蛋白质生物组成和定义PPT.ppt

第十五章 蛋白质的合成 蛋白质合成概述 DNA: ATGCATGCATGC RNA: AUGCAUGCAUGC PROTEIN: aa1 aa2 aa3 aa4 什么样的碱基序列决定什么 样的氨基酸 序列呢？ 如何实现碱基序列到氨基 酸序列的转变？ 第一节 mRNA mRNA的概念首先是由F.Jacob和J.Monod1965年提出来 的因为当时已经知道编码蛋白质的遗传信息载体 是在细胞核中，而蛋白质的合成是在细胞质 中，于是就推测，应该有一种中间信使在细胞核中 合成后携带上遗传信息进入细胞质中指导蛋白质的 合成，后来经过众多科学家的实验，发现了除rRNA 和tRNA之外的第三种RNA,它起着这种遗传信息传送 的功能, 称为信使RNA(mRNA)。mRNA的半衰期很 短,很不稳定,一旦完成其使命后很快就被水解掉。 原核生物和真核生物mRNA的结构差异教大，尤其是在 5端。 一、 原核生物mRNA的结构 （1） 5端SD序列 P404P405 在起始密码子AUG上游913个核苷酸处，有一段可与核糖体16S rRNA配对结合的、富含嘌呤的39个核苷酸的共同序列，一 般为AGGA，此序列称SD序列。它与核糖体小亚基内16S rRNA的3端一段富含嘧啶的序列 GAUCACCUCCUUAOH（ 暂称反SD序列）互补，形成氢键。使得结合于30S亚基上的 起始tRNA能正确地定位于mRNA的起始密码子AUG。 （2） 原核mRNA分子，许多是多顺反子 。 转译时，各个基因都有自己的SD序列、起 始密码子、终止密码子，分别控制其合 成的起始与终止，也就是说，每个基因 的翻译都是相对独立的。如E.coli，一个 7000b的mRNA编码5种与Trp合成有关的 酶 二、 真核生物mRNA的结构 （1） 真核生物mRNA5端均具有m7GpppN帽 子结构，无SD序列。 帽子结构具有增强翻译效率的作用。若起始 AUG与帽子结构间的距离太近（小于12个核 苷酸），就不能有效利用这个AUG，会从下 游适当的AUG起始翻译。当距离在1780个核 苷酸之间时，离体翻译效率与距离成正比。 （2） 真核生物mRNA通常是单顺反子。 真核mRNA具有“第一AUG规律”，即当5端具有 数个AUG时，其中只有一个AUG为主要开放 阅读框架的翻译起点。起始AUG具有二个特 点： （1）AUG上游的 3经常是嘌呤，尤其是A。 （2）紧跟AUG的 +4常常是G。 起始AUG邻近序列中，以ANNAUGGN的频率 最高。若3不是A，则+4必须是G。无此规律 的AUG，则无起始功能。 有关mRNA发现及其证实的细节看书P391. 第二节 遗传密码 我们已经知道,多肽上氨基酸的排列次序最终是由DNA 上核苷酸的排列次序决定的，而直接决定多肽上氨 基酸次序的是mRNA上的核苷酸的排列次序,不论是 DNA还是mRNA都是由4种核苷酸构成，而组成多肽 的氨基酸有20种,显然,必须是几个核苷酸的组合编码 一个氨基酸才能应付局面.用数学方法很容易算出,如 果每2个核苷酸编码1个氨基酸,那么4种核苷酸只有16 中编码方式，显然不行,如果每3个核苷酸编码1个氨 基酸,则有64种编码方式,很理想,如果4对1则有256种, 太没必要也太复杂了,时刻记住生物体是一个最理想 的体系.而且科学家们用生物化学实验已经证实是3个 碱基编码1个氨基酸,称为三联体密码或密码子。那么 让我们看一下遗传密码是如何破译的。 一、 遗传密码的破译 在遗传密码的破译中,美国科学家M.W.Nirenberg等人做 出了重要贡献 ,并于1968年获得了诺贝尔生理医学奖. 早在1961年，M.W.Nirenberg等人在大肠杆菌的无细胞 体系中外加poly(U)模板、20种标记的氨基酸，经保 温后得到了多聚phephephe，于是推测UUU编码phe 。利用同样的方法得到CCC编码pro，GGG编码gly， AAA编码lys。 如果利用poly（UC），则得到多聚SerLeuSerLeu， 推测UCU编码Ser，CUC编码Leu，因为poly（UC） 有两种读码方式：UCUCUC和CUCUCU 采用这种方式，到1965年就全部破译了64组密码子， 见表P394。 二、 遗传密码的特点 在64个密码子中有61个编码氨基酸，3个不编码 任何氨基酸而起肽链合成的终止作用，称为终 止密码子，它们是UAG、UAA、UGA，密码 子AUG（编码Met）又称起始密码子。 密码子：mRNA上由三个相邻的核苷酸组成一个 密码子，代表肽链合成中的某种氨基酸或合成 的起始与终止信号。 （1）方向性：从mRNA的5到3 （2）连读性 编码一个肽链的所有密码子是一个接着一个地线形排 列，密码子之间既不重叠也不间隔，从起始密码子 到终止密码子构成一个完整的读码框架（不包括终 止子），又称开放阅读框架（ORF）。那么如果在阅 读框中插入或删除一个碱基就会使其后的读码发生 移位性错误（称为移码）。 需要指出的是，两个基因之间或两个ORF之间可能会 互相部分重叠（共用部分序列）。 （3）简并性 几种密码子编码一种氨基酸的现象称为密码子的简并 性。如GGN（GGA、GGU、GGG、GGC）都编码 Gly，那么这4种密码子就称为Gly的简并密码。只有 Met和Trp没有简并密码。一般情况下密码子的简并 性只涉及第三位碱基。 问题：简并性的生物学意义？ A、可以降低由于遗传密码突变造成的灾难性后 果 试想，如果每种氨基酸只有一个密码子，那么 剩下的44个密码子都了终止子，如果一旦哪个 氨基酸的密码子发生了单碱基的点突变，那么 极有可能造成肽链合成的过早终止。如GUU 编码Ala，由于简并性的存在，不论第三位的 U变成什么，都仍然编码Ala B、可以使DNA上的碱基组成有较达的变化 余地，而仍然保持多肽上氨基酸序列不变（意 思基本同上）。 （4）摇摆性 密码子中第三位碱基与反密码子第一位碱基 的配对有时不一定完全遵循AU、GC的原则 ，也就是说密码子的碱基配对只有第一、二位 是严谨的，第三位严谨度低，Crick把这种情 况称为摇摆性，有人也称摆动配对或不稳定配 对。显然，密码子的第三位和反密码子的第一 位是摇摆位点。 具体说来，反密码子第一位的G可以与密码子第 三位的C、U配对，U可以与A、G配对，另外 反密码子中还经常出现罕见的I，可以和密码 子的U、C、A配对，这使得该类反密码子的 阅读能力更强。见表P396 问题：细胞内有几种tRNA？ 当遗传密码破译后，由于有61个密码子编码氨基酸， 于是人们预测细胞内有61种，但事实上绝大多数细 胞内只有50种左右，Crick也正是在这种情况下提出 了摇摆假说并合理解释了这种情况。 根据摇摆性和61个密码子，经过仔细计算，要翻译61 个密码子至少需要31种tRNA，外加1个起始tRNA， 共需32种。但是，在叶绿体和线粒体内，由于基因 组很小用到的密码子少，那么，叶绿体内就有30种 左右tRNAs，线粒体只有24种。 （5）通用性：密码子在不同物种间几乎是完全通用的 。 目前只发现线粒体和叶绿体内有列外情况，这也是如 火如荼的转基因的前提。但要注意的是不同生物往 往偏爱某一种密码子。 第三节 核糖体 核糖体又称核蛋白体，它是蛋白质合成的场所 ：标记各种a.a，注入大鼠体内，在不同时间 取出肝脏，匀浆，离心分离各种亚细胞器，分 析放射性蛋白的分布，证实蛋白质的合成是在 核糖体上进行的。对于真核细胞来说，核糖体 按其在细胞质中的位置分为游离核糖体（合成 细胞质蛋白）和内质网核糖体（合成分泌蛋白 和细胞器蛋白）。 不论原核细胞还是真核细胞，一条mRNA可以被 同时几个核糖体阅读，把同时结合并翻译同一 条mRNA的多个核糖体称为多核糖体。 一、 核糖体的结构与组成 核糖体是由核糖核酸（称为核糖体核酸, rRNA ）和几十种蛋白质分子（核糖体蛋白）组成的 一个巨大的复合体。不同类型生物中核糖体的 结构高度保守，尽管其rRNA和核糖体蛋白的 一级结构有所不同，但其三级结构却惊人的相 似。 核糖体的大亚基上有两个重要的位点：P位点是 结合肽酰tRNA的肽酰基的位点，A位点是结 合氨酰tRNA的氨酰基的位点。 每个核糖体是由大小两个亚基组成，每个亚基 都有自己不同的rRNA和蛋白质分子，表P307 二、 rRNA与核糖体蛋白的结构与功能 (一)、 rRNA的结构与功能 结构：有大量的茎环（发夹）结构，结构复杂，可能 是核糖体的钢筋骨架。 功能： （1）蛋白质合成的施工平台（骨架） （2）催化肽键形成的转移酶活性存在于23SrRNA上 有人小心的去掉细菌核糖体的蛋白质组分，保持rRNA 的相对完整性，发现蛋白质的合成仍可进行。 （3）参与tRNA与mRNA的结合 可能的情况是：mRNA先识别rRNA的特定序列并结合 固定下来,然后tRNA再识别并固定到rRNA特定的部 位，其反密码子才与mRNA密码子配对。已经知道 16SrRNA上有一段序列与原核mRNA上的SD序列相 结合。 （4）在大小亚基的聚合中起重要作用 （5）在翻译的校正和翻译的调控方面有重要功 能（如可结合调控因子） 总的来说，RNA分子似乎是整个核糖体的活跃 的活性中心。 (二)、 核糖体蛋白的结构与功能 结构：大多数核糖体蛋白呈纤维状（可能起骨 架作用），少数呈球状（可能起生物功能）。 功能： (1)维持核糖体的结构 (2)新发现：一些核糖体蛋白具有DNA结（Heilix turnHeilix模块）；还有些真核核糖体蛋 白具有DNA修复功能 问题： 既然蛋白质是在核糖体中合成的，那么第一个核糖体 中的蛋白组分又是怎样合成的？第一个核糖体又是 怎样出现的？ 先有DNA还是先有蛋白质？ 大多数科学家越来越支持RNA起源论，既然核糖体中 既有蛋白质又有RNA，那么彻底搞清楚核糖体的结 构与功能及其起源也许会弄清生命的起源和演化。 RNA起源论： 第一个生活细胞里出现的是RNA分子，他同时具有信 息储藏和生物演化的双重特性，也就是说既可以在 一定程度上复制自己，又可以催化一些最初的生化 反应，后来，随着活细胞的进化，DNA逐渐出现并 成为更为稳定的遗传信息储存分子。 第四节 蛋白质合成的机理 真核生物和原核生物在蛋白质合成方面有许多共同之 处，因此，我们先学习蛋白质合成的一般过程，然 后分别看一下原核和真核蛋白质合成的具体过程。 游离氨基酸在掺入肽链以前必须活化以获得额外的能 量，每一种游离氨基酸首须在专一的氨酰tRNA合成 酶的帮助下与专一的tRNA相连（有人称装载， LOAD），然后由tRNA负责将它带到核糖体上的特 定位点（A位点上）并添加到正在合成的肽链C末端 ，这种从游离氨基酸到形成氨酰tRNA的过程既是氨 基酸的活化过程，也是肽链每合成一步或延伸一步 的必经准备阶段。下边我们先看一下这个过程是怎 样完成的？ 一、 氨酰tRNA合成酶：氨基酸的活化和氨酰tRNA 的合成 基酸的活化和氨酰tRNA的合成是蛋白质生物合成的第 一步，由氨酰tRNA合成酶催化。氨酰tRNA合成酶既 能识别氨基酸，又能识别tRNA。 (一)、 活化 在Mg2+的存在下，氨酰tRNA合成酶首先识别并结合专 一的配体氨基酸，然后氨基酸的羧基与细胞环境中 的ATP发生反应形成一个酸酐型的高能复合物（氨酰 AMP中间复合物）。该中间复合物暂时结合在酶上 。 酶/ Mg2+氨基酸 + ATP 氨酰AMP酶 + PPI (二)、 连接 由于氨酰tRNA合成酶上还存在专一的tRNA识别位点， 因此特定的游离tRNA就会识别并结合到氨酰AMP酶 复合物的活性部位，此时氨基酸就会被转移到tRNA 的3端，其羧基与tRNA 3端的自由OH形成氨酰酯键 ，从而形成氨酰tRNA，这也是一个高能化合物，其 能量足以形成肽键。由于氨酰tRNA能量低于氨酰 AMP，所以这一过程是可以自发的。 tRNA 氨酰AMP酶 氨酰tRNA + AMP + 酶 氨基酸一旦与tRNA形成氨酰tRNA后进一步的去向就由 tRNA来决定了，tRNA凭借自身的反密码子与mRNA 上的密码子相识别，从而把所携带的氨基酸送到肽 链的 一定位置上。每一个密码子对应的肽链位置上 都能掺入正确的氨基酸。 结论： （1）氨基酸的活化和氨酰tRNA的合成是蛋白质生物合 成的第一步，每一种氨基酸在被掺入肽链之前都首 先被活化和连接在专一tRNA上，活化和连接都发生 在氨基酸的羧基上。 （2）载体tRNA凭借自身的反密码子与mRNA上的密码 子相识别而把所携带的氨基酸送到肽链的一定位置 上 （3）遗传信息是通过mRNA上的密码子与tRNA上的反 密码子间碱基配对作用翻译出来的 。 氨酰tRNA合成酶： 每一种氨基酸都有至少一种专一的氨酰tRNA合成酶， 它即能识别氨基酸，又能识别tRNA，从而把特定的 氨基酸连到对应的tRNA上，有人也把氨酰tRNA合成 酶的双向识别功能称为第二遗传密码。 不同的氨酰tRNA合成酶在分子量、氨基酸序列、亚基 组成上差异较大。它是如何识别氨基酸的呢？仍不 甚清楚。一些氨基酸由于结构上的显著特征容易识 别如大小不同（Trp与Gly），带正负电荷（lys,asp） ，而一些氨基酸结构极其相似，如Ile 与Val 仅差一 个甲基。尽管如此tRNAIle合成酶也能正确识别，但 有时也能错误的形成Val tRNAIle，但是每一种氨酰 tRNA合成酶都有一个校正位点，由于大小原因，只 有Val tRNAIle才能结合到校正位点，然后合成酶将 Val又从tRNAIle上将其水解下来。 氨酰tRNA合成酶还能正确的识别和结合tRNA，对于 一些酶来说，tRNA上的反密码子是其识别特征，此 外，tRNA上的受体茎环（acceptor stem）也是识别 特征。 tRNA分子的突变与校正基因 可以说tRNA是一个万能接头： （1）对氨酰 tRNA合成酶的识别位点（接头合成酶） （2）3端CCA上的氨基酸运载位点（接头氨基酸，装 载） （3）对核糖体的识别位点（将氨基酸运送到目的地） （4）反密码子位点（接头MRNA，验货并卸载） 同复突变：突变型生物有时重所获得其原有的 性状，这是通过突变型遗传物质的化学变化而 发生的。这种变化使遗传物质恢复到有功能的 状态，重所获得原有的表型，这种过程称为回 复，被回复的生物称为回复子。 回复突变的原因很多，其中有一种回复突变是 由其在基因上发生一个突变引起的，这称为基 因校正突变。大多数较正突变发生在tRNA基 因上。 举例：基因间校正突变 图 当有某种tRNA突变分子出现时，必定还有可以 识别正常密码子的该种tRNA存在。 二、 蛋白质合成的一般过程 蛋白质合成的一般过程如图18.3， 可以分为三个阶段：起始、延伸、终止，分别 由不同的起始因子、延伸因子和终止因子（释 放因子）参与。 (一)、 翻译起始 （1）小亚基与mRNA结合 （2）起始氨酰tRNA进入P位点，它的反密 码子与mRNA上的起始密码子AUG碱基 配对。 （3）大亚基与小亚基结合形成起始复合物 。 (二)、 延伸 方向：mRNA 5/ 3/ 新生肽： N/ C/ （1）就位：第二个氨酰tRNA通过密码子反密码子的 配对作用进入核糖体的A位点（氨基位点）。 （2）转肽：在大亚基上肽酰转移酶（peptidyl transferase）的作用下，A位点氨基酸的A氨基亲核 攻击P位点氨基酸的羧基基团并形成肽键，结果两个 氨基酸均连到了A位点的tRNA上，该过程称为转肽 作用（transpeptidation），此时，P位点上卸载的 tRNA从核糖体上离开。 （3）移位（translocation，也可称转位）：核糖体沿着 mRNA移动1个密码子位置，携带肽链的tRNA转位到 P位点，A位点空出以便接纳下一个氨基酸。 (三)、 终止 由于终止密码子不能结合任何氨酰tRNA，于是肽链合 成的终止因子（又称释放因子）识别并结合到终止 密码子上，接着肽转移酶的酯化酶功能转变成水解 功能，将肽链从P位点tRNA上水解掉，核糖体释放掉 mRNA并解体成大小亚基，翻译结束。 在翻译过程中除了核糖体大小亚基、 mRNA和氨酰 tRNA外，还需要GTP和许多蛋白辅助因子。这些辅 助因子有的起催化作用，有的起改变和稳定构象作 用。 (四)、 翻译后加工 不论原核生物还是真核生物，翻译完成后，一些肽链 能直接折叠成最终的活性形式，不需要加工修饰， 然而经常的情况是新生肽链需要加工修饰（称为翻 译后加工或修饰）包括：（1）切除部分肽段（蛋白 酶）、（2）在特定氨基酸残基的侧链上添加一些基 团（共价修饰）、（3）插入辅因子，还有些单肽要 聚合成多亚基蛋白。 翻译后加工有两方面目的： （1）功能需要 （2）定向转运的需要（这在真核生物中尤为复 杂，合成的蛋白要定向运输到细胞质、质膜、 各种细胞器如叶绿体、线粒体、溶酶体、过氧 化物酶体等）。 尽管原核生物与真核生物在蛋白质合成方面有 许多相似之处，但也存在差异，这些差异正是 一些抗生素治疗和研究应用的基础。见表18.2 表18.2 蛋白质合成的选择性抗生素抑制剂 抗生素 作用 氯霉素 与50S亚基结合，抑制原核肽转移酶 cycloheximide 抑制真核肽转移酶活性 Erythromycin 抑制原核肽链延伸 链霉素、卡那霉素 结合到原核30S亚基上引起读妈错误，导致合成的多肽 连一级结构改变 Tetracycline 与30S亚基结合，干扰氨酰tRNA的结合 三、 原核生物的蛋白质合成 原核生物（大肠杆菌）每秒钟可翻译20个氨基 酸，比真核生物快得多，而真核生物每分钟才 大约50个氨基酸。 (一)、 翻译起始 （图18.5） 翻译是从形成起始复合物开始的，在原核生物 中该过程需要三个起始因子参与：IF1，IF2， 和IF3。（IF1的功能尚不清楚）。 （1）IF3首先结合在30S亚基上，防止它过早地 与50S亚基结合。 （2）mRNA结合到30S亚基上。 原核mRNA上在距起始密码子上游约10bp处有一 段很短的（约10bp）富含嘌呤的区域称为SD 序列，它能与30S亚基上的16S rRNA 3端的一 段互补序列（不妨称反SD序列）配对结合， mRNA正是通过其SD序列与16S rRNA的配对 结合而使它处于核糖体上的恰当的位置，并使 起始密码子AUG处于P位点。SD序列与16S rRNA的配对还为识别起始密码子和Met密码子 提供了一种机制。 原核多顺反子mRNA上的每一个基因都有自己的 SD序列、起始密码子和终止密码子，每一个 基因的翻译都是相对独立的。 （3）IF2 、fMettRNAfmet结合到30S亚基上 IF2是一个GTP结合蛋白，它先与30S亚基结合并 促使起始氨酰tRNA的密码子与mRNA 上的 AUG结合（P位点）。原核生物的起始氨酰 tRNA是N甲酰甲硫氨酰tRNA（fMet tRNAfmet ）。 （4）50S大亚基结合到30S小亚基上，形成起始 复合物。 GTP水解成GDP释放的能量引起30S亚基构象变 化，50S亚基结合到30S亚基上，同时IF2和IF3 释放。 因此，原核生物肽链合成的起始复合体由mRNA 、70S核糖体、fMettRNAfMet组成。 （1）IF3首先结合在30S亚基上， 防止它过早地与50S亚基结合。 （2）mRNA结合到30S亚基上。 （3）IF2 、fMettRNAfmet结合到 30S亚基上 （4）50S大亚基结合到30S小亚基 上，形成起始复合物。 (二)、 延伸 肽链延伸分三步进行：（1）新的氨酰tRNA进入核糖体 的A位点；（2）肽键形成（转肽）；（3）核糖体移 位（转位）。这三步构成了肽链延伸的一个循环。 1、 新氨酰tRNA入位 图18.6 首先，在进入A位点之前，新氨酰tRNA必须与延伸因 子EFTUGTP结合。延伸因子EFTU是一个GTP 结合蛋白，参与氨酰RNA的就位。氨酰RNA就位后 ，EFTUGTP水解，EFTUGDP从核糖体上释 放下来，在第二个延伸因子EFTs帮助下EFTu GDP释放掉GDP并重新结合一分子GTP再生成EF TuGTP。 2、 肽键形成（转肽） 肽键是在肽酰转移酶催化下形成的，现在认为 肽酰转移酶活性存在于50S亚基23S rRNA上。 驱动肽键形成的能量由P位点上的氨基酸与它 的tRNA的高能肽酰酯键提供。新肽键形成后P 位点卸载的tRNA就离开核糖体。 嘌呤霉素抑制肽键形成 3、 核糖体移位。 移位需要另一个GTP结合蛋白EFG（延 伸因子，又叫移位酶）的参与。现在 认为，GTP水解成GDP时释放出的能量 促使核糖体构象发生变化，驱动肽酰 tRNA从位点移动到位点。空下的 位点等待接纳下一个氨酰tRNA 。 EFTu：机动蛋白（motor protein） 多亚基的复合体（如核糖体）就象一个生化机器。它 由几个相互作用的工作部件组成。机械性的工作是 力与距离的产物。每一个生化机器的设计都能非常 准确地保证所施用的力的量、所产生运动的量与方 向，最后完成一项特定的工作。其中的力通常由核 苷酸结合蛋白提供，称为NTPae，实质上是机动蛋白 （motor protein，或称机械化学转换器 mechanochemical transducers ）因为NTP（ATP和GTP ）的水解所造成的它自身构象的变化驱动了相连分 子的构象向所需的方向转变。这种NTP水解驱动的构 象变化主要定位于一个固定化的结构单元（称为开 关）。EFTu就是一个广泛研究的GTP结合机动蛋 白。 EFTu有三个结构域（ domain），域含有一个GTP结合位点 和二个开关区，域通过一个柔软的肽段与域相连。在结 合GTP的活性状态下（ EFTuGTP），EFTU有一个aatRNA 结合位点。aatRNA与 EFTuGTP结合后的整个结构称为三 元复合体。 EFTu的三个域都参与tRNA的结合。域的几个氨基酸残基与 tRNA的TC环相互作用。aatRN的反密码子从三元复合物 上突出来，以便与mRNA的密码子相互作用。 在蛋白质合成时，EFTuGDP（非活性状态）与EFTs相互作用 释放出GDP，随后域的GTP结合位点结合一分子GTP并改 变域的两个开关区的构象，结果使域与域靠近，形成 个aatRNA结合缝（binding cleft）。一旦一个aatRNA结 合到该裂缝中，三元复合物就进入核糖体，aatRNA的反密 码子与位点上mRNA D的密码子可逆结合，核糖体构象的 变化触发EFTu 的GTP结合位点的构象变化，随后GTP水解使 域与域分开，aatRNA被释放下来，EFTUGDP离开核 糖体。 (三)、 终止 当终止密码子（UAA, UAG,UGA）进入位点 时肽链合成就进入终止期。原核生物有三个释 放因子（RF1, RF2, RF3）参与终止。 RF1识别UAA和UAG，RF2识别UAA与UGA,RF3 作用尚不清楚，可能促进RF1与RF2结合。这 种识别过程需要GTP并改变了核糖体的构象， 肽酰转移酶的功能发生瞬时变化，转变成酯酶 功能，将连接肽链与P位点tRNA的肽酰酯键水 解开，肽链从核糖体上释放，mRNA与tRNA 解离，核糖体解体。 原核生物蛋白质合成中的能量计算（合成一个二肽） ATPA（GTP） 高能键 甲酰甲硫氨酰tRNA合成 ATPAMP 2 起始（IF2） GTPGDP 1 第二个a.atRNA合成 ATPAMP 2 第二个a.atRNA进入核糖体（EFTU） GTPGDP 1 核糖体移位（EFG） GTPGDP 1 终止（？） GTPGDP 1 合成二肽（形成一个肽链）需8个高能键，其后每加一 个a.a需4个高能键。 例：合成200个a.a残基的多肽 8+1984=800 4n=4200=800 （真核：起始多1个ATP和1个GTP） (四)、 原核生物的翻译后加工 一些新生肽链从核糖体上释放下来后就直接折叠成最 终的三维结构。但多数情况下是新生肽要经过一系 列的加工修饰，才具有功能。有关翻译后加工修饰 的许多信息都来自真核生物中的研究，但是原核细 胞中的多肽也要经过几种类型的共价修饰。 1、 切除加工 包括去掉N端的甲酰甲硫氨酸和信号肽序列。信号肽（ Signal peptide），也叫引导肽（leader peptide），是 决定多肽最终去向的一段序列，通常较短，典型情 况下位于N端。在细菌中的一个例子就是多肽要插入 细胞质膜必须借助信号肽序列。 2、 糖基化 尽管在原核生物中，绝大多数的复合糖是糖酯，但是 ，也有少量的糖蛋白的报道，例如Halobacterium细胞 表面的糖蛋白，有关原核生物糖基化的机制及其功 能都还不知道。 3、 甲基化 甲基转移酶利用硫酰苷甲硫氨酸对特定蛋白进行甲基 化修饰。 在大肠杆菌和有关细菌中发现的一种甲基转移酶能甲 基化膜结合的化学受体蛋白的谷氨酸残基。这种甲 基转移酶和另外一种甲基酯酶催化的甲基化/去甲基 化过程在细菌趋化性的信号转导中起重要作用。 4、 磷酸化 近年来，已经发现由蛋白激酶和蛋白磷酸化酶催化的 蛋白质磷酸化/去磷酸化在原核生物中十分普遍。磷 酸化/去磷酸化的意义还不太清楚。目前只知在细菌 趋化性和氮代谢调空中有瞬间的磷酸化作用。 (五)、 原核生物的翻译调控 蛋白质的合成是一个非常耗能的过程。每形成一个肽 键要消耗4个高能磷酸键（tRNA装载2个，aatRNA 入位1个，移位1个）。在大肠杆菌中，用于合成的 能量90%都给了蛋白质合成。因此，其合成必然要受 到严格的调控。 在原核生物中，蛋白质合成的调控多在转录的水平上 （操纵子模型），有如下几个原因： （1）转录与翻译直接偶联，转录后不久就开始翻译， 图18.7 （2）原核生物mRNA的半衰期很短，大约13分钟， 随着环境条件的改变，细胞内产生的mRNA种类会迅 速改变。大多数mRNA被两种核酸外切酶降解： RNAaseII和多核苷酸磷酸化酶。 除了转录调控机制外，mRNA翻译速率也是调控位点。 这种翻译速率的调控大多是由于SD序列的差异造成 翻译起始效率的不同。因为SD帮助识别AUG和启动 翻译的起始，因此SD序列的变化能影响翻译的起始 效率从而调控了mRNA的翻译速率。乳糖操纵子的基 因产物有3个：半乳糖苷酶，半乳糖透过酶，半乳 糖苷转甲基酶，各个顺反子（即基因之间），常有 一段非编码的间隔区。不同间隔区的长度变化，可 以在1100个之间，甚至可以重叠。但是它们的翻译 量是不等的，硫代半乳糖苷转甲基酶的量只有半乳 糖苷酶的1/5（硫代半乳糖苷酶的功能不清楚。乳糖 发酵通常都是在不能产生它的突变细胞中进行的） 。 乳糖将纵子 产物 Z基因产物：半乳糖苷酶 1 Y基因产物：半乳糖透性粉 0.5 A基因产物：半乳糖乙酰化酶 0.2 除了SD序列的差异外，原核生物还有一种调控机制： 相对过剩的蛋白质翻译产物对自身多顺贩子mRNA翻 译的负调控。也就是说，多顺贩子mRNA的其中一个 产物相对过剩时能抑制整个多顺贩子mRNA的翻译。 图18.8 原核核糖体的55种蛋白质由20个操纵子编码。细菌的 良好生长要求这些蛋白质的合成之间及其与rRNA的 合成之间协调起来。例如PL11操纵子编码核糖体蛋 白L1和L11，如果L1相对过剩就会占用了可利用的 23SrRNA，结果抑制PL11mRNA的翻译。在 23SrRNA缺乏的情况下，L1蛋白也会结合在 PL11mRNA的5端抑制自身操纵子的翻译。 结论： （1）原核生物蛋白质的合成相对较快，它需要起始因 子IF1、IF2、I3，延伸因子EFTU、EFTS、EFG ，释放因子RF1、RF2、RF3的参与。 （2）尽管原核生物基因的表达多在转录水平上进行调 控，但翻译水平上的调控也时有发生，包括SD序列 对翻译起始的调控和相对过剩的翻译产物对自身多 顺反子mRNA翻译的负调控。 四、 真核生物的蛋白质合成 蛋白质合成的研究最早是在哺乳动物细胞内进行的（ 入氨酰tRNA合成酶和tRNA的发现），但到60年代后 注意力却集中到了细菌。原因很简单，细菌细胞易 于培养，细菌基因的表达较简单也易于操作。进入 70年代后，真核细胞的蛋白质合成又变成了研究的 热点。 真核细胞的蛋白质翻译需要大量的蛋白因子，翻译后 加工和定向输送比原核复杂得多。 (一)、 翻译起始 真核的翻译起始比原核尤为复杂，原因如下： （1）真核mRNA的二级结构更为多样和复杂 （2）真核mRNA是经过多重加工的，它被转录后首先 要经过各种加工才能从细胞核进入细胞质中，并形 成各种各样的二级结构。一些mRNA与几种类型的蛋 白质结合在一起形成一种复杂的颗粒状，有时称核 糖核蛋白粒（ribonucleoprotein particle）,在翻译之前 ，它的二级结构必须改变，其中的蛋白质必须被去 掉。 （3）核糖体需要扫描mRNA以寻找翻译起始位点 真核mRNA没有SD序列来帮助识别翻译起点，因此核 糖体要扫描每一个mRNA。核糖体结合到mRNA的5 端的帽子结构并向3端移动一寻找起始位点。这种扫 描过程很复杂，知之甚少， 真核的翻译起始用到的起始因子（eIF）至少有9种 ， 多数的功能仍需进步研究。 翻译起始物的形成过程如下： 图18.9 （1）40S小亚基(eIF3)结合到(eIF2GTP)Met tRNAi复合物上形成40S前起始复合物（40S preinitiation complex） 这里，eIF2GTP介导了起始t RNA与40S小亚 基的结合，然后eIF2GDP通过eIF2B（鸟苷 酸释放蛋白）再生。 此时，由于eIF3和40S小亚基相结合，eIF6和 60S大亚基相结合，所以小亚基暂时还不能与 大亚基相结合。 （2）mRNA结合到40S前起始复合物上形成40S 起始复合物。 该过程需要ATP，另外还需要一些起始因子（ eIF4A、eIF4B、eIF4F、eIF1）。 eIF4F结合在mRNA5端的帽子结构上，eIF4A （一种ATPase）和eIF4B（一种helicase）改 变mRNA的二级结构。对真核起始因子的鉴定 发现一些起始因子是更大因子的组成亚基，如 eIF4E（也称cap结合蛋白或CBP）就是由几 个eIF4F亚基组成。（eIF4F常称为CBP） （3）40S起始复合物扫描mRNA寻找适当的起 始密码子（通常是5端附近的AUG）。 （4）40S复合物与60S大亚基结合形成80S起始 复合物。 该过程另需1个GTP。此时，60S大亚基上的eIF 6已经被释放。在形成复合物过程中，在eIF5 参与下，eIF2GTP水解成eIF2GDP。eIF2， eIF3，eIF4A，eIF4B，eIF4F，eIF1从起始 复合物上释放。 因此，真核生物肽链合成起始复合物由mRNA、 80S核糖体和MettRNAiMet组成。与原核相比 ，真核起始多消耗了1个ATP（形成40S起始复 合物）、1个GTP（形成80S起始复合物）。 （1）40S小亚基(eIF3)结合到 (eIF2GTP)MettRNAi复合物 上形成40S前起始复合物（40S preinitiation complex） （2）mRNA结合到40S前起始 复合物上形成40S起始复合物 。 （3）40S起始复合物扫描 mRNA寻找适当的起始密码子 （通常是5端附近的AUG）。 （4）40S复合物与60S大亚基 结合形成80S起始复合物。 (二)、 延伸 图18.10 与原核类似，也可分为aatRNA的入位、转 肽、移位三步反应。 1、 入位 50kD的延伸因子eEF1GTP与aatRNA结合， 引导aatRNA进入A位点，aatRNA的反密码子 如果与mRNA的密码子正确配对后eEF1GTP 水解掉一个P，随后eEF1GDP离开核糖体， 留下aatRNA。在eEF1、eEF1的帮助下， eEF1GDP再生为eEF1GTP。 在真菌（如酵母）中，需要另一个延伸因子eEF 3与eEF1共同引导aatRNA的入位。 2、 肽键形成（转肽） 核糖体大亚基的肽酰转移酶活性催化A位 点氨基亲核攻击 P位点的aa的羧基，在 A位点形成一个新的肽键。P位点上卸载 的tRNA从核糖体上离开 3、 移位 移位需要一个100kD的延伸因子eEF2GTP。eEF2 GTP结合在核糖体未知的位置上，GTP水解成释放的 能量使核糖体沿mRNA移动一个密码子的位置，然后 eEF2GDP离开核糖体。 (三)、 终止 真核细胞中有两个释放因子eRF1和eRF3（GTP结合蛋 白）介导终止。当GTP结合到eRF3后它的GTPase活 性就被激活，eRF1和eRF3GTP形成一个复合物， 当UAG，UGA，UAA进入A位点时，该复合物就结 合到A位点上，接着GTP水解促使释放因子离开核糖 体，mRNA被释放，核糖体解体成大小亚基，新生肽 在肽酰转移酶催化下被释放。 真核生物蛋白质合成中的能量计算（合成一个二肽） ATPA（GTP） 高能键 甲硫氨酰tRNA合成 ATPAMP 2 起始（IF2） 2GTPGDP ATPADP 3 第二个a.atRNA合成 ATPAMP 2 第二个a.atRNA进入核糖体（eEF1 GTP） GTPGDP 1 核糖体移位（eEF2GTP） GTPGDP 1 终止（eRF3GTP） GTPGDP 1 合成二肽（形成一个肽链）需10个高能键，其后每加 一个a.a需4个高能键。 例：合成200个a.a残基的多肽 10+1984=802 （4n+2）=4200+2=802 (四)、 真核生物的翻译后加工 许多新生肽要经过一种或几种共价键修饰，这 种修饰可以在正延伸着的肽链中进行。一般情 况下，翻译后修饰一是为了功能上的需要，另 一种情况是折叠成天然构象的需要。包括： 1、 切除加工 典型的情况包括切除N端甲硫氨酸、信号肽序列和切 除部分肽段将无活性的前体转变成活性形式。 我们知道，一些酶的前体（称为前体酶proenzyme，或 酶原zymegen）只有切除特定的肽段后才能从无活性 形式转变成活性形式。无活性的多肽前体称为前体 蛋白（proprotein） 图18.11是胰岛素的翻译后加工 包含信号肽的胰岛素前体称为前胰岛素原（pre proinsulin），去掉信号肽的胰岛素的前体称为胰岛 素原(proinsulin),进一步切除称为C链的肽段后才能形 成活性形式的胰岛素（insulin） 蛋白质内含子 90年代初，发现了两类新的内含子。 一类是蛋白质内含子，其DNA序列与外显子一起转录和翻译， 产生一条多肽链，然后从肽链中切除与内含子对应的a.a序列 ，再把与外显子对应的氨基酸序列连接起来，成为有功能的 蛋白质。 另一类是翻译内含子，mRNA中存在与内含子对应的核苷酸序列 ，在翻译过程中这一序列被“跳跃”过去，因此产生的多肽链 不含有内含子对应的氨基酸序列。 2、 糖基化 真核生物中糖基化修饰很普遍，但是糖基基团的功能还不是十 分清楚。通常情况下，分泌蛋白的寡糖链较复杂，而内质网 膜蛋白含有较高的甘露糖。 图18.12是N糖苷键型核心寡糖链的合成,它是在磷酸多萜醇上组 装成的（多萜醇存在于所有细胞的细胞膜上，磷酸化多萜醇 主要存在于内质网膜）。 3、 羟基化 在结缔组织的胶原蛋白和弹性蛋白中pro和lys是经过羟 基化的。此外，在乙酰胆碱酯酶（降解神经递质乙 酰胆碱）和补体系统（参与免疫反应的一系列血清 蛋白）都发现有4羟辅氨酸。位于粗糙内质网（RER ）上的三种氧化酶（脯氨酰4羟化酶，prolyl4 hydroxylase，脯氨酰3羟化酶和赖氨酰羟化酶， lysylhydroxylase）负责特定脯氨酸和赖氨酸残基的羟 化。脯氨酰4羟化酶只羟化Glyxpro，脯氨酰3 羟化酶羟化Glypro4Hyp（Hyp: hydroxyproline）， 赖氨酸羟化酶只作用于GlyXlys，胶原蛋的脯氨酸 残基和赖氨酸残基羟化需要Vc，饮食中Vc不足时就 易患坏血症（血管脆弱，伤口难愈），原因就是胶 原纤维的结构不力（weak collagen fiber structure）。 4、 磷酸化 蛋白磷酸化参与代谢调控和信号转导以及蛋白与蛋白 之间的相互作用。例如，PDGF受体的酪氨酸残基经 过自身磷酸化后才与细胞质定位蛋白质结合。 5、 亲脂修饰 蛋白质亲脂修饰后可以改变膜结合能力和特定的蛋白 与蛋白之间的相互作用。最常见的亲脂修饰是酰化 和异戊二烯化。尽管豆蔻酸在真核细胞中很罕见， 但是豆蔻酰化却是最常见的酰化形式之一。N豆蔻 酰化（豆蔻酸以酰酰氨键形式共价连在肽链N端的残 基上）能增加特定G蛋白的 亚基对膜结合的、亚 基的亲和力。 6、 甲基化 通过甲基转移酶进行。天冬氨酸的甲基化能促进已破坏蛋白的 修复或降解，在2，3二磷酸核酮糖羧化酶（rihilose2,3 biosphosphate carboxylase）、钙调蛋白（calmodulin）、组氨 酸（histone）、某些核糖体蛋白和细胞色素C中都有甲基化的 赖氨酸残基。其它可甲基化的氨基酸残基还有His（如组蛋白 、视紫红质、eEF2）、Arg（如休克蛋白、核糖体蛋白）。 7、 二硫键形成 二硫键通常只发现于分泌蛋白（如胰岛素）和某些膜蛋白中， 在细胞质中由于有各种还原性物质（如谷胱甘肽glutathione和 硫氧还蛋白thioredoxin）所以细胞质蛋白没有二硫键。因为内 质网腔是一个非还原性环境，所以粗糙内质网上的新生肽只 暂时形成二硫键。当新生肽进入内质网腔时，一些肽链可能 会按氨基酸次序依次暂时形成二硫键，但最终会通过交换二 硫键位置的形式形成正确的结构，内质网中可能还有一种二 硫键异构酶（disulfide isomerase）催化该过程。 (五)、 真核生物的翻译调控 真核的翻译调控非常复杂，总结起来有以下几个方面： 1、 mRNA向细胞质的运输 核膜创造的转录与翻译的隔离为基因的表达提供了一个重要的 调控机会。mRNA的加工（内含子切除）、mRNA向细胞质 的运输都是调控位点，mRNA向细胞质的运输是一个受到严 格控制的过程，并且它至少需要mRNA5端的帽子和3端的 poly A尾巴。 2、 mRNA的稳定性 mRNA 的半衰期从20分钟到24小时。在mRNA上有一些去稳定 序列（destablization sequence）,它们的二级结构是核酸酶的底 物，也有些稳定序列（stablization sequence）。特定蛋白与 mRNA上特定序列的结合能影响它的稳定性，3端的腺苷化核 去腺苷化会影响它的稳定性核翻译活性。在核中，mRNA被 加工后运输到细胞质时含有100200个polyA尾巴，当polyA缩 减到30个以下时整个mRNA就会被降解。在特定条件下polyA 能被选择型地延长或缩短。 3、 翻译的负调控 一些阻遏蛋白能结合在特定mRNA的5端阻止翻译的进 行，如铁蛋白的合成。铁蛋白是储铁的蛋白，主要 发现于肝细胞中。铁蛋白mRNA上有铁应答元件（ IRE），阻遏蛋白可以结合在上边，当细胞中铁浓度 高时，那么大量的铁原子就结合到阻遏蛋白上，使 它从IRE上解离，铁蛋白mRNA就可以被翻译。 4、 起始因子磷酸化。 当遭遇热休克、病毒感染、生长因子缺乏等逆境时， 真核细胞eIF2就发生磷酸化，大部分蛋白质的合成 降低，而一些hsp核其它蛋白的翻译增强，以应付热 休克和其他胁迫条件，但其机理还不清楚。 5、 translational frameshifting 一些mRNA似乎含有结构信息，在阅读框内可以从+1 或1出开始阅读，结果翻译出两条或多条多肽。这种 情况常见于被反转录病毒翻然的细胞内。 (6) 真核生物双功能 mRNA 极少数真核mRNA 上，可能从两个不同AUG起始合成 蛋白质。若两个AUG属于同一阅读框，则形成两个 长短不同的蛋白质，其中有部分多肽完全相同。若 两个AUG处于不同的阅读框中，则合成两个序列完 全不同的蛋白质。一条mRNA可合成两种蛋白质，称 双功能mRNA。 (7) 只有最后一个终止密码子的多基因mRNA的翻译 真核生物的泛素蛋白基因。酵母有5个泛素基因，重复 组成基因簇。人类有9个。每个基因编码76个a.a的泛 素。泛素羧端水解酶可识别泛素的空间构象，当翻 译进行到一个单位出来后，泛素的控间构象形成， 这种酶可切下泛素单位。 8、蛋白质的选择性降解 五、 蛋白质合成后的定向转运 由于真核细胞的结构和功能很复杂，所以蛋白 质合成后的定向转运（targeting, translocation ）的机制也很复杂，转运的研究是从分泌蛋白 开始的。现在比较清楚的有两种机制：转录本 的区隔化（transcript localization）和信号肽机 制。 转录本的区隔化 细胞质中蛋白质的分布是不对称的，如果蝇卵中的 bicoid（对果蝇发育中的基因表达起调控作用），果 蝇头部的正常发育（如头节）需要卵头部（anterior ）高浓度的bicoid，卵尾部低浓度的bicoid促进果蝇 尾部的发育。将第一个卵的尾部细胞质取出并替掉 第二个卵的头部，那么由受体卵发育出的幼虫就有 两个尾部。现在认为细胞质中蛋白质的梯度是由转 录本的取隔化造成的。所谓转录本的区隔化就是特 定mRNA与细胞质中特定位点的受体结合。bicoid mRNA是从附近的nurse 细胞进入正发育的卵母细胞 中，一旦进入卵母细胞，bicoid mRNA通过其3端与 顶部细胞骨架的特定组分结合。当成熟的卵发育时 ，bicoid mRNA的翻译（与bicoid蛋白的扩散偶连） 就造成了bicoid蛋白的浓度梯度。 现在看来多肽的转运有两种机制：（1）翻译转 运同步机制（共转译，cotranslational transfer ）。分泌蛋白、质膜蛋白、溶酶体蛋白、内质 网和高尔基体滞留蛋白，首先在游离核糖体上 合成含信号肽的部分肽段后就结合到内质网上 ，然后边合成边进入内质网腔，经初步加工和 修饰后，部分多肽以芽泡形式被运