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江苏大学 硕士学位论文 克氏螯虾壳聚糖抗菌机制的初步研究 姓名：朱旭明 申请学位级别：硕士 专业：临床检验诊断学 指导教师：郑铁生 20090605 江苏大学硕士学位论文 摘要 目的： 掌握克氏螯虾壳聚糖的提取和鉴定的方法，检测克氏螯虾壳聚糖 的抗菌活性，初步探讨克氏螯虾壳聚糖的抗菌机制。 方法： 1 ) 以克氏螯虾外壳为原料，用除钙、脱蛋白、脱乙酰基等方法制备 具有一定分子量及脱乙酰度的壳聚糖。 2 ) 以大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌作为试验菌株，用荧光试剂5 ( 6 ) 一 羧四甲基罗丹明一5 马来酰亚胺对克氏螯虾壳聚糖进行荧光标记， 然后用游离荧光试剂、标记上荧光的壳聚糖及未标记荧光的壳聚 糖进行抗菌试验，观察荧光标记物对壳聚糖抗菌活性的影响。 3 ) 用克氏螯虾壳聚糖与试验菌作用，进行细菌内容物泄漏试验；用 十二烷基磺酸钠( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ，s d s ) 进行协同溶菌试 验；用透射电镜( t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ，t e m ) 观察 细菌菌体形态变化；以荧光标记壳聚糖作为荧光标记物，在激光 共聚焦显微镜( 1 a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p e ，l s c m ) 下观 察壳聚糖在细菌的聚集部位，推导克氏螯虾壳聚糖的抗菌靶位。 结果： 1 ) 克氏螯虾外壳含有较高含量的壳聚糖，壳聚糖的分子量与提取过 程中的泡酸时间有关，脱乙酰度与乙醇钠回流时间有关。 i 江苏大学硕士学位论文 2 ) 抗菌试验表明，相比未标记荧光壳聚糖，荧光标记壳聚糖的抗菌 活性有所降低；当壳聚糖与荧光物质体积比为9 ：1 时，壳聚糖的 抗菌活性保留5 0 。 3 ) 克氏螯虾壳聚糖可导致菌内物质泄漏，并能协同十二烷基磺酸钠 发挥溶菌作用；t e m 发现细菌和壳聚糖作用后，形态变得不规则、 胞质发生泄漏；l s c m 发现，壳聚糖不仅能粘附在细菌表面，还 能进入细菌。 结论： 本研究从克氏螯虾外壳中提取了具有一定分子量及脱乙酰度的 壳聚糖；相比未标记壳聚糖，克氏螯虾壳聚糖与荧光物质体积比为 9 ：1 时，既保存了5 0 的抗菌活性，又获得可视荧光，可作为一种荧 光标记物用于抗菌靶位研究；克氏螯虾壳聚糖的抗菌机制不仅包括破 坏细菌表面的屏障功能，引起菌内物质泄漏和细菌形态变化，还包括 进入细菌内部干扰其代谢。 关键词：壳聚糖，克氏螯虾，抗菌机制，荧光标记，激光共聚焦显微 镜 o b j e c t i v e ： 江苏大学硕士学位论文 t om a s t e rt h em e t h o dt oa b s t r a c ta n dc h a r a c t e r i z ec h i t o s a n ( c t s ) f r o mr e ds w a m pc r a y f i s h ，w eu s e ds h e l l so fr e ds w a m pc r a y f i s h t o i n v e s t i g a t et h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e so fc t s f r o mr e ds w a m pc r a y f i s h a n ds t u d yt h ea n t i b a c t e r i a lm e c h a n i s m , w ec a r d e do u tc o r r e s p o n d i n g e x p e r i m e n t s m e t h o d s ： 1 ) c t s f r o mr e ds w a m p c r a y f i s h ，w i t hp a r t i c u l a rd e a c e t y l a t e dd e 伊e e a n dm o l e c u l a rw e i g h t ，w a so b t a i n e df r o ms h e l l so fr e ds w a m p c r a y f i s hb y t h em e a n ss u c ha st a k e o f fc a l c i u m ，p r o t e i na n d d e a c e t y l a t i o ne ta 1 2 ) w i t he s c h e r i c h i ac o l i 候c o l t ) a n ds t a p h y l o c o c c u sa u r e u s a u r e u s ) a sb a c t e r i at e s t e d ，c t sf r o mr e ds w a m pc r a y f i s hw a sl a b e l l e db y f l u o r e s c e n t r e a g e n t5 ( 6 ) - c a r b o x y t e t r a m e t h y l r h o d a m i n e - 5 - m a l e i m i d e 【5 ( 6 ) 一t a m r a - 5 一m l 】t h e a n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e so ff l u o r e s c e n c e l a b e l e dc t s ，n o r t f l u o r e s c e n c el a b e l l e dc t sa n df r e ef l u o r e s c e n t r e a g e n t w e r ee x a m i n e dt od e t e r m i n et h ee f f e c t so ff l u o r e s c e n t l a b e l l i n go na n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e s 3 ) b a c t e r i at e s t e dw e r et r e a t e dw i t hc t sf r o mr e ds w a m pc r a y f i s h ， 江苏大学硕士学位论文 l e a k a g eo fc e l l u l a rc o n t e n t sa n ds y n e r g e t i cb a c t e r i o l y s i so fs o d i u m d o d e c y ls u l f a t e ( s d s ) w e r ed e t e r m i n e d m o r p h o l o g i c a la l t e r a t i o n so f b a c t e r i a lc e l l sw e r ee x a m i n e db yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y f i e i ) w i t h f l u o r e s c e n c el a b e l e dc t sa sf l u o r e s c e n tm a r k e r , a g g r e g a t i o np o s i t i o no fc t si nb a c t e r i a lc e l l sw a sd e t e c t e db yl a s e r s c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p e ( l s c m ) t oi n v e s t i g a t et h ea n t i b a c t e r i a l t a r g e ts i t e so fc t sf r o mr e ds w a m pc r a y f i s h r e s u l t s ： 1 ) t h ec o n t e n t so fc t sf r o mr e ds w a m pc r a y f i s ha b s t r a c t e df r o m s h e l l so fr e ds w a m pc r a y f i s hw e r er a t h e rh i g h t h ea v e r a g e m o l e c u l a rw e i g h to fc t sf r o mr e ds w a m pc r a y f i s hw a sr e l a t e d w i t ht i m ef o rs o a k e di na c i d ，a n dd e g r e eo fd e a c e t y l a t i o nw a sr e l a t e d w i t ht i m ef o rr e c i r c u l a t i o ni ns o d i u me t h o x i d e 2 ) t h ea s s a yf o ra n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e ss h o w e dt h a tc o m p a r e dw i t h n o n f l u o r e s c e n c el a b e l e dc t s ，a n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e so ff l u o r e s c e n c e l a b e l e dc t sd e g r a d e d v c h e nm i x e dw i t hf l u o r e s c e n t r e a g e n t a c c o r d i n gt o9 ：1 ( v v ) ，c t ss t i l lh a d5 0 a n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e s 3 ) i t w a sc o n f i r m e dt h a tc t sf r o mr e ds w a m pc r a y f i s hc o u l dm a k e c e l l u l a rc o n t e n t sl o s t ，a n de x e r ts y n e r g i s t i cb a c t e r i o l y s i se f f e c t sw i t h s d s i ne l e c t r o nm i c r o g r a p h so fc e l l st r e a t e dw i t hc t sf r o mr e d s w a m pc r a y f i s h ，t h es h a p eo f c e l l sb e c a m ei r r e g u l a ra n dc e l l u l a r i v 江苏大学硕士学位论文 k y t o p l a s m b e c a m es p a r s e l s c md e m e n s t r a t e dt h a tc t sf r o mr e d s w a m pc r a y f i s hc o u l dn o tn o l ys t i c kt ot h eb a c t e r i a ls u r f a c eb u ta l s o e n t e rb a c t e r i a lc e l l s c o n c l u s i o n ： i nt h i sp a p e r c t sf r o mr e ds w a m pc r a y f i s h ，w i t hp a r t i c u l a r d e a c e t y l a t e dd e g r e ea n dm o l e c u l a rw e i g h t ，w a sa b s t r a c t e db ya u t h o r c o m p a r e d w i t hn o n f l u o r e s c e n c el a b e l e d c t s ，w h e nm i x e d w i t h f l u o r e s c e n tr e a g e n ta c c o r d i n gt o9 ：1 ( v v ) ，c t sh a d5 0 a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t i e sa n dp o s s e s s e df l u o r e s c e n c ev i s m l e ，t h u sc o u l db eak i n do f f l u o r e s c e n tm a r k e rt o i n v e s t i g a t et h e a n t i b a c t e r i a l t a r g e ts i t e s t h e a n t i b a c t e r i a lm e c h a n i s mo fc t sf r o mr e ds w a m pc r a y f i s hi n c l u d e dt h e d a m a g eo fb a r r i e rf u n c t i o no fb a c t e r i a ls u r f a c ef o l l o w e db yl e a k a g eo f c e l l u l a rc o n t e n t sa n dm o r p h o l o g i c a la l t e r a t i o n s ，a n de n t e r i n gc e l l st o i n t e r f e r et h e i rm e t a b o l i s m k e yw o r d s ：c h i t o s a n ，r e ds w a m pc r a y f i s h ，a n t i b a c t e r i a lm e c h a n i s m ， f l u o r e s c e n tl a b e l l i n g ，l a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p e v 江苏大学硕士学位论文 英文缩写索引 v 学位论文版权授予书 本学位论文作者同意学校保留该学位论文并向国家有关部门或 机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权 江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 保密口，在年解密后适用本授权书。 不保密曲。 学位论文作者签名：毕五溯 签字日期： 。f 6 夕 导师签名：冤仍附寥 签字日期：j 曲务 独创一| ! 生声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下独立 完成的，除文中注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体的研究成果。对本论文做出重要贡献的个人和集体，均在文中作了 声明并表示谢意。 作者签名：肆地日氏 日期： 。尸 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 克氏螯虾壳聚糖的简介 克氏螯虾壳聚糖是以克氏螯虾( r e ds w a m pc r a y f i s h ) 的外壳为原料，从中 提取其甲壳素( c 蛐：蛐，经部分或全部脱乙酰基后制备的壳聚糖( c h i t o s a n ) ，其结构 如图1 1 所示1 1 ，2 1 。壳聚糖的化学结构与纤维素相似，等电点为6 3 ，单体结构为 1 ，4 _ 2 氨基一2 脱氧1 3 d 葡萄糖。 士 脱乙酰基 一h o c h i t i nc h i t o s a n 图1 1 甲壳素和壳聚糖的结构图 f i g u r e1 1 s t r u c t u r eo fc h i t i na n dc h i t o s a n 从图1 1 可以看出，壳聚糖分子上联有游离氨基( n h 2 ) 和游离羟基( o h ) ， 通过各种化学反应，可以形成许多壳聚糖的衍生物【1 1 ，发挥特定作用。 克氏螯虾壳聚糖来源于克氏螯虾外壳，其结构与市售的生化级壳聚糖非常相 似，红外光谱图如图1 2 所示【3 】。从中可见，克氏螯虾壳聚糖在3 3 8 0c m 。1 处为羟 基、氨基的伸缩振动峰；2 8 7 8 c m d 处为c h 伸缩振动峰；1 5 6 4 c m d 处为n h 变形振 动峰；1 0 7 3c m d 处为1 3 d 葡萄糖苷的特征峰；1 1 5 5 10 0 0 c m 4 处为c n 吸收带； 1 6 5 8 、1 3 1 8c l l l 4 处为残余乙酰基的吸收峰。与市售生化试剂级壳聚糖的红外光谱 图进行比较可知，这两张谱图的特征峰位置十分类似，不同的是生化试剂级壳聚 糖的氨基伸缩振动峰较为强烈；克氏螫虾壳聚糖的残余乙酰基吸收峰较为尖锐， 这是由于生化试剂级壳聚糖比自制克氏螯虾壳聚糖的脱乙酰度要高的缘故。 江苏大学硕士学位论文 a 一 寥 r 艺 = 互 - 曼 = 2 b 寥 ， 8 皇 曩 皇 e 蓦 芒 w a v e u u m b e r s ( c m 1 ) w a v e n u m b e r s ( c m 1 ) 图1 2 壳聚糖红外光谱图。( a ) 克氏螫虾壳聚糖) 市售生化级壳聚糖。 f i g u r e1 2 i n f r o r e ds p e c t r u mo fc h i t o s a n ( a ) c h i t o s a nf r o mr e ds w a m p c r a y f i s h ，( ” b i o c h e m i s t r i cp u r eg r a d ec h i t o s a no ns a l e 克氏螯虾为地产盱眙龙虾，学名克氏原螯虾。原产于美国，2 0 世纪2 0 3 0 年代传至我国的南京一带，由南京自然传播，在盱眙境内生长、繁育、壮大，成 为盱眙一道亮丽的风景线，深受广大食客的青睐，目前年产量可达5 0 0 0t 。由于 人为传播和它自身生命力强，扩展能力大，逐渐扩展到北京、天津、河北、山西、 河南、安徽、湖北、湖南、江西、上海、浙江、广东等省、市。在我国无论南方 还是北方，都适宜克氏螯虾的生存和发展。特别是在长江中下游地区，这里湖泊、 池塘、湿地星罗棋布，江河、沟渠纵横交错，克氏螯虾传播、繁殖快速，很快发 展到几乎遍布长江( 中下游) 南北的每个角落，在有的湖泊和地区已成为优势种 群，是我国重要的水产资源。 2 江苏大学硕士学位论文 作为自然界大量存在的天然氨基碱性多糖，壳聚糖主要存在于蟹、虾和甲虫 等甲壳类的外骨骼及真菌类的细胞型4 】。目前，我国生产甲壳素及壳聚糖产品的 原料主要是海洋蟹、虾的外壳，对内地产的克氏螫虾外壳的应用还比较少，实际 上克氏螯虾外壳中含有丰富的甲壳素和壳聚糖，是一种不可多得的天然生物资 源，具有很高的应用价值。因此，克氏螯虾外壳作为制备甲壳素和壳聚糖的原料， 资源十分丰富，价格也低廉，为甲壳素和壳聚糖的制备提供了新的原料来源。 壳聚糖的的2 个重要物性参数分别是平均分子量( a v e r a g em o l e c u l a rw e i g h t ) 和 脱乙酰度( d e g r e eo f d e a c e t y l a t i o n ) ，它们分别反映了分子的聚合程度及脱乙酰基程 度，对壳聚糖的性能都有重要影响。壳聚糖无毒无害嘲，具有抗副6 】、抑制肿瘤 同、免疫调节【8 】等作用，其抗菌作用己成为当i j 研究的热点。 1 2 克氏螯虾壳聚糖的抗菌活性 克氏螯虾壳聚糖和临床常用抗菌药物相比，具有生物相容性强、无毒无害的 优点。克氏螯虾壳聚糖不仅具有显著降低高血脂大鼠的血清总胆固醇、甘油三酯、 低密度脂蛋白胆固醇的作用和提高血清高密度脂蛋白胆固醇的作用【9 】：用作体外 血清胆固醇吸附剂具有优良血液相容性和吸附性，是一种吸附法治疗高脂血症的 天然吸附剂【1 0 l ；对糖尿病小鼠具有降血糖和增强糖耐量的功效【1 1 】。还具有广泛 的抗菌谱，对5 种供试菌：金黄色葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u aa u r e u s ) 、枯草芽孢杆 菌( b a c i l l u ss u b a l i s ) 、大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac d 幻、绿脓杆菌( b a c t e r i u ma e r u g i n o s a ) 、 白色念珠菌( c a n d i d aa l b i c a n s ) 的生长均有明显的抑制作用，天然抗菌活性强，且 具良好的热稳定性，为其广泛应用带来了一定的方便【1 2 1 3 1 。现发现【14 】脱乙酰度 为9 5 的克氏螯虾壳聚糖对红色毛癣菌、断发毛癣菌、须发毛癣菌、石膏样小孢 子菌和白色念珠菌等皮肤浅表真菌均具有抗菌作用；同时，克氏螯虾壳聚糖在酸 性条件下对幽门螺杆菌( h e l i c o b a c t e r p y l o r i ，酬有较强的抗菌作用【1 3 】。因此，克 氏螯虾壳聚糖的临床抗菌应用i j 景广阔。 本研究将对克氏螯虾壳聚糖的抗菌机制进行初步研究，为以后的相关研究和 临床应用打下良好基础。 3 江苏大学硕士学位论文 第二章研究目的、内容、实验设计方案和意义 2 1 研究目的 掌握克氏螯虾壳聚糖的提取和鉴定的方法，检测克氏螯虾壳聚糖的抗菌活 性，通过各种方法初步探讨克氏螯虾壳聚糖的抗菌机制。 2 2 研究内容 1 克氏螯虾壳聚糖的提取制备及特性鉴定 2 克氏螯虾壳聚糖的抗菌活性检测 3 克氏螯虾壳聚糖抗菌机制的初步探讨 2 3 实验设计方案 - 一 4 江苏大学硕士学位论文 2 4 研究意义 本课题旨在研究克氏螯虾壳聚糖的抗菌机制，为克氏螯虾壳聚糖作为临床抗 菌剂更好的发挥作用提供了相应的实验依据。 5 江苏大学硕士学位论文 第三章克氏螯虾壳聚糖的提取和鉴定 制备壳聚糖( c h i t o s a n ) 的主要步骤是将原料脱蛋白、脱钙，得甲壳素，然 后脱乙酰基，得壳聚糖。提取方法较多，比较常用的有传统水浴酸碱法【3 】、微波 法【1 5 1 、电解法等1 1 6 1 。本试验采用传统水浴酸碱法，从克氏螯虾的外壳中提取克 氏螯虾壳聚糖，此法的优点是对容器要求不高，操作简单。 3 1 材料 3 1 1 主要原料 地产克氏螯虾外壳 3 1 2 主要试剂 h c l 、n a o h 、乙酸、乙酸钠、氯化钠、9 5 乙醇等，均为国产分析纯试剂 溴甲酚绿( b c g ) ：国产分析纯试剂( 分子量：7 2 0 ) n 一乙酰基- d 一葡萄糖胺：分析纯试剂( s i g m a 公司) 3 1 3 主要仪器 电子自动天平：b s 2 2 4 5 ( s a r t o r i u s ) 紫外分光监测仪：u v 2 5 5 0 ( s h i m a d z u ) 电热恒温干燥箱：e c o c e l l ( m m m ) 超纯水分离系统：p l 5 2 4 3 ( p a l l ) 分光光度计：7 2 2 ( 上海第三分析仪器厂) 回流冷凝管：直型( 泰兴市龙港玻璃仪器厂) 恒温水浴箱：h h s ( 金坛市医疗仪器厂) 乌氏黏度计：s b q 8 1 8 3 4 ( 中国医药集团上海化学试剂公司) 6 江苏大学硕士学位论文 3 2 方法 3 2 1 克氏螯虾甲壳素的提取 取地产克氏螯虾外壳，拣无虫蛀霉烂变质的，清洗后在7 0 干燥8h ，研磨 粉碎成细小片状( 1 锄2 左右) ，称取4 0 9 ，在沸水中抽提3 0 r a i n ，其后用1 l 锥形瓶 做容器，将壳置于3 0 ( 0 1 、2 5 m o l l n a o h 溶液中煮沸1 h ，冷却后水洗至中性， 再将碱液处理后的软壳置于4 0 0 m l 、1 0 m o l l 的h c l 室温中浸泡1 6 h ，水洗至中 性，然后再在相同条件下重复泡酸、泡碱两次，最后用蒸馏水洗至中性，烘干后 称重，得到具有天然结构甲壳素6 8 9 3 1 。 3 2 2 克氏螯虾壳聚糖的制备 将上述甲壳素放入2 0 0 m l 、1 0 m o 札n a o h 溶液中，升温至9 8 。c 反应2 h ，接着 放a 1 5 0 n l l 含2 0 9 n a o h l 拘9 5 醇溶液( 乙醇钠) 中，依靠冷凝回流装置，在8 8 回流温度下反应6 h ，冷却后用蒸馏水洗至中性，烘干，粉碎，用0 3 m o l l 乙酸 溶解，滤除不溶物，滤液中加入1m o l l n a o h ，析出沉淀，过滤，用蒸馏水洗至 中性，烘干，得5 8g 克氏螯虾壳聚糖【3 】。 3 2 3 脱乙酰度的测定 壳聚糖是甲壳素的脱乙酰基产物，壳聚糖的脱乙酰度是相对甲壳素而言的。 一般而言，乙酰基脱去5 5 的甲壳素就可称为壳聚糖，这种脱乙酰度的壳聚糖可 以溶于0 1 m o l l 乙酸或1 0 m o l lh c i ，但作为有实用价值的壳聚糖，脱乙酰度必 须在7 0 以上。 本试验用多波长线性回归紫外分光光度法测定克氏螯虾壳聚糖的脱乙酰度 【1 7 堋。以0 0 0 1m o f lh c i 为溶剂，配制浓度为0 5 9 l 的n 乙酰基d 葡萄糖胺标 准溶液。分别吸取0 5 、1 0 、2 0 、4 0 、6 0 、8 0 m l 标准溶液置于1 0 0 m l 容量瓶 中，用0 0 0 1m o l lh c i 稀释至刻度。以0 0 0 1 m o l lh c l 为参比在紫外分光光度计 上测定不同浓度的n 乙酰基d 葡萄糖胺标准溶液在波长2 0 0 、2 0 1 、2 0 2 、2 0 3 r i m 处的吸光度值并对波长作图得到线性关系良好的一组直线，其斜率与对应溶液浓 度呈正比，利用斜率与对应溶液浓度绘制出标准曲线图3 1 ，标准曲线回归方程 7 江苏大学硕士学位论文 为胎- 2 2 1 8 c 一0 0 0 3 。 称取自制克氏螯虾壳聚糖适量用0 1 m o l lh c l 溶解，定容于2 5 m l 容量瓶中， 然后移取l m l 溶液至1 0 0 m l 容量瓶中用蒸馏水稀释定容，得到克氏螯虾壳聚糖的 0 0 0 1m o l lh c l 溶液。以0 0 0 1m o l lh c i 为参比，在上述同样选定波长下，测 定样品溶液吸光度值并对波长做图求得斜率，通过回归方程鼯2 2 1 8 c 0 。0 0 3 ， 得到n 乙酰基d 葡萄糖胺残基的浓度，按下式求得样品的脱乙酰度( d d ) ： d d - ( c o c ) ( c o - 4 2c 2 0 3 ) 1 0 0 。 其中c o 为壳聚糖样品的浓度( 扣除样品水份) ，c 为样品中n 乙酰基d 葡萄糖 胺残基的测定浓度，2 0 3 是n 乙酰基一d 葡萄糖胺残基的分子量，1 6 1 是葡萄糖 胺残基的分子量，4 2 是二者之差。 图3 1n 乙酰基d 葡萄糖胺浓度与斜率x 的标准曲线 n g u 心3 1 s t a n d a r do l l r v eb e t w e e nc o n c e n t r a t i o n so fn - a e e t y l - d g l u e s m i n e a n ds l o p er a t e k 3 2 4 平均分子量的测定 壳聚糖与其它高分子化合物一样，实际是由不同分子量组成的同系混合物， 因此，一般用平均分子量来表示壳聚糖分子量的大小。 测定时，准确称取干燥克氏螫虾壳聚糖0 0 2 “ - 0 0 3 9 ，用2 0 m l 、0 1m o l l 乙 酸及0 2 m o l l 氯化钠混合液溶液使其完全溶解，得浓度为c l 的样品溶液，其后 8 江苏大学硕士学位论文 再依次稀释成3 种不同浓度的样品溶液( c 2 = 2 3 c 1 ，c 3 = 1 2 c l ，c 4 = 1 3 c 1 ) 。分别用3 号砂芯漏斗过滤于一小烧杯中，取1 0 m l 滤液加入乌氏粘度计中， 在2 5 恒温状态下用秒表读数，分别测定溶剂以及不同浓度克氏螯虾壳聚糖溶液 在乌氏粘度计中的下落时间。 相对粘度t 1 r 和增比黏度啊的计算如下：r k = t t o , 脚= 1 1 ，一1 。式中，t 为克 氏螯虾壳聚糖样品溶液下落时r , - l ( s ) ，t 0 为溶剂下落时间( s ) 。 将忡c 对c ( 壳聚糖式样溶液浓度，g n 1 1 ) 按图3 2 作图，所得直线截距即 为壳聚糖的特性粘度【砌，再依据m a r k h o 喇1 1 1 【方程：【川= 1 8 1 l f f 3 m 0 9 3 计 算平均分子量【1 9 1 。 0 c 4c 3c 2 c l c ( g m 1 ) 图3 2 测定特性黏度咖的坐标图 f i g u r e3 2 t h ec r d i i i 咖r a s e dt od e t e r m i n ec h a r a c t e r i s t i cv i s c o s i t y 【砌 3 2 5 壳聚糖含量测定 利用b c g 与壳聚糖复合物在6 2 0 r i m 呈特异性显色反应的特点，壳聚糖的含量 测定按以下步骤进行【2 0 】。 精确称取待测壳聚糖若干，用0 1 m o l l 乙酸溶解，制成5 9 l 的待测壳聚糖溶 液。取b c g1 8 9 溶于l m o l l n a o h 溶液5m l 中，用蒸馏水定容至2 5 0m l ，即为 1 0 m m o l lb c g 储存液。在1 0 0m l 的容量瓶内 j l p h 值为4 4 的0 1 m o l l 乙酸乙酸钠 缓冲液1 0i n l 和b c g 储存液2 0m l ，并用蒸馏水定容，即为0 0 2m m o l lb c g 应用 液。 取2 支试管，分别加入0 1 m o l l 乙酸，5g r l 待测壳聚糖溶液，再各力【i a b c g 9 江苏大学硕士学位论文 应用溶液2 0r n l 。2 管分别为空白管、和测定管。各管于3 7 水浴5m i n ，用7 2 2 型分光光度计在6 2 0n m 处以空白管调零，测定测定管的吸收度。按下列方程算 出待测壳聚糖实际浓度：a = 0 0 7 3 1 c + 0 0 7 7 1 ，其中a 为吸光度，c 为待测壳聚 糖实际浓度。以此算出壳聚糖含量。 3 2 6 泡酸时间对克氏螯虾壳聚糖平均分子量的影响 取3 份5 9 克氏螯虾外壳，将泡酸时间分别设为4 h 、1 6 h 、4 8 h ，其余试验条 件按3 2 1 及3 2 2 描述的进行，测定制得的3 种不同壳聚糖的平均分子量。 3 2 7 醇钠回流时间对克氏螯虾壳聚糖脱乙酰度的影响 取2 份5 9 克氏螯虾外壳，将在乙醇钠中回流的时间分别设为6 h 、1 2 h ，其 余试验条件按3 2 1 及3 2 2 描述的进行，并测定制得的2 种壳聚糖的脱乙酰度。 3 3 结果 3 3 1 克氏螯虾壳聚糖的特性指标 按3 2 1 及3 2 2 提取壳聚糖，以3 2 3 、3 2 4 、3 2 5 检测各项指标， 所得结果见表3 1 。由表3 1 可知，所制得的甲壳素和壳聚糖的产率分别为1 7 和1 4 5 ，壳聚糖含量为9 0 ，其特性指标与其它文献记载也基本一致【2 1 】。说明 地产克氏螯虾外壳中含壳聚糖较高，用本法提取的壳聚糖符合市售标准。 表3 1 克氏螯虾壳聚糖的特性指标 t a b l e3 1t h ec h a r a c t e r i s t i ci n d e xo f c h i t o s a nf r o mr e ds w a m pc r a y f i s h 3 3 2 泡酸时间对平均分子量的影响 泡酸时间对壳聚糖平均分子量的影响见表3 2 。可以看出，延长泡酸时间可 1 0 江苏大学硕士学位论文 以降低壳聚糖的平均分子量，当泡酸时间从4 h 增加到1 6 h 时，平均分子量降低 了约1 5 ，而从1 6 h 增加到4 8 h 时，平均分子量只降低了1 0 。说明泡酸时间 增加到一定程度后，对壳聚糖分子量的影响会逐渐减少。 表3 2 泡酸时间对克氏螯虾壳聚糖平均分子量的影响 t a b l e3 2t h er e l a t i o nb e t w e e nt h ea v e r a g em o l e c u l a rw e i g h to f c h i t o s a nf r o mr e d s w a m pc r a y f i s ha n dt i m ef o rs o a k e di na c i d 3 2 3乙醇钠回流时间对克氏螯虾壳聚糖脱乙酰度的影响 在乙醇钠中回流时间对克氏螯虾壳聚糖脱乙酰度的影响见表3 3 。可以看出， 延长回流时间可以增加克氏螯虾壳聚糖的脱乙酰度，当回流时间从6 h 增加到1 2 1 1 时，脱乙酰度从9 0 增加到了9 5 。 表3 3 乙醇钠回流时问对克氏螯虾壳聚糖脱乙酰度的影响 t a b l e3 3t h er e l a t i o nb e t w e e nd e g r e eo fd e a c e t y l a t i o no f c h i t o s a nf r o mr e ds w m p c r a y f i s ha n dt i m ef o rr e c i r c u l a t i o ni ns o d i u me t h o x i d e 3 4 讨论 壳聚糖分子的立体规整性及分子间的氢键使它在多数有机溶剂、水、碱中难 以溶解，但由于有氨基，在稀酸中当一活度足够等于一n h 3 的浓度时，使一n h 3 质子化成一n h 3 + ，破坏了分子间的氢键和立体规整性，使一0 h 与水分子发生水 合作用，导致壳聚糖分子膨胀而溶解【2 2 1 。壳聚糖的溶解性能和自身的脱乙酰度 及平均分子量有较大关系。脱乙酰基程度高的含有的氨基较多，溶解度就大；分 江苏大学硕士学位论文 子量小的，因为结构简单，溶解度相对就大。本试验提取的克氏螫虾壳聚糖脱乙 酰程度高，在稀乙酸中的溶解情况较为理想，适合进行相关试验。 提取开始用沸水抽提是为了除去附着在虾壳表面的杂质；用稀碱高温反应可 以大量降解壳中的蛋白质，对色素也有提取作用；浸泡在稀酸中的目的是要降解 壳中c a c 0 3 等盐类物质，泡酸过程中出现的大量气泡，就是c a c 0 3 和h c i 反应生 成c 0 2 引起的。提取过程中泡酸泡碱操作前后进行了3 次，可以提高甲壳素的产 量。 甲壳素变成壳聚糖关键是要大量脱乙酰基，本试验采用了两步法来达到这一 目的。首先将甲壳素放入浓碱，高温反应，使壳表面的甲壳素分子大量脱乙酰基。 第二步，放入含碱的有机溶剂乙醇进行反应，可以使壳内部的甲壳素分子脱乙酰 基，因为有机溶剂比水具有更强的渗透性，对色素也有一定的萃取作用，制得的 壳聚糖脱乙酰度较高，色泽也好。在用乙醇萃取时，回流温度的掌控很关键，本 试验选定的回流温度是8 8 ，刚好能使溶液沸腾、反应充分，同时又让蒸汽迅速 冷凝，避免对环境造成影响。 本试验表明，在提取过程中控制泡酸及醇钠回流时问，可以有效控制克氏螯 虾壳聚糖的平均分子量及脱乙酰度，但当作用时间到达一定程度后，壳聚糖的性 质不会有太大改变。在提取过程中因为没有加入壳聚糖降解酶，制得的产物分子 量高达到几十万以上，要想得到分子量低达几万甚至几千的壳低聚糖，需借助壳 聚糖降解酶的降解f 捌。 本试验采用的传统水浴酸碱法是提取甲壳素及壳聚糖的常用方法，优点是操 作简单，对设备的要求不高，制得的壳聚糖各项指标都符合标准；缺点是因加热 方式的局限性，所需时间较长，因为水浴加热是由外部热源由表及里的加热，效 率较低。如果要提高提取效率，需采用微波法，因为微波加热方式是使反应分子 在微波场中随电场方向改变发生旋转、振动，分子的运动加剧，增加反应分子间 的碰撞次数，使反应在极短的时间内就可完成反应。有研究证明，微波法不仅能 大大减少提取壳聚糖【2 q 的时间，在制备壳聚糖衍生物方面也很有效1 2 5 , 2 6 1 ，但是 微波法对容器要求较高，在使用过程中需注意。 本试验采用传统水浴酸碱法成功的从克氏螯虾虾壳中提取了克氏螯虾壳聚 糖，经检验各项指标都符合标准，适合用于以后的研究。 江苏大学硕士学位论文 第四章克氏螯虾壳聚糖及其荧光标记物的抗菌活性比较 克氏螯虾壳聚糖( c h i t o s a n ) 对许多细菌具有抗菌活性，但其荧光标记物的 抗菌活性，目前尚无报道。如果通过抗菌试验证实，标记上荧光的克氏螯虾壳聚 糖还能保留抗菌活性，它就可以作为荧光标记物用于抗菌机理的研究。本试验的 目的就是要比较未标记荧光的壳聚糖和标记上荧光的壳聚糖之间的抗菌活性，观 察荧光标记过程对克氏螯虾壳聚糖抗菌性能的影响，为下一步的抗菌机理研究奠 定基础。 4 1 材料 4 1 1 主要原料 克氏螯虾壳聚糖，平均分子量5 5 1 0 5 、脱乙酰度9 0 ，由作者按3 2 1 和 3 2 2 的方法从克氏螯虾外壳中提取。 4 1 2 主要试剂 h c i ，n a o h ，乙酸、氯化钠，琼脂等，均为国产分析纯试剂 蛋白栋、酵母提取物，购自英国o x o i d 公司 5 ( 6 ) - 羧- 四甲基罗丹明一5 一马来酰亚胺【5 ( 6 ) - t a m r a - 5 - m l ：由天津医科大学 临床生化教研室提供 4 1 3 菌种 大肠埃希菌( 晟矗) a t c c 2 5 9 2 2 及金黄色葡萄球菌( sa u r e u s ) a t c c 2 5 9 2 3 ， 7 0 冰箱保存，由江苏大学附属人民医院提供。 江苏大学硕士学位论文 4 1 4 主要溶液的配制 克氏螯虾壳聚糖溶液：精确称量干燥的克氏螯虾壳聚糖，以0 1 m o l l 乙酸 为溶剂，制成1 0 9 l 的溶液，后依次稀释成浓度为5 0 9 l 、2 5 9 l 、1 2 5 9 l 、0 6 2 5 9 l 的壳聚糖溶液，用l m o l l n a o h 将壳聚糖溶液及o 1 m o l l 乙酸p h 调到5 4 ，1 1 5 高压1 0 r a i n ，4 “ c 保存，备用。 l b 培养液：5 9 蛋白栋、2 5 9 酵母提取物、5 9 氯化钠，加蒸馏水至5 0 0 m l ， 高压灭菌后4 保存。 l b 琼脂培养基：5 9 蛋白栋、2 5 9 酵母提取物、5 9 氯化钠、7 5 9 琼脂，加蒸 馏水至5 0 0 m l ，高压灭菌后浇入9 0 m m 直径平板( 3 5 m l 板) ，4 “ c 保存。 4 1 5 主要仪器 超低温冰箱：u l t - 7 9 0 3 v ( t h e r m o ) 空气浴摇床：t h 1 5 ( j o h a n a no t t o ) 电子自动天平：b s 2 2 4 5 ( s a a o d u s ) 超纯水分离系统：p l 5 2 4 3 ( p a l l ) 高压消毒锅： 1 h 一3 5 6 0 ( t a s o ) 核酸紫外检测仪：b i o p h o t o m e t e r ( e p p e n d o f f ) 隔水式电热培养箱：p y x - d h s x ( 上海跃进医疗器械厂) 超净工作台：s w - c j ( 苏州尚田洁净技术有限公司) 4 2 方法 4 2 1 荧光标记克氏螯虾壳聚糖的合成及配制 为观察克氏螯虾壳聚糖与荧光试剂混合时，两种物质不同体积比对壳聚糖抗 菌性能的影响，取1 0 0g l 克氏螯虾壳聚糖溶液与荧光试剂5 ( 6 ) 矗a m 黜5 m l 分别按体积比1 ：1 、3 ：1 、5 ：1 、7 ：1 、9 ：1 的比例混合，4 “ c 过夜。然后向标记 好的壳聚糖溶液分别加1 m o l i n a o h ，析出沉淀，倒去上清，留沉淀，并用乙酸 乙酸钠冲洗，接着向上清液中缓慢加入n a o h 析出沉淀，如此反复至无沉淀出现 为止。将洗净的沉淀烘干，得5 种荧光标记克氏螯虾壳聚糖。 1 4 江苏大学硕士学位论文 精确取取上述5 种荧光标记克氏螯虾壳聚糖，依次溶于0 1 m o l l z 酸，得浓 度为1 0 0 l 溶液，再用二倍稀释法制成5 0g l 、2 5 9 l 、1 2 5 9 l l 拘溶液，并用 l m o l l n a o h 把所有荧光标记壳聚糖溶液及0 1 m o l l 乙酸的p h 调节到5 8 ，过滤除 菌。 4 2 2 接种菌液的准备 从一7 0 冰箱中取出ec o l i 和sa u r e u s ，接种于l b 琼脂平板上，3 7 。c 培 养至细菌生长良好。挑取平板上的菌落接种于3 m ll b 培养液中，于3 7 “ c 摇床上 2 2 0 r m i n 培养4 h 至o d t m = 0 4 ，此时ec o l i 浓度约为1 0 8 c f u m l ，& a u r e u s 的 浓度约为1 0 7 1 0 s c f u m ，然后用生理盐水将菌液浓度