何首乌ISSR

精品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 1 / 11 何首乌 者：赵振华，严萍，焦旭雯，赵树进 【摘要】 目的 建立和优化 应体系。方法通过单因素实验研究 应体系中主要成分（模板、 合酶、 引物、 及退火温度对扩增结果的影响。结果建立了适合何首乌 析的反应体系和扩增程序，即在 25 l 反应体系中，内含 1配套缓冲液、 100 板、 U 合酶、 引物、 增程序为 94 预变性 5 后是 94 变性 45 s，（据不同引物的退火温度）复性 1 2 延伸 35 个循环； 72 延伸 7 4 保存。结论这一优化体系的建立为今后利用 记技术进行何首乌鉴定及种质资源遗传多样性分析提供了一个标准化程序。 【关键词】 何首乌；简单重复序列区间扩增多太性； 反应体系； 建立与优化 to of NA 品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 2 / 11 25 l 00ng U NA as a 4, 35 5 s 4, to of 2, a 2 . la y of 首乌 载于开宝本草，喜生于温湿、腐殖质丰富的砂土，主产于河南、广东、贵州、江苏、湖北、四川等地。其块根及藤均为名贵中药材，生首乌能解毒，消痈，精品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 3 / 11 润肠通便；制首乌能补肝肾，益精血，乌须发，强筋骨；首乌藤养血安神，祛风通络。 单重复序列区间扩增多态性）标记是 1于 1994 年建立的一种基 于 新型分子标记技术。近年来， 广泛应用于植物品种鉴定，种质资源和遗传多样性的研究，并作为构建遗传图谱的工具 2,3。该技术无需预知受试基因组序列，多态性高、操作简单、成本低廉，且扩增时退火温度比较高，保证了 增的可重复性，被认为是非常理想的研究居群问题的分子标记。目前对何首乌化学成分、药理作用和临床应用等方面的研究较多 4 6，但应用 子标记对何首乌种质资源进行分子水平的研究尚未见报道。本研究详尽探讨了何首乌 应的优化条件，建立了重复性好、结果清晰而稳定的何首乌 应体系和扩增程序，为进一步利用该标记技术进行何首乌鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了良好的基础。 1 器材与方法 材料 何首乌样品采自湖北恩施，经华南植物园邢富武教授鉴定，用干燥剂将叶片干燥后置于 冰箱备用。 精品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 4 / 11 仪器与试剂 基因扩增仪； 胶成像系统； 200 自 物根据加拿大哥伦比亚大学 (布的序列，由上海生工生物工程公司合成，经初 步筛选，确定 列为 此次试验的引物。 基因组 提取及检测根据本课题组建立的方法提取与检测，详见文献 7。 始条件及程序参考有关 析的文献 8 10，设计何首乌 始 25 l 反应体系：1配套缓冲液， 板 50 1U 合酶， 引物， /L 增程序为： 94 预变性 5 后是 94 变性 45 s， 56 复性 1 72 延伸 35 个循环； 72 延伸 7 应结束后， 4 保存。 物检测扩增产物在含有 %（ W/V）的琼脂糖凝胶中电泳分离，电压 5 V/泳结束后，在凝胶成像系统上观察并照相记录。 退火温度的确定采用梯度 式，设定退火温度最低 和 最 高 ， 扩 增 仪 自 动 生 成 12 个 温 度 梯度：， 。其余 增程序同 “” ，以确定最合适的退火温度。 精品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 5 / 11 何首乌 增反应体系的优化 增反应体系的优化采用单因素 实验。 板量设 5， 10， 20，40， 60， 80， 100， 120， 160， 200 0 个浓度梯度； ，共 6 个梯度； ， 7 个浓度梯度；引物设， 7 个浓度梯度； ， 7 个浓度梯度。每一个合适条件确定后，作为后续研究的一个条件。 2 结果 退火温度的确定 应中，退火温度的高低直接影响到引物与模板特异性结合。如图 1 所示，当退火温度为 时，扩增的条 带亮度弱且杂带多；退火温度为 时条带亮度增强但主带缺失；退火温度为 时，扩增的条带之间界限分明、亮度适宜、背景清晰；温度为 时，随着温度的升高，扩增条带逐渐减少，亮度减弱。通常较低的退火温度在保证引物与模板结合稳定性的同时，也会使引物与模板之间未完全配对的一些位点间得到扩增，产生非特异性条带。因此，在允许的范围内，选择较高的退火温度可减少引物 与模板之间的非特异性结合，提高反应的特异性 11。本研究中，合适退火温度的范围为 ，选择何首乌最适退火温度为60 。以下实验均应用这一退火温度。 精品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 6 / 11 模板 度对 增的影响 模板浓度对 物的特异性和稳定性影响不大，如图2 所示，除模板量在 5 扩增产物少外，其余 10 200 是扩增强度略有差异。模板量为 10 100 ，随着模板浓度的增加，扩增的产物量有所增加， 100 条带最亮；再加大模板用量， 120 200 着模板量的增加 ，扩增的谱带亮度反而减弱。因此，我们将何首乌 00 合酶对 增的影响 的活性与用量关系到扩增能否正常进行，是应中重要的因子。如图 3 所示，当酶用量为 U 时扩增条带相同，都可获得良好的扩增效果；增大酶用量为时扩增条带产物反而减少，这与一些文献 12， 13报道相同，酶量过高反而引起 增效果的降低。本研究选择每个反应 U 的酶量作为何首乌 应的最佳酶用量。 度对 增的影响 度对 应的特异性和扩增效率均有较大影响，浓度过高使非特异性扩增产物增加，浓度过低使扩增产物减少或导致扩增反应失败。如图 4 所示， 度为 精品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 7 / 11 时，没有扩增产物或只有极少数几条带； 度为 时，能得到清晰稳定的条带； 度为 时，扩增的非特异性条带增多且背景模糊。因此，本研究选择 的 度作为何首乌 应的最佳浓度。 引物浓度对 增的影响 引物 浓度的高低也是 应中的影响因素。如图 5 所示，引物浓度为 时，扩增很弱；引物浓度为 时，扩增条带相同，但以 时，条带最清晰明亮；引物浓度大于 时，大分子量条带缺失且非特异性产物增加。本研究选择 的引物浓度作为何首乌应的最佳浓度。 度对 增的影响 度直接影响 增产物的生成。如图 6 所示，度为 时，扩增的条带少且强度较弱； 时条带多且清晰， 相对而言 条带更亮些；大于 时扩增产物明显减少。因此，本研究选择 的 度作为何首乌 应的最佳浓度。 3 讨论 增易受多种因素的影响，如模板 、 及引物等，扩增条件的变化会对 谱产生较大精品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 8 / 11 的影响，从而影响 析的准确性和稳定性，因此为了获得重复性和可靠性高的 谱，对何首乌进行引物的筛选、 增条件的优化及不同引物的退火温度的确定十分必要。本实验采用单因素完全实验设计，逐一研究各因素不同处理水平的影响，比较系统和精细地研究了各主要因子的影响，较快地建立了适合何首乌的 化体系，为后续实验奠定了技术和理论基础。 退火温度对扩增条带的清晰程度有明显影响。引物的碱基构成不同，适宜的退火温度就可能不同，因此，只有根据引物序列的碱基构成进行相应的退火温度设计、优化，才能获得清晰、稳定的扩增带。 反应条件的变化对 增影响较大，特别是 度。合酶是 赖性酶，对 度非常敏感。选择合适的 度，对 应至关重要，引物和模板 的双链杂交体的解链和退火温度也受二价阳离子的影响，特别是其中的 度能影响反应的特异性和扩增片段的产率。度过低时，酶活性显著降低；过高时，则酶催化非特异性产物的扩增。而且， 应体系中的模板 物及 磷酸基均可与 合，影响 实际浓度，因此在实验的反应体系中， 一个较难把握的因素，需要加以重点考察。 精品文档 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 9 / 11 本研究结果显示，何首乌 应优化的扩增体系为：25 l 反应体系中，含 1配套缓冲液、 100 板、 合酶、 引物、 增程序为： 94 预变性 5 后是 94 变性45 s， 60 （引物 性 1 72 延伸 35 个循环；循环结束后 72 延伸 7 4 保存。 【参考文献】 1 , , . by - J 1994, 20:176. 2 E, V, J, et an to in J 1999, 98:1125. 3 , , , by J 2002, 45:481. 4陈万生 ,杨根金 ,张卫东 ,等 2016 全新精品资料 全程指导写作 独家原创 10 / 11 物 J 2000,35(4): 273. 5杨朝晔 J 1999,10(5):390. 6吴兆洪 ,杨永华 ,柳玉瑾 ,等 J 2000,22(12):844. 7严萍 ,赵树进 提取 J 2007,18(3):607. 8周延清 ,景建洲 ,李振勇 ,等 增条件优化的研究 J 2004,24(1):6. 9张志红 ,谈凤笑 ,何航航 ,等 件的优化 J 自然科学 ),2004,43(