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使用纯化基因的发育生物学研究作者 唐纳德.D.布朗 翻译 罗长春 一些历史三年的大学过后，1952年的秋天布朗进入了芝加哥大学医学院开始了生物化学的学习和研究。生物化学系噬菌体研究组的劳埃德. 兹洛夫负责对他进行指导。这期间他开始寻找未来的研究课题，认为它应当是一个医学相关并且当时最先进的生化方法也没有研究过的重要问题。胚胎学，当时被称作“发育生物学”，引起了他的注意。生殖生物学几乎没有被讨论到，描述胚胎学也仅仅是作为大体解剖学的一部分上了两堂课。1953年，他参加了一个讨论沃森-克里克发表在科学周刊上描述DNA结构的文章的一个生物化学杂志俱乐部，当时立刻就意识到自己将来会从事DNA、生物化学和胚胎学的交叉研究。在新奥尔良慈善医院的实习过后布朗结了婚，之后和妻子一起搬到了马里兰州的贝塞斯达。接下来便在美国国立卫生研究院的一流研究协会（心理健康研究所）里工作了两年。这两年是非常愉快的，他参与了西摩.凯蒂组织的一项工程，负责系统研究精神分裂症相关分子的代谢。布朗被指定研究组氨酸的泌尿代谢，因为它是与精神分裂相关的一种复合物-组胺的前体。两年的最后，他将含有10微居里碳14标记的组氨酸给10个健康人和10个精神分裂症患者食用，采集他们的尿液，并且分析其中的放射性元素，然后便发表了关于精神分裂症生化基础的为数不多的几篇文章中的一篇。1959年，也就是乳糖抑制子被发现的第二年，布朗从美国国立卫生研究院到巴黎的巴斯德学院研究细菌的基因调控。在离开贝塞斯达之前，他非常幸运的了解到当时附属于约翰霍普金斯医学院的一个叫做华盛顿卡内基研究所胚胎学部的小的研究机构。他联系到部门的主任吉姆艾伯特，为自己在巴黎回来之后安排了一个高级博士后奖学金。很难想象哪两个部门会比这两个更加多元化。巴斯德学院致力于分子生物学的发现，当时在生物学研究方面处于国际领先地位。每天的午饭时间贾克莫诺、方斯华贾克柏和安德烈利沃夫都会组织一个很有意思的讨论，经常还会有很著名的科学家的造访，增添了他们的乐趣。胚胎学系用了50年的时间逐步弄清了人类胚胎的解剖学发育。这里的研究人员主要致力于实验胚胎学的研究，布朗是第一个生物化学家。这就是他为什么用50年的时间在巴尔的摩卡内基研究所胚胎学部来寻求发育生物学中的基因调控课题。因为那就是最理想的地方。DNA重组时代之前的基因分离布朗选择豹蛙的胚胎作为研究对象。它的卵可以在体外受精，而且所有胚胎同步发育，因此提供了无穷的生化研究素材。他在巴斯德学院的时候，两个小组分别独立发现了信使RNA (mRNA)，对细菌的研究也清楚的表明核糖体RNA (rRNA)和转移RNA是基因的直接产物。在这之前，胚胎研究中认为“微分基因作用”是酶活性的波动，进而代表了蛋白质数量的变化。布朗意识到，由于RNA与基因的关系比蛋白质与基因的关系要近，对RNA的分析会是对基因表达变化的更可靠地反映。在20世纪60年代早期，蔗糖密度梯度离心就已经被设计用来分离三类常见RNA的大小：18S和28S RNA ,小分子RNA和一种认为包含了新发现的mRNA的异质类DNA RNA。他发现这三种不同大小的RNA在发育阶段的合成速率有着极大地差距。尽管未受精的蛙卵是单细胞的，它仍然含有和多细胞机体组织，如肝脏，一样数量巨大、质量相同的核糖体。新的rRNA在胚胎发育到10000个细胞之后才开始合成，但是新合成的核糖体在几天之内并没有实质上改变核糖体的总含量。布朗在卡内基医学院的第一项发现是胚胎在蒸馏水中不发育。它们需要的四种阳离子按发育阶段来说分别是-钙离子、钠离子、钾离子和镁离子。镁离子缺乏症特别有意思，因为如果缺少镁，胚胎发育几天之后就会在蛙胚胎开始增加rRNA总量的阶段被阻滞为游动的蝌蚪。众所周知，镁元素将核糖体聚在一起。1962年，他读到了一篇关于非洲爪蟾的变种核仁的数目发生变化的文章。野生型的细胞核内有两个核仁，杂合子细胞核内有一个核仁但表型很正常。两个杂合子杂交可以产生典型的孟德尔子代比率，其中有四分之一的子代没有核仁。这些纯合突变体的发育和正常缺镁胚胎停滞在同一个时期（图1），使他设想突变会影响新核糖体的合成。对照组 缺核仁组 缺镁组图 1. 发育四天后的非洲爪蟾胚胎对照组（左）、缺核仁组（中）、缺镁组（右）的对比，缺镁和缺核仁将胚胎发育组织在同一时期。来自参考文献2.这种变种唯一的来源就是当初发现它的牛津实验室。同时，布朗了解到非洲爪蟾从非洲进口是为一位企业家做受孕实验用的，而他就住在离布朗仅仅十英里远的巴尔的摩郊区。布朗立即就把注意力从豹蛙转移到了非洲爪蟾上。牛津的约翰.茄当和布朗成立一个小组来验证缺核仁突变体不合成18或RNA。这些突变的胚胎能够正常合成另外两类RNA。马克斯.伯恩斯蒂尔和他在爱丁堡的同事进行了下一步实验。众所周知，rRNA碱基的构成中比要比DNA中高很多。应用杰罗姆.文欧格瑞德开发的平衡CsCl离心分离方法，伯恩斯蒂尔和他的同事表明编码rRNA的基因与大簇DNA是分离的，并且在缺镁突变体中缺失。通过分子杂交技术他们也表明非洲爪蟾的单倍体中有几百个拷贝编码rRNA的基因与DNA互补，而且它们必须聚成一簇，但是单个突变体中把它们全部都敲除了。平衡CsCl离心分离成为了下一个十年中最重要的分离不同碱基构成DNA的方法。这使得伯恩斯蒂尔成功提纯了非洲爪蟾的核糖体DNA（rDNA）。这是第一次从有机体中分离出基因。1966年，在乌拉圭的蒙得维的亚的一次关于核仁的讨论会上，奥斯卡米勒展示了两栖动物卵母细胞核子中基因正在转录RNA的电子显微图。这些基因和预测的rRNA基因的大小相当，而且它们来自每个细胞核中的上千个核仁（图2）。由于卵母细胞是四倍体，应该只有四个核仁，因此布朗预测额外的核仁肯定含有很多编码rRNA的额外基因。伊戈尔.戴维德和布朗，还有乔.戈尔分别发现了两栖动物卵母细胞核编码18S和28SrRNA的基因的“特殊扩增”。图 2. 非洲爪蟾成熟卵母细胞中分离出的细胞核，核直径约400微米，甲酚紫染色 突出了数以千计的核仁。来自参考文献5。布朗发现编码5S rRNA的基因并没有与rRNA基因链在一起，而是组成了非洲爪蟾基因组上一个比rDNA更大的分支。他们在1971年（参考文献7）利用这很多串联重复的5S rRNA基因序列中的非常态碱基构成提纯并研究了非洲爪蟾基因组DNA中的5S RNA基因（rDNA）。在DNA测序和重组技术发明以前，这些小基因对于细节特征和功能研究特别有用。他们研究出垫片DNA把串联基因分离开来（图3）。在非洲爪蟾的不同品种之间这些垫片是很不同的，但是基因却高度保守。然而在种内，垫片却高度相似，产生了一种他们称作水平进化的现象。每一个5S rRNA基因拷贝中都有一个假基因。第一个被完全测序的真核基因是妮娜.费德洛夫和乔治.布朗利完成的染色体5S DNA 片段。布朗小组发现在非洲爪蟾基因组中有多个5S rRNA基因家族。最大的一个只在卵母细胞中表达，他们称之为“二重5S rRNA基因系统”，他研究了10余年。5S DNA是卵母细胞核粗提物中一个精确转录的模板，提供了一个简单的鉴定转录过程中准确起始和终止必须的顺式作用DNA序列的方法。基因可以被克隆以后，他们做了5S rRNA基因周围和内部的连续的基因敲除，然后测试了每个变种的细胞核粗提液中转录5S rRNA的能力。令他们感到吃惊的是，他们敲除掉基因3或5端的三分之一之后，基因仍然能够正常转录（图4）。他们称这种为“内部控制区”。鲍勃.罗德尔和她的同事提纯了非洲爪蟾卵母细胞中的第一个真核转录因子。这种名为TFIIIA的蛋白质将5S rRNA基因的内部控制区铆合在一起。TFIIIA是第一个锌指蛋白类的转录因子。丝纤蛋白mRNA和编码基因1968年发明的基因扩增技术刺激布朗思考这种机制是否更广泛的存在于细胞大量合成图 3. 含有5S DNA重复单元的部分失活的分子的电镜图。5S rRNA含有三分之一的原有区域，平均重复长度约700个碱基。来自参考文献7.基因产物的途径中。他当时已经读到了关于非天然氨基酸序列和家蚕中的丝纤蛋白大分子的报道。大部分蛋白含有多个甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丝氨酸序列，这意味着mRNA和基因中GC比很高。幼虫发育的最后阶段，大部分丝腺后端合成的蛋白都是这种单一的蛋白。那时，只有网状细胞中的血红蛋白mRNA通过蔗糖梯度离心被鉴定为离散mRNA。铃木义明来布朗的实验室做博士后研究，他们开始一起养蚕。他通过蔗糖密度梯度离心分离出了丝腺后端合成的32P标记的mRNA。局部测序确定了丝纤蛋白mRNA中预测的非天然序列。放射性mRNA的纯度足够与丝腺后端和控制蚕组织的DNA杂交，显示出所有细胞型中只有一种丝纤蛋白基因。这就排除了DNA扩增解释丝腺后端大量地特异性合成丝纤蛋白mRNA的可能性。丝蛋白合成只是极端转录扩增的一个例子。在两到三天的周期内，每一个蚕丝蛋白基因都指导10000个mRNA拷贝的合成，每一个mRNA反过来又合成100000个蛋白质，这样一个基因合成了109个蛋白质分子。两栖动物变态随着20世纪70年代DNA重组技术的发明，对单个基因的研究成为了可能。1990年，研究了简单5SrRNA的结构和调控10年之后，布朗决定转换研究课题。他选择了两栖动物的变态-一个使每一个成功生物学科着迷，但是却被分子生物学家忽略了的奇妙的生物问题。问题很简单。一个甲状腺激素分子怎么就能改变这么多细胞的表型呢？罗恩.埃文斯和Bjrn Vennstrm在1986年关于甲状腺受体是转录因子的发现使布朗确信肯定有很多的基因表达发生变化才能导致甲状腺激素控制变态的发生。这个系统的技术优势当时已经被广泛应用。蝌蚪对外生的甲状腺激素非常敏感。抑制哺乳动物甲状腺合成激素的化学物质在两栖动物中也能起到很好的作用。所有脊椎动物中的垂体-甲状腺轴都是相似的。这个系统的不足之处是忽视了传统遗传学而且青蛙的生命周期长。1996年非洲爪蟾中图 4. 5S rRNA中的一个转录控制区。水平轴表示每个敲除的范围，能够准确起始转录的突变体用+表示，竖直线标示的区域是基因的内部控制区。来自参考文献11和12。转基因发现的时候，他们可以通过细胞特异启动子驱动转基因过量表达。除了别的发现，这使他们可以证明甲状腺激素受体是变态中所有激素导致变化的原因。在最近的一篇评论中布朗总结了这个领域的现状。卡内基科学院的胚胎学系他们们系有八个永久员工席位。这些职位并不授予终身职位，而是每五年竞争性地续职。布朗在1976年成为系主任之后做的一项改变就是启动了一个独立的青年教职员工项目。大学应届毕业或者博士后阶段都可以申请助理研究的岗位。申请这些职位的关键是研究者必须完全独立。助理研究员在实验室全职工作，并且有一名技术员的协助。由于这些职位都是有任期的，所以助理研究员知道五年之后他们必须离开这里。这些年来这些独立的年轻研究院增添了系的多元化，提高了团队的活力。他们中的大部分都找到了不错的工作，并且取得了突出的成绩。几所其他的研究型大学和学院也启动了类似的项目。生命科学研究基金会布朗建立生命科学研究会(LSRF; /)的一个原因是一个很简单的经验，那就是年轻人做研究做得更好。1980年，在制药行业中，生物很明显地开始代替化学成为主流方法。分子生物学受DNA重组技术的启发，已经随时准备变革制药方法。此外，发现这些成果的并不是公司，而是政府通过NIH和国家科学基金额外资助项目资助的非营利组织。大学中的科学家已经开始着手建立公司。布朗不断寻找推动这种交叉的方法，希望公司能够对大学和研究机构的生物学研究重新感兴趣。通过一些思考和咨询，他选择了一个简单的博士后项目，希望恪守收到主要制药公司的资助。除了这些公司，霍华德休斯医学院、一些基金会、一家政府机构（生物科学能源部）和几个慈善科学家资助了LSRF奖学金。他们从来没有过捐助，因此每年都要征求资助者。2012年，他们从900名申请者中选出了50人，并且授予24人奖学金。今年秋天他们将会迎来他们30周年的校友庆典。参考文献1. Elsdale, T.R., Fischberg, M. & Smith, S. A mutation thatreduces nucleolar number in Xenopus laevis. Exp. CellRes. 14, 642643 (1958).2. Brown, D.D. & Gurdon, J.B. Absence of ribosomal RNAsynthesis in the anucleolate mutant of Xenopus laevis.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 51, 139146 (1964).3. Wallace, H. & Birnstiel, M. Ribosomal cistrons and thenucleolar organizer. Biochim. Biophys. Acta 114, 296310 (1966).4. Miller, O.L. & Beatty, B.R. Visualization of nucleolar genes. Science 164, 955957 (1969).5. Brown, D.D. & Dawid, I.B. Specific gene amplification in oocytes. Science 160, 272280 (1968).6. Gall, J.G. Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60, 553560 (1968).7. Brown, D.D., Wensink, P.C. & Jordan, E. Purification and some characteristics of 5S DNA from Xenopus laevis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68, 31753179 (1971).8. Miller, J.R. et al. The nucleotide sequence of oocyte 5S DNA in Xenopus laevis. II. The GC-rich region. 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