植物胚胎培养.ppt

第第 七七 章章 植植 物物 胚胚 胎胎 培培 养养 7.1 胚胎培养的内容及意义 7.1.1 胚胎培养意义 离体胚胎培养可以克服种、属间 受精障碍，打破种子休眠，缩短 育种周期，克服种子生活力低下 和自然不育等，对于植物界物种 的进化具有极其重要的意义。 （一）植物受精不育的机理 （二）打破种子休眠 （三）缩短育种周期 （四）克服种子生活力低下提高萌发率 （五）克服种子的自然不育性 （六）种子生活力的测定 内容 （一） 植物受精不育的机理 （1）自然界两种隔离机制。植物界由于长 期自然选择的结果，产生两种隔离机制： 拒绝异种受精，杂交不亲和现象在种， 属以上的植物杂交中，常常可以见到，由 于杂交不亲和性的存在，才能保持物种的 遗传稳定性。 拒绝自花受精，由于自交不亲和现象的 存在，才能确保物种具有强生活力。 （2）植物受精不育障碍的表现形式 花粉在柱头上不萌发，或萌发后花粉管不 能伸入花柱或生长缓慢，使配子丧失受精机 会。这类不育障碍，可采用试管受精的方法 克服。 花粉管生长正常，有配子融合但由于胚败 育而引起的受精不育。胚败育的原因：可能 是胚乳早期败育或胚胎发育和珠心组织发育 不同步。 有配子融合，但缺乏同源染色体，染色体 配对上出现障碍。培养时可以兼用秋水仙素 染色体加倍，可等到可育植株。 （二） 打破种子休眠 种子休眠的原因很多，但是能利 用幼胚培养打破种子休眠的情况有 如下两种： （1）种胚发育不全 （2）抑制物质抑制种胚发芽 （三） 缩短育种周期 柑橘（芸香科）为多胚植物，除正 常有性胚外，还可以从珠心组织发生 多个不定胚。常规杂交育种中，不定 胚干扰了对有性胚的识别。再者，不 定胚的生长势强，具有很强的竞争力 ，因而影响柑橘杂交育种的结果。利 用胚离体培养的方法，可以使合子胚 正常发育成植株。 （四） 克服种子生活力低下提高萌发率 杂交育种中以某些种的早熟种为母本而 获得的杂种，种子生活力低下，甚至经过 冷藏处理也不能萌发。 例：“京早3号”早熟桃（杂交种）熟性比 一般早熟桃提前1520d。在25正常 冷处理，60d后播种，出苗极不整齐。在2 5预冷后取胚接种培养，57d后萌发 ，2030d长成46cm高的苗（覃兰英， 1974）。 （五） 克服种子的自然不育性 长期营养繁殖的植物，具有形成 种子的能力，但它们的种子常是无 生活力的。胚胎培养有可能促进这 类种子的萌发和形成幼苗。 （六） 种子生活力的测定 测定休眠后的种子生活力，应用一般的 种子萌发试验需很长时间，特别是木本 植物需要层积处理打破休眠。 tukey（1944）发现未经层积处理的和 经层积处理的种胚，离体培养条件下萌 发速率一致。因此，这一方法用于快速 测定种子生活力已被广泛采用。 总 结 胚胎培养的意义 1、克服杂种胚的败育，获得稀有杂种 2、获得单倍体和多倍体植株 3、打破种子休眠，促进胚萌发 4、快速繁殖良种，缩短育种周期 5、克服种子生活力低下和自然不育性，提高 种子发芽率 6、种子活力的快速测定 7、种质资源的搜集和保存 8、研究胚胎发育的过程和控制机制 7.1.2 胚胎培养的内容和概念 胚胎培养是植物组织培养的一个 主要领域。植物胚胎培养是指对植 物的胚（种胚）及胚器官（如子房 、胚珠）进行人工离体无菌培养， 使其发育成幼苗的技术。 主 要 内 容 (一) 胚培养 (二) 胚珠培养 (三) 胚乳培养 (四) 试管受精 (一) 胚培养 1）成熟胚培养：指子叶已形成的种胚。仅提供一 定温度、湿度就可以发芽长成植物体。如种子 发芽。 2）幼胚培养：胚龄处于原胚期、球型期、心型期 、早鱼雷期的幼胚的培养。这几个时期幼胚从 生理至形态均未成熟，提供一定温度和湿度均 不能发芽。在远缘杂交育种上幼胚培养有极大 的利用价值。 (二) 胚珠培养 1）未受精的胚珠的培养，目的是为试管受精提 供雌配子体；也可诱发大孢子发育成单倍体植 株。 2）受精后胚珠的培养，胚珠内胚的发育处于早 期阶段，从两个细胞的原胚开始至球形胚阶段 。如兰科的成熟胚很小，采用胚珠培养较易成 功，也同样能达到使胚发育成幼苗的目的。 柱头 花柱 子房 花梗 花托 花组成 胚囊 卵细胞 株心 珠 孔 反足细胞 珠 被 胚 珠 极核 株柄 (三)胚乳培养 指处于细胞期胚乳的离体培养。 (四)试管受精 指培养未受精的胚珠并在试管内撒 播花粉，使其受精形成具有生活力的 种子。 7. 2 胚 培 养 植物在受精后，受精卵形成合子，随 即进行第一次分裂，进而形成分生组织 和幼胚，再发育成成熟胚。在这个过程 ，胚靠消耗胚乳的营养而发育，同时胚 处在胚囊环境中，可吸收氨基酸、维生 素等营养。离体胚培养包括胚胎发生过 程中不同发育期的胚，一般可分为成熟 胚和幼胚培养。 7.2.1 离体胚培养的方法 （一）成熟胚 将受精（传粉）后的果实或种子 （带种皮）用药剂进行表面灭菌， 然后在无菌操作台上，剥出种胚接 种于预先配制好的培养基上，使裸 露的胚，在人工控制的条件下，发 育成一棵完整的植物体。 种子植物离体的成熟胚，在只含 大量元素的无机盐和糖的培养基上 就可萌发生长。对成熟胚的培养而 言，大多是利用这种技术来研究胚 发育过程的形态建成、生长物质的 作用、各部分的相互关系，以及营 养要求等生理问题。 （二）幼胚 发育早期的幼胚，由于胚胎发育要求 更为完全的人工合成培养基，而且剥离 技术要求很高，用成熟胚的培养方法很 难成功，可以采用胚珠预培养的方法。 具体做法：将授粉后的子房剥出用药 剂进行表面消毒，在无菌条件下切取胚 珠进行预培养。培养一定时间后，再将 胚从胚珠中剥出，接着培养裸露的胚， 使其在人工控制的条件下，发育成一棵 完整的植物体。 从离体胚到完整的植株，其发育 途径有3条： 1、正常胚胎发育途径 2、脱分化形成愈伤组织 3、早熟萌发产生畸形苗 7.2.2 胚龄与胚性发育的关系 不同发育时期的幼胚，离体培养成 功率差异很大。一般胚龄越大成功率 越高，相反胚龄越小成功率越低。处 于原胚期的幼胚即使采用胚珠预培养 的方法，也仅有少数植物种能够成功 ，如烟草、矮牵牛、朱顶红、棉花。 离体培养中幼胚培养的成功率主要取 决于培养基的组成。 胚龄 胚长度（m） 营养需要（培养基营养） 早球形胚 2060 小于40m长的胚尚不清楚 后球形胚 6180 大量、微量、vb1、vb6、烟酸、糖 2、iaao.1mg/l十kto001 mgl 心形胚 81450 大量、微量、vb1、vb6、烟酸、糖2 鱼雷胚 451700 ca（no3）2480、kno363、kcl42 、mgso463 kh2po442、vb1、vb6、烟酸、糖2 成熟胚（手杖胚）最大极限（700m） ca（no3）2480、 kno363、kcl42、mgso463、糖 2 例：raghavan(1966)对不同发育时期的荠 菜胚进行离体培养，了解荠菜胚发育的 营养需要（表7l）。 结果表明： （1）培养已分化的成熟胚，只需提供简单的 营养元素。即在含有大量元素无机盐和糖的培 养基上，成熟胚就能萌发成一棵正常植物体。 （2）培养未分化的幼胚，要求完全异养的条 件。对培养基要求高。除要求提供大量和微量 无机盐混合物外，还需提供有机物（维生素类 ）和植物激素。 （3）早球胚期（204m）的幼胚更难培养 。因为它们的营养需要尚不清楚。 适宜胚胎培养的基本培养基和附加物 基本培养基： tukey（1934） rangaswamy（1961） randilphcox（1943） norstog（1963） rijven（1952） white（1963） nitsch（1953） rappaport（1954） 附加物： 维生素类：除常用的vb1、vb6、烟酸外，还有 生物素、泛酸钙、vc 氨基酸类：除甘氨酸外，还有谷氨酸、天冬氨 酸、谷氨酸胺、天冬酰胺 核酸及其水解物：腺嘌呤（ade）、胞嘧啶、 尿嘧啶、鸟嘧啶、水解酪蛋 白，酵母提取物、 椰乳、麦芽提取物等 植物激素：除生长素、细胞分裂素外，还有赤 霉素 7.2.3 离体胚培养的技术关键 有关受精后的幼胚培养，除考虑胚 龄之外，还应重视在离体条件下幼胚 分化和发育的环境条件、渗透压和酸 碱度条件等。 （一） 培养基渗透压对胚性发育的作用 培养基渗透压，对幼胚发育的重要性，与 其他器官培养一样。因为幼胚在自然条件下 赖以生存的是无定形的液体胚乳，具有较高 的渗透压，人工培养基中要创造高渗透压的 条件，渗透压的调节主要依赖于糖，糖在胚 培养中具有三个方面作用：调节渗透压、作 为碳源和能源和防止幼胚的早熟萌发。 （1）幼胚早熟萌发的概念 在含有无机盐、有机物和蔗糖的培 养基上，离体培养的幼胚越过正常胚 胎发育阶段，在未达到生理和形态成 熟的情况下，萌发长成幼苗，称早熟 萌发。早熟萌发成的幼苗往往畸形、 细弱，甚至不能存活。所以幼胚培养 中，防止早熟萌发是非常重要的。 （2）防止幼胚早熟萌发的方法 提高培养基渗透压。胚龄越小要求的渗透 压（糖浓度）越高，高糖浓度控制幼胚早熟 萌发的效果早已被证实。下述实例阐明不同 胚龄对糖浓度的要求。 提高无机盐浓度。提高无机盐浓度也是为 了提高培养基渗透压。可加入适量的nacl 以提高渗透压，浓度一般为0204 ，超过08对胚有毒害作用。 加人甘露醇提高渗透压。甘露醇的浓度为1 l55，以部分地代替蔗糖，使幼 胚在等渗条件下继续胚性发育。 （二） 培养基酸碱度对胚性发育的影响 培养基酸碱度对胚性发育也是非常重 要的。通常胚培养所用ph值的范围为 5.2-6.3。因植物种类不同而有所差异。 如： 荠菜： 5.47.5 桃：5.8 曼陀罗：5.0一8.1 水稻：5.0 番茄： 6.50 大麦：4.9 (三) 环境条件对胚性发育的影响 1）光照条件： 由于胚在胚珠内发育是不见光的。一 般认为在黑暗或弱光下培养幼胚比较适 宜。光照对胚胎发育有轻微抑制作用， 离体培养条件下，幼胚正常胚性发育对 光的要求，还应根据植物种类来决定。 光照可以促进某些植物的胚转绿， 利于胚芽生长，而黑暗利于胚根生长。 因此以光暗交替培养较为有利。 棉花：胚先在黑暗中培养，然后转 人光照下培养，子叶的叶绿素生成 很慢；而转人弱光下培养的幼胚， 子叶很容易产生叶绿素。 芥菜：胚培养每天以 12 h光照比全 暗条件好。 2）温度条件： 因植物种类而异，幼胚培养与其 他器官培养无多大区别。对于大多 数植物的胚来说，在2530为宜 ，但是，早熟果树如桃的种胚，必 须经过一定的低温春化阶段才能正 常萌发生长，而马铃薯胚以20为 好。 7.3 胚乳培养 7.3.1 胚乳离体培养的意义 被子植物的胚乳是双受精的产物，是由精 细胞和二个极核融合而成，故胚乳细胞为 三套染色体。但是由于胚囊类型不同，参 加融合的极核数目不同，胚乳的倍性亦不 同。如待宵草型胶囊只有一个极核与精细 胞融合，胚乳核为2n；贝母型胚囊两个极 核，其中一个是n，另一个是3n，与精细胞 融合后胚乳核为5n；椒草型胚囊中有8个极 核，与精细胞融合后胚乳核为9n。 胚 囊 至今，尚未见到胚乳细胞在自然状态下器 官发生的报道。最早报道由玉米胚乳离体培 养得到可连续生长的愈伤组织（lampe等， 1933）。后来在巴婆(番荔枝科)、黄瓜（葫 芦科）、黑麦草（禾本科）、蓖麻（大戟科 ）、桑寄生科、檀香科等植物相继报道由胚 乳培养得到愈伤组织。最先报道由胚乳组织 培养而器官发生的是柏形外果（檀香科）的 芽分化（ johri等，1965）；通过离体胚乳 培养第一个得到三倍体的植物是罗氏核实木 （大戟科）（johri，1978）（表72，表7 3）。 当前胚乳离体培养的研究进展： 1)仅能形成愈伤组织的有：巴婆、黑麦草、 黄瓜、檀香、小麦、沙针、美洲懈寄生、 澳洲根寄生。 2）达到器官分化水平的有：玉米、蓖麻、 巴豆、麻疯树、变叶木、黑种草、葡萄荷 叶芹、桃、柏形外果、印度五蕊寄生、白 花寄生、酸细檀、怒江钝果寄生、楔叶钝 果寄生。 3）能形成完整植株的有：罗氏核实木、大 麦、水稻、苹果、抽、橙、马铃薯、桃、 荷叶芹。 目前为止，约有30种被子植物的胚 乳培养，达到不同程度的细胞分裂和 器官分化。说明胚乳组织也具有发育 成植株的潜在能力。在应用上胚乳培 养为植物界创造新种提供了一条可行 途径。 7.3.2 胚乳培养的方法 取有胚乳的果实或种子，进行表面 灭菌，然后在无菌条件下剥离胚乳 接种培养。培养时有带胚培养和不 带胚培养两种方式。 带胚培养胚乳组织容易成功，不 带胚培养胚乳组织成功率低。 取授粉48天后的幼果，常规消毒后， 在无菌条件下切开果实，取出种子，小心 分离出胚乳。接种在培养基上，可用ms、 white等，加入2，4-d或naa0.52.0mg/l ，ba0.11.0 mg/l。在2527和黑暗条 件或散射光下培养,约610天胚乳开始膨 大,再培养形成愈伤组织。这时应转到分化 培养基上培养,分化培养基可加入0.53.0 mg/l的ba及少量的naa。待愈伤组织长出 芽后,切下不定芽,插入生根培养基中，光 下培养1015天,切口处可长出白色的不定 根。 7.3.3 胚乳培养的技术关键 (一) 胚乳发育时期的影响 双受精后的胚乳核，先分裂形成游 离核。把这一时期的胚乳称为“游离 核期”。继续发育后形成细胞壁，即 形成许多小的细胞。这一时期称为“ 胚乳细胞期”，见图71。 游离胚乳核 受精卵 一 受精后12小时的状态 二 受精后36小时的状态 球状胚体 以“游离核期”的胚乳为材料离体培养 很难成功；而“细胞期”的胚乳为材料离 体培养成功率较高。这一特点已被许多植 物胚乳培养实例所证实，如玉米、柑橘、 苹果、梨等。 植物种类不同，传粉后胚乳进入细胞期 的时间不同，胚乳细胞终止有丝分裂的时 间不同。玉米胚乳在授粉后3-5d进入细胞 期，8-12d胚乳细胞处于旺盛细胞处于旺 盛分裂期，22d胚乳核有丝分裂。 几种植物胚乳双受精后进入细胞期的 时间 梨（锦丰、早酥） 20d 黑麦草 810d 小麦 5d 大麦 5d 黄瓜 716d (二) 胚性因子的作用 胚乳组织培养中，一个值得注意的问题 ，即在诱导胚乳组织增殖，形成愈伤组织 时，必须要有胚的存在。当愈伤组织形成 后，除去胚并不影响胚乳组织的增殖。胚 对胚乳的增殖作用，有人认为是某种“胚 性因子”在起作用。 “胚性因子”究竟是什么？ 用巴豆（bhojwani，1968）、核实木和蓖麻（ srivastava，1971）为实验材料，将成熟胚乳组织 片，在培养之前先用不同浓度的ga3，或iaa进行浸 泡预处理12 h、24 h、36 h、48 h，然后转移至如 下两种培养基上：iaaktch（水解酪蛋白） ；2，4-d+酵母提取物进行培养。发现用12mg l ga3（赤霉素）浸泡36 h的核实木的胚乳组织 ，在无胚的情况下，可形成愈伤组织并分化出绿色 芽体。苹果（母锡金，1977）的胚乳培养中亦有类 似的情况。说明植物激素对胚乳的增殖和分化的作 用。柚子胚乳培养中，无论带胚或不带胚均可获得 愈伤组织并分化成植株。不过所用的培养基中均具 有赤霉素，故认为这种“胚性因子”就是赤霉素。 当然ga的作用仍需继续探讨（王大元，1977）。 有人在培养葡萄和苹果未成熟胚乳组织（ 细胞期软组织）时，证明胚乳细胞的增殖和 器官分化并不需要胚的存在。后来发现在柚 子、水稻、大麦未成熟胚乳培养中亦有类似 情况。“胚性因子”究竟是什么？植物激素 是肯定的，至于哪些激素在胚乳培养中，可 起到“胚性因子”的作用，还要看植物体内 内源激素的种类和含量才能判断。 (三)培养基酸碱度对胚乳组织培养的影响 根据不同植物种类进行ph值调节，不 同植物种有其最适应的ph值。 玉米6.l7.0 核实木5.6 蓖麻5.0 苹果6.06.2 麻疯树5.2 巴婆40 7.4 植物的离体受精 7.4.1 离体受精的概念和意义 从花粉萌发到受精形成种子，从 种子萌发到幼苗形成的整个过程 ，均在试管内完成，称离体受精 ，或试管受精。 离体受精技术在克服植物受精不育障碍 ，特别是克服花粉在柱头上不萌发或萌发 后花粉管不能伸入花柱，或在花柱中生长 缓慢，使配子不能如期融合的障碍有着极 其重要的意义。 重要作用有如下三点：可以克服自交 不孕；使亲缘关系更远的植物进行种间 或属间杂交；诱导孤雌生殖。1990年管 启良等进行大麦和硬粒小麦属间试管受精 ，得到了试管种子和幼苗。 7.4.2 离体受精的方法 将未授粉的子房，经表面灭菌后， 切开取出胚珠，接种在培养基上。然 后，在试管内撒播花粉。花粉发芽后 ，花粉管长人胚珠内受精。受精后的 胚珠进一步发育形成种子。种子能在 培养基上发芽长成植株。 具体作法有5种 （1）从胎座上切下单个胚珠（裸露胚珠）， 接种在培养基上，然后撒播花粉的方法。 （2）带着完整胎座或部分胎座接种并撒播花 粉的方法。 （3）带着完整子房或部分子房壁接种并撒播 花粉的方法。由于带着完整子房，对于解 决花粉和柱头，花粉管和花柱两种形式的 受精障碍不起作用。故发展到切去柱头和 花柱直接在子房上散布花粉的作法。如烟 草试管受精。 （4）柱头接近法。将花粉撒在本种植物的柱头 上，切下柱头接种在培养基上。然后在柱头周 围，接种异种裸露胚珠，花粉在本种植物的柱 头哺育下发芽，花粉管伸长并进人胚珠受精。 这一方法是解决花粉发芽和胚珠培养，在培 养基组成上发生矛盾时，所采用的一种方法。 （5）哺育法。将胚珠表面先蘸满有助于花粉发 芽的培养基接种培养，然后在胚珠上撒播花粉 使之受精。这一方法是解决胚珠存活率和花粉 发芽、花粉管伸长培养基发生矛盾时的作法。 7.4.3 离体受精成功的技术关键 (一) 离体胚珠的成活率和受精力 试管受精的成功率与胚珠的成活率 有着密切关系。提高离体胚珠成活率 的关键是培养基。因此要对培养基的 各种成分进行详细的筛选