”和刚性残疾文件“A_rigid.pdbqt”。 准备大分子ADT菜单,打开“A_rigid.pdbqt”,保留之前已加的电荷以代替ADT自动加上Gasteiger电荷。 准备AutoGrid参数文件ADT菜单,打开“B.pdbqt”,在Grid Option对话框将格子的大小设置为X,Y,Z:60,60,66,格点间隔为默认值0.375,格子中心设为2.5,6.5,-7.5(x,y,z)。保存为“A.gpf”。 运行AutoGrid4ADT菜单,启动AutoGrid图形界面,运行程序进行计算。 准备DOCK参数文件 运行AutoDock4ADT菜单,启动运行AutoDock4图形界面,运行程序进行计算。0 结果分析2.5 细胞活性实验2.5.1 MTT法测定细胞活性的原理MTT是一种粉末状化学试剂,全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,汉语化学名为 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值,在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值),来判断活细胞数量,OD值越大,细胞活性越强。2.5.2 铺板 弃掉培养皿中旧的培养基,用1ml的PBS溶液洗涤两次; 用Tip头加入2ml Trypsin液,消化2分钟(37。C,5%CO2 ),观察细胞间的连接蛋白被溶解掉,使得细胞分散开; 用一次性塑料吸管吸出Trypsin液,加入2ml的含血清培养基DMEM培养基,用一次性吸管吹打细胞使得细胞完全从培养瓶壁上脱落下来,并且使细胞完全分散开; 吸取吹打好的细胞置于4ml离心管中,并吸出10ul用来计数; 血球计数板计数,(四大格细胞数之和/4)*104为细胞总的数量,再用培养基稀释细胞使得细胞浓度达到5*104个; 用Tip头将稀释好的细胞溶液加到96孔板中,将培养皿转入CO2培养箱中培养。2.5.3 加药 将药先用DMSO溶解成浓度为50uM,再用培养基稀释至0-200umol的浓度梯度; 等到细胞数长到70%时,吸出旧的培养基,加入已配好的药物,将培养皿转入CO2培养箱中培养。2.5.4 加MTT溶液 培养24小时后,吸出旧的培养基,没孔中加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4个小时; 4个小时后终止反应,吸出MTT溶液,没孔加入150ulDMSO溶液,并置于摇床上低速振荡10min,使得结晶物充分溶解; 在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。2.6 核质穿梭实验2.6.1 铺板 弃掉培养皿中旧的培养基,用1ml的PBS溶液洗涤两次; 用Tip头加入2ml Trypsin液,消化2分钟(37。C,5%CO2 ),观察细胞间的连接蛋白被溶解掉,使得细胞分散开; 用一次性塑料吸管吸出Trypsin液,加入2ml的含血清培养基DMEM培养基,用一次性吸管吹打细胞使得细胞完全从培养瓶壁上脱落下来,并且使细胞完全分散开; 吸取吹打好的细胞置于4ml离心管中,并吸出10ul用来计数; 血球计数板计数,(四大格细胞数之和/4)*104为细胞总的数量,再用培养基稀释细胞使得细胞浓度达到5*104个; 用Tip头将稀释好的细胞溶液加到96孔板中,将培养皿转入CO2培养箱中培养。2.6.2 转染 转染混合液配置,脂质体和质粒DNA以1:2的比例加入到无血清培养基中 配制好的溶液静止15min后,依次加入到96孔板中2.6.3 加药转染24小时后 配药,将药先用DMSO溶解成浓度为50uM,再用培养基稀释至0-200umol的浓度梯度; 等到细胞数长到70%时,吸出旧的培养基,加入已配好的药物,将培养皿转入CO2培养箱中培养。2.6.4 加药24小时后,用4%的多聚甲醛溶液固定20min,再加入10ug/ml Hoehst 33258染液染色,用荧光共聚焦显微镜观察实验结果1. Fahrenkrog, B. and U. Aebi, The nuclear pore complex: Nucleocytoplasmic transport and beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2003. 4(10): p. 757-766.2. Cook, A., et al., Structural biology of nucleocytoplasmic transport, in Annual Review of Biochemistry. 2007, Annual Reviews: Palo Alto. p. 647-671.3. Joel G. Turner, Jana Dawson, Daniel M. Sullivan*, Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer. Biochemical Pharmacology 83 (2010) 1021-1032.4. Nakamura T, Imai H, Tsunashima N, Nakagawa Y. Molecular cloning and functional expression of nucleolar phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase in mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun 2003;311:13948.5. Guo YX, Dallmann K, Kwang J. Identification of nucleolus localization signal of betanodavirus GGNNV protein alpha. Virology 2003;306:22535.6. Liu J, Du X, Ke Y. Mapping nucleolar localization sequences of 1A6/DRIM. FEBS Lett 2006;580:140510.7. Hodel MR, Corbett AH, Hodel AE. 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The yeast nuclear pore complex: composition, architecture, and transpo
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