毕业论文范文——家族遗传对Th1Th2型细胞因子表达调控的影响

广州医科大学本科生毕业论文本科生毕业论文(设计)题目：家族遗传对Th1/Th2型细胞因子表达调控的影响姓 名 指导教师 二级学院 基础学院 专 业 生物技术 年 级 学 号 年 月 日 目 录中文摘要 2英文摘要 3前 言 4材料与方法 6结 果 8讨 论 11结 论 22参考文献 23致 谢 25诚信声明 26家族遗传对Th1/Th2型细胞因子表达调控的影响 摘 要目的：通过观察儿童及其家族的Th1/Th2细胞因子表达情况，了解家族过敏史与儿童Th1/Th2细胞偏移的关系。方法：通过一份包含基本信息，本人过敏史，家族过敏史的问卷，选取10个家庭（共20人）进行抽血检查，分为有家族过敏史组和无家族过敏史组，每组各10人。用流式细胞术检测全血白介素4（interleukin-4,IL-4）和干扰素（interferon-,IFN-）的含量。结果：过敏性疾病患者的全血IL-4水平高于正常人，差别有显著意义（t=2.401,P0.05）;有家族过敏史组全血IL-4水平明显高于无家族过敏史组，差别有显著意义（t=5.770,P0.05）有家族过敏史组儿童的全血IL-4水平也明显高于无家族过敏史组儿童，差别有统计学意义（t=13.774,P0.01）。全血IFN-水平在两组间比较虽有差别但无统计学意义。有家族过敏史组成人全血IFN-水平低于儿童且有统计学意义（t=-4.110,P0.05）;无家族过敏史组成人全血IL-4水平高于儿童且有统计学意义（t=4.554,P0.05）。结论：家族过敏史对儿童Th1/Th2的平衡存在影响，有家族过敏史儿童的全血IL-4明显增高。IL-4水平是Th2细胞功能水平的直观体现，故有家族过敏史的儿童，Th2具有相对优势。关键词：家族过敏史，Th1 / Th2，过敏性疾病，儿童Effects of familial inheritance on regulation of Th1/Th2 cytokine expression ABSTRACTObjective:This question was answered through observing Th1/Th2 cytokine expressions of the children and their family.Method:We conducted a questionnaire survey in children, which included general condition, history of allergic disease (yes/no), familial allergic history (yes/no). 10 families, a total of 20 people (children and parents of each family) were recruited for blood test. Five families had familial allergic history and five did not. Then, flow cytometry (FCM) was used to detect the content of IL-4 and IFN- in whole blood. The results were analyzed by SPSS 17.0. Measurement data were expressed by MeanSD.Results:The level of IL-4 were increased significantly of allergic patiens compared with normal(2.401,P0.05);Have a family history of allergy group IL-4 levels were significantly higher than those without family history of allergy(t=5.770,P0.05);Children with a family history of allergies,whole blood level of IL-4 was significantly higher than children without a family history of allergies,the difference was statistically significant(t=13.774,P0.01).There were no significant differences in whole blood levels of IFN- between groups whether have a family history of allergy or not,but have a family history of allergy group IFN- levels were lower than controls.In family history of allergy group,the whole blood of IFN- levels in adult were significantly lower than children,and the difference was statistically significant（t=-4.110,P0.05）;On the other hand,in no family history of allergy group, the whole blood level of IL-4 in adult was significantly higher than that in children,the difference was statistically significant（t=4.554,P0.05）.Conclusion:Familial inheritance may have effects on the balance of Th1/Th2 cytokine in children. The level of IL-4 cytokine, which represents Th2 cell function in children with familial inheritance, increases significantly. In them, Th2 shows relative predominance.Key word: Allergic familial history; Th1/Th2; Allergic disease; Children前 言过敏性疾病是一种常见疾病，其临床表现有很多种，包括过敏性哮喘、过敏性休克、过敏性紫癜、变应性鼻炎、过敏性皮炎等。过敏性疾病是由I型超敏反应(又名速发型超敏反应)引起的，由IgE类抗体介导，肥大细胞和嗜碱粒细胞释放的活性介质引起生理功能紊乱或组织损伤。随着全球工业化程度的不断提高，过敏性疾病在过去几十年中发病率显著上升，已经成为影响人类健康的主要疾病之一，是全球关注的公众卫生问题，世界变态反应组织公布的30个国家过敏性疾病流行病学调查结果显示：在这些国家的12亿总人口中，22%（约2.5亿人）患有IgE介导的过敏性疾病，例如，过敏性鼻炎、哮喘、湿疹、食物过敏、药物过敏等。据WHO统计，全球约有1.5亿哮喘患者，其中50%以上成人及至少80%儿童患者均由过敏因素诱发，每年死于哮喘的患者在18万人以上1。2009年，陈燕等2对广州初中生做的流行病学调查结果显示：哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎的发病率分别是6.8%、24.7%、12.7%。在美国，从1991年-2003年，4岁以上的儿童哮喘发病率增加了160%，每年用于治疗过敏性鼻炎的费用至少有12亿美元3。在近8年间，美国医院的门诊和急诊用于治疗儿童特异性皮炎的费用已经接近740万美元4-5。湿疹在世界儿童中的发病率为10%-20%，成人为1%-3%6，尤其是在发达的工业化国家，经济条件较好和居住在城市的人群中发病率有持续上升的趋势6-7。儿童一般在2岁内达到食物过敏发病率的最高峰，1岁时为6%-8%，成年时下降为1%-2%8。过敏性疾病严重影响患者的生活和健康，尤其对于儿童的体质、性情和学习等会造成很大的不利影响，严重的全身过敏反应甚至会威胁生命，同时也给社会造成巨大的经济负担。过敏性疾病的致病因素很多，例如，饮食、气候、环境变应原接触、产前危险因素的暴露、遗传易感性等。有研究表明，过敏性疾病是多基因遗传病，一级亲属的遗传因素在过敏性疾病中起了主要作用9。国内外报道显示，父母亲有哮喘或过敏性鼻炎的儿童患哮喘等过敏性疾病的风险明显高于父母亲无过敏性疾病的儿童。在父母双方均无过敏性疾病时，其子女患过敏性疾病的几率为10%-20%；父母任一方患过敏性疾病时，其子女的患病几率为30%-50%；父母双方均患过敏性疾病时，子女的患病几率高达60%-100%10。目前，家族过敏史影响儿童过敏性疾病易感性的机制尚未明确，继续深入研究是十分必要的。根据细胞因子的分泌模式，CE4+T细胞可分为Th1和Th2亚群，它们来自同一个前体细胞Th0，Th1和Th2是Th0发展出的两种极化形式。Th1主要分泌IL-2、IFN-、IL-12、TNF-和TNF-,称为Th1型细胞因子，并介导细胞免疫，例如，激活细胞毒性T细胞（CTL）和巨噬细胞，介导迟发型超敏反应（DTH）；Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13，称为Th2型细胞因子，并介导体液免疫，如激活B细胞核嗜酸性粒细胞11。当Th1/Th2平衡失调时，即某一亚群功能增强，另一亚群功能减弱，Liblan称这种现象为“克隆转换”（cloned diversion）,也有人形象地称之为“Th1/Th2漂移”。在过敏性疾病中，Th2及其细胞因子占优势，即Th1/Th2异常偏向Th2漂移12。而一般认为IFN-/IL-4的相互作用是维持Th1/Th2平衡的关键。IFN-和IL-12等Th1型细胞因子可以抵抗并抑制Th2型反应导致的过敏性疾病13-14。IL-4是IgE合成过程中最重要的调节因子，能促进T细胞和B细胞增殖并诱导粘附分子表达。IL-5可协同IL-4刺激B细胞合成IgE，诱导嗜酸性粒细胞活化、增殖、分化、移行，延长其存活期。我们怀疑家族过敏史可能与Th1/Th2失平衡有关，因此，本研究旨在用流式细胞术探究家族遗传因素对Th1/Th2型细胞因子（主要是IFN-和IL-4）表达调控的影响。材料与方法1.对象选择 选择问卷调查中10个家庭共20人（包含儿童及父亲或母亲）进行抽血检查。20人中有10名成人，男4例，女6例（年龄325岁，体重指数22.11.8kg/）；10名儿童，男5例，女5例（年龄41岁，体重指数16.11.8kg/）。分两组观察，家族过敏史阴性组中有5个家庭共10人，家族过敏史阳性组中也有5个家庭共10人。阴性组成人男2例，女3例（年龄315岁，体重指数21.81.9kg/），儿童男2例，女3例（年龄41岁，体重指数161.9kg/）。阳性组成人男2例，女3例（年龄325岁，体重指数22.31.8kg/），儿童男3例，女2例（年龄41岁，体重指数16。11.7kg/）。阳性组家长患过敏性疾病，儿童经家长口述及皮试检查，确定没有过敏性疾病。阴性组的家长和儿童均为正常。阳性组中5名成人均患有过敏性鼻炎，其中2人还合并其他过敏性疾病，一人合并支气管哮喘，一人合并过敏性皮炎。2试剂和检测方法患者分别采集静脉血5ml，置于含肝素钠抗凝剂的绿头管中，标本需在抽血后2小时内处理，用流式细胞术检测全血中IL-4和IFN-的含量。2.1主要试剂CD3、CD8检测试剂盒及同型对照购自德国Beckman公司。IL-4，IFN-细胞因子的流式细胞检测试剂盒购自美国eBioscience公司。2.2 主要仪器CO培养箱及离心机购自德国Beckman公司；流式细胞仪（Beckman coulter epics XL）2.3实验步骤2.3.1检测项目CD3、CD8、IFN-r、IL-42.3.2四色法检测步骤（1）取200l全血于试管中，用RPMI1640(不含小牛血清-FBS)1:1等体积稀释。（2）加10l 1g/ml PMA工作液+8l 50g/ml Ionomycin工作液+6.8l 0.1mg/ml Monensin工作液（或4l 0.5mg/ml BFA工作液），混匀（3）37，5%CO培养箱培养4-6h。混匀，取100l已刺激全血（或PBMC液）加入10l CD3和10l CD8，室温，避光孵育15分钟。 A: IFN-r-FITC(10l)+IL-4-PE(10l)+CD8-PC5(5l)+CD3-ECD(5l) B: IgG1-FITC(10l)+IgG1-PE(10l) +CD8-PC5(5l)+CD3-ECD(5l) C: CD69-PE(10l)+CD3-ECD(5l)（4）每管中加入0.5ml新制备的固定/破膜液（固定/破膜液工作液：1份原液+3份专用释液），混匀，4避光孵育45min。（5）加2ml 1破膜液（1破膜工作液：1份原液（10）+9份纯水），混匀，1800rpm离心5min，弃上清。（6）重复d步骤一次（此时需用剩余的些许PBS轻轻震荡来重悬细胞，以免在后面的步骤中造成重悬细胞困难）（7）各管中按下表加入相应的抗体： A: IFN-r-FITC(10l)+IL-4-PE(10l)+CD8-PC5(5l)+CD3-ECD(5l) B: IgG1-FITC(10l)+IgG1-PE(10l) +CD8-PC5(5l)+CD3-ECD(5l)（8）4避光孵育30min(9) 每管加2ml的1破膜液洗涤1次，1800rpm离心5min,弃上清。（9）300-500l的1%多聚甲醛固定液重悬细胞，上机检测。3.统计学分析 用SPSS17.0软件进行数据分析，计数资料以率表示，各组间的比较采用独立t检验，p0.05具有统计学意义。结 果1.SPSS数据分析结果1.1 两组间比较分析有家族过敏史组的全血IL-4水平明显高于无家族过敏史组，差别有统计学意义（t=5.770，P0.05）。有家族过敏史组的全血IFN-水平低于无家族过敏史组，但差别无统计学意义（t=0.105，P0.05）（见表1、图1）表1有无家族过敏史的IFN-、IL-4分组结果Table1有家族过敏史无家族过敏史IFN-（%）16.56.416.99.8IL-4（%）0.4注： N=10，P0.05，P0.05图1两组血中IFN-、IL-4分析结果1.2有家族过敏史组的成人与儿童比较有家族过敏史组中，成人全血IFN-水平明显低于儿童，差别有统计学意义（t=-4.110，P0.05）。全血IL-4水平在成人与儿童间的差别无统计学意义（t=-0.096，P0.05）（见表2）。表2 有家族过敏史组IFN-、IL-4结果Table2成人儿童IFN-（%）4.5IL-4（%）4.0注： N=5，P0.05，P0.051.3无家族过敏史组的成人与儿童比较无家族过敏史组中，全血IFN-水平在成人与儿童间的差别无统计学意义（t=0.781，P0.05）。成人全血IL-4水平明显比儿童高，差别有统计学意义（t=4.554，P0.05）（见表3）表3 有家族过敏史组IFN-、IL-4结果Table3成人儿童IFN-（%）19.512.714.46.4IL-4（%）0.2注： N=5，P0.05，P0.051.4过敏性疾病患者与正常人比较过敏性疾病患者的全血IFN-水平明显低于正常人，但差别无统计学意义（t=-1.351，P0.05）。过敏性疾病患者的全血IL-4水平高于正常人，差别有统计学意义（t=2.401，P0.05）（见表4）。有家族过敏史组的成人全都是过敏性疾病患者，原始数据见图2。表4 过敏性疾病患者与正常人的IFN-、IL-4结果Table4过敏性疾病患者正常人IFN-（%）11.53.019.412.7IL-4（%）4.0注： N=5，P0.05，P0.05图2成人血中IFN-r和IL-4原始数据两组间比较1.5两组儿童间比较有家族过敏史的儿童，全血IFN-水平明显低于无家族过敏史的儿童，但差别无统计学意义（t=2.025，P0,05）。有家族过敏史的儿童全血IL-4水平明显高于无家族过敏史的儿童，差别有统计学意义（t=13.774，P0.01）（见表5）。原始数据见图3。表5 有家族过敏史儿童的IFN-、IL-4结果Table5有家族过敏史无家族过敏史IFN-（%）21.54.514.46.4IL-4（%）0.2注： N=5，P0.05，P0.05图3儿童血中IFN-r和IL-4原始数据两组间比较1.6两组间相关性分析有家族过敏史组与无家族过敏史组的全血IL-4和IFN-水平无显著相关性（r=0.676，P0.05）。讨 论过敏性疾病的发病率近年来呈上升趋势15，是影响儿童健康的常见慢性疾病之一。过敏性疾病的发病机理至今仍有许多尚待阐明的问题，但“卫生假说”在一定程度上解释了近年来过敏性疾病发病率上升的原因。该假说认为，在人群基因组未发生变化的情况下，过去几十年中过敏性疾病发病率显著增加主要是环境因素的影响。随着疫苗、抗生素的应用和卫生条件的改善，人群微生物暴露水平及感染性疾病发病率下降，特异性Th2细胞“卫生假说”22建立在T细胞在免疫应答中发挥不同作用的理论上，T淋巴细胞的活化依赖于特定抗原刺激抗原递呈细胞（APC）2，当特异性抗原刺激后，树突状细胞(Dcs)将信息传递给未致敏、处于初始状态的Th细胞（pTh），使其变为Th0细胞，并最终分化为Th1，Th2，Th9，Th17和Th22，不同T细胞亚群效应器释放各种细胞因子类及辅因子3。外周成熟的T细胞按照表型不同，可分为CD4+T细胞和CD8+T细胞。根据CD4+Th细胞所分泌的细胞因子不同53，可以分为Th1和Th2两个亚群。Th2细胞主要参与调节IgE应答及包括寄生虫感染引起的过敏性炎症反应4, 54。在过敏性疾病中，Th2细胞的分布存在多种因素影响。Th1细胞偏向于分泌IL-2、IFN-和TNF-，与迟发型超敏反应T细胞和细胞毒性T细胞的增值、分化、成熟有关，因此Th1细胞可促进细胞介导的免疫应答。有研究认为IFN-碎片及CXCR3+T细胞容易增加个体变态反应的细胞凋亡55，Th1细胞更易于活化或凋亡。在细胞介导的应答过程中，Th1细胞参与防御细胞内微生物及机体识别抗原后产生的IgG抗体记忆。除此之外，Th1细胞在变态性疾病中的效应机制中也起重要作用。Th2细胞偏向于分泌IL-4、IL-5及IL-13，它与B细胞增殖、成熟和促进抗体生成有关，故可增强抗体介导的免疫应答。IL-4还作用于pTh细胞，促进其向Th2细胞分化，进而分泌更多的IL-4和IL-13，被公认是特异性哮喘发病中最重要的细胞因子56，IL-4基因存在一系列多态性，它们与哮喘的多种表型相关联。染色体上IL-4基因附近，如IL-13基因可能是5q31上特应性和哮喘的位点。单核细胞趋化因子-1及OX40配体57能提供T细胞增殖和刺激信号，诱导Th2细胞产生能促使它产生极性57的细胞因子IL-4，因子与B细胞表面的相关受体结合，促进B细胞增值、生长。胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）是在上皮细胞上的异常生长因子，能代替IL-7促进生长和分化定性B细胞，表达出包括IgE受体在内的多种抗原。IL-4是IgE合成必不可少的因子58，与嗜酸性粒细胞增多症的发病机制相关。研究59表明TSLP含量在哮喘患者中明显增加。TSLP激活DC细胞表达OX40，启动过敏原特异性CD4+T细胞前提想Th2细胞分化，并迁移至炎症发生处，由Th2炎症细胞产生的Th2类细胞因子通过促进IgE，嗜酸性粒细胞和黏液的产生而启动过敏性炎症。因此起源于上皮细胞的TSLP不仅能够活化DC，而且能够通过DC促进CD4+T细胞向炎症Th2细胞转化，是过敏性炎症发生的一种主要启动因子。因此，Th2细胞的优势分化及Th2细胞因子的过度表达会引起过敏性疾病的发生。在妊娠期间，为减少母体与胎儿之间的免疫应答，Th1细胞的免疫反应会下调，Th1细胞分泌的细胞因子如IL-2及IFN-受到抑制。与此同时，Th2细胞分泌的细胞因子IL-4及IL-13相对增多，Th2细胞的免疫反应占优势。出生后，机体会暴露在各种微生物环境中，Th0细胞会分化为Th1细胞，在儿童5岁左右，Th1/Th2会恢复免疫平衡状态。如果在婴幼儿期间缺乏与微生物抗原的充分接触，发育中的免疫系统会丧失使Th0细胞向Th1分化，从而向Th2分化，使Th2的发育占优势，容易导致过敏性疾病的发生7, 47, 60。本研究结果显示，过敏性疾病患者全血IL-4水平比正常人高，差别有统计学意义，过敏性疾病患者的全血IFN-水平明显低于正常人，但差别无统计学意义，与韩睿的报道相似61。证明在过敏性疾病患者中，Th2细胞分泌的因子水平明显增高，Th1细胞分泌的因子水平下降。这可能与Th2细胞的免疫应答亢进从而抑制Th1应答有关，因为IFN-可以抑制Th2细胞的活性，对Th2细胞分泌的因子IL-4有拮抗作用，而IL-4是IgE合成的因子，因此，IFN-阻断了体内IgE的合成。由此可见，在过敏性疾病的发病机制中Th1/Th2失衡起一定作用。过敏反应是一种与遗传因素和环境因素有关的I型超敏反应引起的，由IgE类抗体介导，肥大细胞和嗜碱粒细胞释放的活性介质引起生理功能紊乱或组织损伤。在相同抗原、相同剂量的刺激下，具有遗传病史的人更容易出现较强的特异性免疫应答，在体内迅速合成IgE，因而更容易发生I型超敏反应7, 8, 62。本次结果显示，有家族过敏史的儿童全血IFN-水平明显低于无家族过敏史的儿童，但差异无统计学意义；而IL-4水平明显比无家族过敏史的儿童高，差别有统计学意义（呈现Th2细胞优势）。全血IFN-水平在有家族过敏史组中低于无家族过敏史组，有家族过敏史组的全血IL-4水平明显比无家族过敏史组高，差别有统计学显著意义。提示父母的遗传因素对儿童免疫状态有一定的影响。有家族过敏史的儿童日后更易于患过敏性疾病。有家族过敏史组中，成人全血IFN-水平明显低于儿童,差别有统计学意义，而全血IL-4水平在成人与儿童之间比较无统计学意义。无家族过敏史组中，全血IFN-水平在成人与儿童之间比较无统计学意义，成人全血IL-4水平明显比儿童高，差别有统计学意义。这可能与实验例数相对较少有关；也有可能是因为实验中有过敏性疾病史组的成人均是过敏性疾病患者，而儿童只是有家族过敏性疾病史，而无过敏性疾病的表现，免疫表现为Th2细胞占有优势；无过敏性疾病史组中，由于成人及儿童均为正常人，儿童不会表现Th2细胞发育占优势；由于参与实验的儿童年龄是41岁，而Th1/Th2平衡要到儿童5岁才会恢复，因此在过敏性疾病组中成人Th1细胞分泌的细胞因子IFN-水平明显低于儿童，无过敏性史组的成人Th2细胞分泌的细胞因子IL-4水平比儿童高。在遗传背景下，环境因素也起重要作用，因此过敏性疾病患者在不断受致病过敏原的刺激下，Th1细胞表达的IFN-水平明显降低。综上所述，家族过敏史对儿童Th1/Th2平衡存在影响，有家族过敏史的儿童其代表Th2细胞功能水平的细胞因子IL-4明显增高，Th2表现为相对优势，具有过敏性疾病的发生倾向。这类儿童需要尽量避免接触过敏原，及早采取防止措施，减低过敏性疾病发生的机率。目前过敏性疾病的治疗主要包括避免接触致敏的过敏原、药物治疗过敏症状及脱敏治疗等，脱敏治疗是从细胞及体液免疫的角度，调节患者的免疫平衡，其基本的免疫学原理是通过刺激Th0细胞向Th1分化，达到抑制Th2细胞的免疫反应，从而控制过敏性疾病的症状。脱敏治疗在治疗过敏性疾病中起着重要作用。Th1/Th2平衡与I型超敏反应引起的过敏性疾病的发生发展密不可分，通过调节Th1/Th2平衡来调节T淋巴细胞功能是有家族过敏史儿童的免疫治疗的重要方法。结 论家族过敏史对儿童Th1/Th2的平衡存在影响，有家族过敏史儿童的全血IL-4明显增高。IL-4水平是Th2细胞功能水平的直观体现，故有家族过敏史的儿童，Th2具有相对优势。参 考 文 献1Warner JO,Kaliner MA,Crisci CD,et al.Allergy practice worldwide:a report by the World Allergy Organization Specialty and Training CouncilJ.Int Arch Allergy Immunol,2006,139:166-174.2陈燕，李靖，钟南山.广东省城市与乡村儿童哮喘及过敏性疾病的流行情况比较C.中华医学会2010年全国变态反应学术会议暨中欧变态反应高峰论坛论文汇编.2010.3Eichenfield LF,Hanifin JM,Beck LA, et al.Atopic dermatitis and asthma:parallels in the evolution of treatmentJ.Pediatrics,2003,111:608-616.4Sicherer SH,Munoz-Furlong A,Sampson HA.Prevalence of peanut and tree nut allergy in the United States determined by means of a random digit dial telephone survey:a 5-year follow-up studyJ.J Allergy Clin Immunol,2003,112:1203-1207.5Horii KA,Simon SD,Liu DY,et al.Atopic dermatitis in children in the United States,1997-2004:visit trends,patient and provider characteristics,and prescribing patternsJ.Pediatrics,2007,120:e527-e534.6Wuthrich B,Cozzio A,Roll A,et al.Atopic Eczema:Genetics or 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