原核生物分子克隆的宿主和载体系统.ppt

第二章 原核生物分子克隆的宿 主和载体系统 本章节主要内容 l用于DNA复制的特殊大肠杆菌品系 lDNA克隆载体 l细菌DNA转化方法 l基因克隆的噬菌体系统 2 第一节 应用广泛的细菌宿主 一、E. coli K12 的生物学 l革兰氏阴性细菌 l没有核膜和染色体 l一个环状双链DNA分子，有一个复制起点 l细胞中能维持质粒DNA的复制 l生活周期较短，20min分裂一次 l能在发酵罐中高密度生长 l能在平板上培养出单克隆 3 A) lac operon结构以及表达特性 二、乳糖操纵子 lac Z: -gallactosidase (-半乳 糖苷酶，水解乳糖形成半乳糖和葡萄糖 ） lac Y: lactose permease（半乳糖苷 透性酶，运送乳糖透过细菌的细胞壁) lac A: transacetylase（半乳糖苷乙 酰转移酶，去除由半乳糖苷透性酶吸收 的有毒的硫代半乳糖苷 thiogalactoside) lac I: 乳糖阻遏蛋白基因 Plac :乳糖代谢结构基因的启动子 PI : 阻遏蛋白基因的启动子 CAP：代谢激活蛋白结合位点 4 阻遏蛋白四聚体不仅能被别乳糖结合，也能被与别乳 糖结构类似的物质如IPTG(异丙基-D-硫代半乳糖）结合 ，这种能高效诱导酶的合成，但又不被所诱导的酶分解的 分子，称为安慰性诱导物 5 二、乳糖操纵子 l利用-半乳糖苷酶及其基因 l-半乳糖苷酶能分解乳糖的类似物X-gal 形成蓝色物质，可用此反应来检测细胞中 -半乳糖苷酶的活性。 6 a-互补显色反应（蓝白斑筛选 ） lacZ - -半乳糖苷酶- 分解半乳糖 iPO 调控蛋白 -肽段 分解X- gal 产物呈现蓝色 诱导剂 IPTG -半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15 7 a-互补显色反应（蓝白斑筛选）总结 细菌菌株野生 型 突变体 （Lac Z-基 因） 突变体+无外源片段 插入质粒 （ Lac Z-+ Lac Z） 突变体+有 外源片段插 入质粒 （ Lac Z- ） Lac Z 蛋 白 有无（仅有 片段） 有（+片段）无（仅有 片段） 底物X-gal 分解情况 蓝色 菌落 白色菌落蓝色菌落白色菌落 抗生素抗性无无有有 8 第二节 质粒载体 一、质粒的基本生物学特征 l质粒是染色体外稳定遗传的复制体，其特点共价 闭环，双链DNA分子。 l大都数质粒具有复制原点，能独立进行复制，不 依赖寄主的细胞复制周期。 质粒 9 l质粒通常赋予寄主一些表型特征，如抗 生素抗性等。 l选择性标记(selectable marker):由于 质粒携带的基因，可供实验室条件下进 行选择的一些标记。如抗性，营养元素 的利用等。显性质粒与隐性质粒. 第二节 质粒载体 10 二、质粒的大小和拷贝数 l相对分子量从 1kb到250kb不等。分子量较小 的适合实验室利用 l拷贝数 严谨型:少数拷贝存在于细胞中（1-几个） 松弛型:多个拷贝存在于细胞中（10） 严谨型与松弛型是相对的。 第二节 质粒载体 11 （1）、反义RNA进行调控的机制 （plasmid Col E1 ） Ropdimer PRNAII RNA II A、在复制起点处， RNA II（长555个碱基）与质粒DNA形成 RNA-DNA复合物，RNA酶H的降解RNA II ，露出3自由羟基， 质粒复制起始。 三、调节拷贝数的机理(质粒的复制，补充知识) 12 B、 如果RNA I和RNA II形成双链RNA螺旋，RNA酶H不能 降解RNA II，复制不能进行。 Ropdimer PRNAII RNA II 13 C、 当质粒的浓度比较高 的时，RNA I和RNA II形 成双链RNA螺旋，使质粒 的复制不能起始。 D 、 当质粒的比较低时 ，RNA II与质粒DNA形成 RNA-DNA复合物，RNA酶H 降解RNA II 质粒复制起 始。 E、突变RNA I或去除Rop 基因导致质粒的拷贝数 增加。 14 (2 )关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理 （ pS101质粒） A 复制原点区域含有37拷贝的长度为1722bp的 重复区域，R1、R2、R3等。 15 (2)关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理 B、复制原点附近有一个编码基因repA,编码RepA蛋 白。 RepA是双功能的蛋白： 与复制原点区域的重复序列结合，起始DNA的 合成；与自身基因的启动子结合，抑制自身的转录 。 16 质粒拷贝数由RepA蛋白浓度和质粒自身的浓度 进行调节。 如果质粒拷贝数高， RepA蛋白与自身的启动子区 域结合，抑制转录，RepA蛋白合成受阻，DNA的复 制受到抑制。 RepA蛋白通过结合到两个质粒的重复序列把它们连 接起来，避免复制起始。 细胞分裂后，拷贝数和RepA蛋白的浓度降低， RepA蛋白自身合成增加，结合到重复区域起始DNA 的合成 。 (2 )关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理 17 问题：在寄主复制后，质粒是如何分 配到子细胞中？ Par原件会附着在细胞膜上，随着细 胞的分裂，质粒正确 分配到子细胞中， 维持相对稳定的质粒拷贝数。 18 第二节 质粒载体 四、相容性 l在没有选择压力的情况下，两种亲缘关 系密切的不同质粒，不能够在同一寄主 细胞系中稳定地共存的现象，称为质粒 的不相容性，或称为不亲和性（Plasmid incom- patibility)。这样的两种质粒 称为不亲和质粒 19 第二节 质粒载体 l引起质粒的不相容的机理 A 具有相同的复制调控机制 B 控制质粒分配的par元件相同,也会引 起质粒的不相容 l不相容群：指那些具有不相容性的质粒组 成的一个群体，一般具有相同的复制子 ColE1/pMB1 20 五、基于大肠杆菌的克隆载体 克隆载体：是一种能携带外源DNA片段进入受体 细胞，并在受体细胞中得到维持或表达的DNA分 子。 通常由天然的质粒、噬菌体或动植物的病毒改 造而成。 1 质粒克隆载体的命名法 pBR322 “p” 代表质粒 “BR”代表构建的实验室 “322”区别于其他的质粒 21 五、基于大肠杆菌的克隆载体 2、质粒载体的一般特性 （1）具有复制起点，在宿主细胞中能自主复制。 （2）具有选择标记基因 （3）具有若干限制酶单一位点 （4）具有较小的分子量和较高的拷贝数 22 R7268 ApR R1 drd 19 ApR CmR SmR SuR KmR pMB3 ApR pSF2124 ApR pBR312 ApR TcR pSC101 TcR 1 2 pM88 pMB9 TcR 3 4 ColE1 5 6 6 pBR313 ApRTcR pBR322 ApR TcR 7 8 pMB1 (b ) 五、基于大肠杆菌的克隆载体 3、第一个人工构建的遗传载体 23 4、改进了的载体（pUC载体乳糖选择质粒 ） l具有更高的拷贝数 l重组体的识别只需要一步 l拥有更多的多克隆单酶切位点 五、基于大肠杆菌的克隆载体 24 pUC载体乳糖选择质粒 p(1)来自pBR322质粒的复制起点(ori)； p(2)氨卞青霉素抗性基因(AmpR)，但它的DNA核苷酸序列已经 发生了变化，不再含有原来的限制酶的单识别位点； p(3)大肠杆菌-半乳糖苷酶(lacZ)的启动子及其编码该基 因氨基端-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ基因； p(4)多克隆位点(MCS)区段：位于lacZ 基因中的靠近5端 ，内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有 不同粘端的目的DNA片段可方便地定向插入载体中。但它并 不破坏lacZ 基因的功能。 25 26 pGEM载体克隆DNA的体转录 p加入了两个短片段，这两个片段在限制性 酶切位点的两侧，可被T7噬菌体的RNA聚 合酶或SP6 T7噬菌体的RNA聚合酶的识别 p方便了克隆DNA的体外转录，便于研究RNA 加工，合成蛋白质等的研究等 五、基于大肠杆菌的克隆载体 27 多拷贝 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ 装有两个噬菌体的强启动子用于外 源基因的高效表达 注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的 RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌 体RNA聚合酶，如E.coli BL21（DE3） 等 2743 bp MCS lac Z PT7 ori Apr pGEM-3ZPSP6 pGEM-3Z： 28 第三节 噬菌体克隆载体 l1 噬菌体的基本特征 l裂解周期 l溶源 l2 溶源性噬菌体 l原噬菌体 l溶源菌 l噬菌体，M13 29 l噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48 502bp。 l基因簇集排列 l线噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期 l线性噬菌体两端各有12个碱基的5凸出黏性末端 是互补的,该互补序列相互作用形成cos位点。 作用：进入细胞的DNA通过两端的黏性末端环化。 作为内切酶的识别位点 一、 噬菌体的生物学 30 31 32 1、对野生噬菌体的改进 A、 删除多余的限制性内切酶的位点。 B 、切除一些非必需序列，增加载体的容量。 C、设计阳性选择重组子的方法。 D、设计可方便地通过转录作用制备外源插入DNA的 RNA探针的载体 E、发展可以使插入的真核cDNA与半乳糖苷酶 形成融合蛋白的载体。 二、基于噬菌体的克隆载体 33 2、噬菌体基因组可删除的部分不影响生存能力 l噬菌体基因组中可以删除的序列与噬菌体进入从裂解 状态进入溶源状态以及从溶源状态进入裂解状态有关， 即与噬菌体整合和脱离大肠杆菌的染色体相关 l删除了这部分序列的噬菌体只能进行裂解循环 二、基于噬菌体的克隆载体 34 3、噬菌体载体可分为 q插入型载体：只具有一个可供外源DNA插 入的克隆位点。 失去了非必需区 切点又位于报告基因上，故在切开DNA并插入外源基因 后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选 可插入长度为10kb的外源DNA 二、基于噬菌体的克隆载体 35 两种报告基因的插入型载体 lcI基因内保留HindIII和EcoRI单酶切位点，当有 外源DNA在这酶切位点插入时，使cI基因失活，感 染hf-大肠杆菌后可形成空斑（ 如gt10） 。 l在噬菌体DNA插入的lacZ基因末端设有单一的 EcoR酶切位点。在此处插入外源基因，可表达 -半乳糖苷酶的融合蛋白，利用特异性抗体或 DNA测序方法可筛选重组DNA。这类载体适宜构建 cDNA文库(如ZAPII) 二、基于噬菌体的克隆载体 36 q替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的 DNA区段可以被外源插入的DNA所取代。 可克隆的片段大，最大可达23kb，而质粒最大仅10 kb左 右； DNA的长度大于野生型噬菌体DNA长度的75而不超过 其105时，才能被包装成噬菌体颗粒，当DNA的长度短于 野生型的75%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降， 因此要求载体DNA和外源DNA长度之和在3953kb之间。 二、基于噬菌体的克隆载体 37 三 克隆载体的体外包装 l体外包装： 模拟噬菌体DNA分子在宿主细胞内发生的 包装过程，将重组的噬菌体DNA分子包装成成 熟的具有感染能力的噬菌体颗粒 l必要性： 噬菌体重组分子直接感染大肠杆菌的效 率较低，而在试验过程中，因内切酶的处理， DNA的连接产生的有效分子等原因，使得转染效 率更低 38 三 克隆载体的体外包装 39 三 克隆载体的体外包装 l单菌株体系 缺陷型噬菌体在cos位点有突变， 噬菌体的DNA复制不能完成，但可形成 外壳蛋白，可以制备包装所必须的各种外 壳蛋白。 40 三 克隆载体的体外包装 3 双菌株的体外包装原理 A 噬菌体的头部和尾部的包装是分开进行 B 头部基因发生突变的噬菌体只能形成尾部 C 尾部基因发生突变的噬菌体只能形成头部 D 两种不同突变的噬菌体混合起来，能在体 外装备形成有活性的噬菌体颗粒 41 Lyse, mix Add ATP and concatemerized DNA Mature phage particles 42 重组噬菌体的鉴别 lacZ基因功能选择方法 类似于质粒中的蓝白斑筛选 cI基因功能选择法 cI 插入失活的噬菌斑是“清澈”的，而野 生型正常的噬菌斑是“浑浊”的 43 5.4 重组噬菌体的鉴别 Spi-（sensitive to P2 inhibition）正选择 A 野生型噬菌体，不能在P2噬菌体溶源性细菌 中生长，为Spi+，即对在P2噬菌体的抑制成敏感 反应。 B 噬菌体载体中的red和gam区段被外源片段取 代后， 噬菌体就能在P2噬菌体溶源性细菌中 生长。 44 5.4 重组噬菌体的鉴别 基于基因组大小的筛选 l包装体系只能将大小37-52Kb的DNA分子插 入到噬菌体的头部结构中 l插入型载体（第六章）通常删除了噬菌体 的中非必须的基因部分，因此中有重组后 介于3752Kb的分子才能被包装。 45 二、M13 噬菌体克隆载体 M13噬菌一般特点 l仅6407 个核苷酸 l有双链环状，单链环状存在形式 l基因组采取滚环复制形式 l适合做载体 l具有比噬菌体更大的装载能力 l单链形式在某些实验过程很重要，如测序 、体外突变等 46 47 第四节 外源DNA和载体的连接 48 1、互补黏性末端之间的链接 同一限制酶切割位点连接： 由同一限制性核酸内切酶切割的 不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割DNA后产生单链 突出（5突出及3突出）的粘性末端，同时酶切位点附近的 DNA序列不影响连接，那么，当这样的两个DNA片段一起退火时 ，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在DNA连接酶催化作用 下形成共价结合的重组DNA分子。 一、外源DNA和载体连接的方法 49 50 一、外源 DNA 和载体的连接方法 2、平末端之间的链接 DNA连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切 酶切割的平端之间的连接。原则上讲，限制酶 切割DNA后产生的平端也属配伍末端，可彼此 相互连连接；若产产生的粘性末端经经特殊酶处处理 ，使单链单链 突出处处被补齐补齐 或削平，变为变为 平端， 也可实实行平端连连接。 操作方法同黏性末端之间的链接，增加酶的用 量。 51 3 、将粘末端加到平末端分子上 DNA 接头 同聚物加尾产生粘性末端 PCR产物的克隆连接（特例） 一、外源 DNA 和载体的连接方法 52 DNA 接头 53 同聚物加尾连接是利用同聚物序列，如多 聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端 转移酶(terminal transferase)作用下，在 DNA片段端制造出粘性末端，而后进行粘性末 端连接。这是一种人工提高连接效率的方法， 也属于粘性末端连接的一种特殊形式。 同聚物加尾产生粘性末端 54 dATP dTTP 55 PCR产物的克隆连接 lPCR反应中所使用的聚合酶具有末端 转移酶的活性，通常在3末端加上A 。 l经特使处理的载体具有3 突出T碱 基，通过T/A互补，进行克隆。属于 黏性末端的连接，该克隆方式特称TA 克隆。 56 从生物秀网站下载 57 二、定向克隆 l将外源DNA按正确的方向插入载体。通常 采用不同的内切酶分别处理载体和片段， 使线性载体和片段的两段带有不同的粘性 末端，通过载体与片段之间的连接，实现 定向克隆。 58 第五节 ：一个基因在E. coli 中的调节表达 59 一、研究目的 l研究拟南芥中钙结合蛋白肌钙网蛋白 在花中的功能。 l需制备该蛋白的抗体 60 二、研究基础 l获得了基因的cDNA克隆 l获得了原核表达载体和细菌菌株 l获得了纯化蛋白质用的金属螯合层析柱 l具备免疫家兔的实验技术 61 三、研究策略 l1、构建原核表达载体 l2、纯化蛋白 l3、免疫家兔 l4、检测该蛋白质在花中的表达 62 MCS 将外源片段与载 体用相同的内切 酶处理后，连接 ，形成重组分子 ，构建表达载体 1、如何构建载体？ 63 l2、原核表达载体pET系统能够表达外 源基因的原理 （a）分别利用 T7 RNA聚合酶转录目标基因，用 大肠杆菌自身的系统翻译合成目标蛋白质。 （b）需要大肠杆菌能表达T7 RNA聚合酶 （c）加入诱导物（IPTG，异丙基-D-硫代半乳 糖苷 ）同时开启T7 RNA聚合酶和目标基因的表 达。 （d）对SD序列与AUG之间的距离进行了优化 64 lac O T7 gene 1 lac promoter E.Coli, RNA 聚合酶 lac I gene lac I repressor IPTG 诱导 Host cell T7 RNA 聚合酶 lac O T7 promoter target gene lac I gene lac I repressor pET T7 RNA polimerase 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