质量源于设计(QbD)指导原则在医疗器械研发中的实证研究_——层析式总胆固醇自测仪的研发项目管理

本文主要思考和讨论的内容是尝试将质量源于设计（ 一理念和原则运用于一个全新的医疗器械产品研发的项目全程设计 、 跟踪 、 指导和管 理，以期获得将 实于医疗器械研发的一些初步方法和成功或失败两方面的一 些基本经验，以及为今后进一步探索如何将 导原则同医疗器械新产品研发相 结合建立一个初步的研究实例和方法学案例。 相较于制药企业，国内的医疗器械（包括诊断试剂）企业对 念和原则的 接受和推广得更晚 ， 因而更需要有既符合科学实践原则又具有实际指导意义的新理念 和新方 法来指导医疗器械产品（包括诊断试剂产品）的研发、生产和市场销售的各个阶段。 而 ，国内目前 通 常译作即时检验或现场检验，作为 医疗器械产品中的一个特殊领域 ， 近年来在国外 ， 尤其是欧美市场取得了长足的发展， 但国内自上世纪九十年代中期开始引进和推广血糖仪产品及妊娠和尿试纸检测等少 数几个产品外，并无更多的产品推出，而临床和实际又有较广泛的应用和需要。 本项目团队根据这一个情况，经过广泛的调研和认真的评估，提出了开发总胆固醇（ 品的计划和构想，并依据同期在北大 习所获得的 关知识、方法和经验，创新地尝试在项目启动初期即将正在国内外 制药领域推广应用的 方法和原则运用于实际的产品研发全过程中。 关键词： 质量源于设计 医疗器械研发 即时检验 总胆固醇检测仪 D),in to to in 目 录 第一章 序言 1 究背景 1 其在制药行业中的应用 1 疗器械和 5 析式胆固醇自测仪的研究背景 8 究内容 8 究意义 10 论文的研究方法 10 第二章 层析式总胆固醇自测仪的设计 11 测原理设计 11 胆固醇定量分析方法概述 11 量分析方法选择 13 器设计 14 器原理设计 14 测系统设计 14 测系统选材 16 第三章 层析式总胆固醇自测仪的开发 22 胆固醇的酶法模拟检测 22 氧化氢的测定 22 固醇的测定 25 血清中总胆固醇的测定 28 血清中总胆固醇的测定 33 胆固醇的快速层析检测 37 应系统的定型 37 器结构的定型 42 氧化氢的测定 44 控血清中总胆固醇的测定 46 血清中总胆固醇的测定 47 第四章 稳定性研究 50 定性研究方案 50 定性研究目的 50 定性的基本内容 50 效期限的确定 52 定性研究项目的设置 53 定性研究结果 54 色试纸的稳定性结果 54 应控制纸的稳定性结果 54 液的稳定性结果 56 第五章 临床试验 61 床试验方案 61 的和项目内容 61 体设计 61 床评价标准 62 床试验持续时间及其确定理由 64 病种临床试验例数及其确定理由 64 择对象范围 、 选择对象数量及选择理由 64 作用预测及应当采取的措施 65 床性能的评价方法和统计处理方法 65 床试验结果 66 收试验结果 66 比试验结果 66 内精密度 74 第六章 结论与展望 76 论 76 例说明 76 艺设计的透彻理解 76 验设计和验证 78 计空间的建立 80 望 82 参考文献 83 后记 86 1 第一章 序言 究背景 其在制药行业中的应用 念的起源 质量源于设 计 （ 的 简 称 ， 美国知名质量管理学者 先提出这个概念，他在多篇著作中阐述了他的观念，其中最著名的当数。 为质量应该能被设计出来 ， 大多数的质量危机和 问题与最初的设计有关。 则已被用于提 高 各个工业的产品和流程的质量 ， 在电子 、 汽车 、 飞机制造 行业已经成功应用多年，尤其是在汽车行业。近年来以美国 代 表的药物监管机构提出采用 则作为国际药品生产质量治理的新方向， 生产指南中关 于 定 义 为“a 2。 实施背景 人用药品注册技术要求国际协调会（ 台相关指导文件 及 设计与药品质量之间的关系进行阐述，并与 险管理 ） ， 量管理体系） 等文件构成理想的质量控制状态的框架 3，如图 1示。其中 分明确说明质量不是通过检验注入到产品中，而是通过设计赋予的。想要获得良好的设计，必须增加对产品的认知和工艺的全过程控制，并且达到两个目的：一是设计空间的建立，二是 为可借此拓展出更灵活的管理办法 4。 从药品监督管理者的角度看，药品的 研发、生产、审评和监管等业务角度看药品质量，可以粗略地分成操作和技术两个层面。一般认为，药品生产和监管（ 要关注操作的内容，药品研发和审评主要关注技术内容。但 理念将上述操作 层面和技术层面的问题有机地融合为一体，整体地纳入了集药品研发、生产科学 （ 监管科学（ 一体的科学范畴，为从 2 根本上提高药品质量提供了科学基础，也为药品监管提供了新的理念和手段 5。 图 1品质量体系 框架 3从药品生产企业的角度来看 ， 通过 以实现在设计阶段就考虑产品质量和患 者需要，通过试验设计确定设计空间，使工艺开发更有目的性，避免在大生产阶段变更生产工艺参数，即使变更也要在设计空间被合理变动。在试验开发阶段，可以充分利用同类产品 、 其他生产厂家的技术信息和已有的知识 ， 科学理解和掌握生产工艺和 步骤，实现知识管理。 最后从经济的角度来分析 ， 据 算 ， 由 于 设计缺陷导致产品召回占召回总量 的 40。采用 行管理的半导体行业，其质量缺陷率可以达到 6 西格玛，即百万 分之三点四，质量成本占 1 3 。而传统方式管理的制药行业，其质量缺陷率仅可以 达 到 2 西格玛 ， 即百分之三十 ， 质量成本占 25 35 6。 这组数据 对 比是制药企业采用 低产品成本的巨大推动力。 制药行业的理解 一种更系统化 的 开发方法 ， 在产品的 整 个生命周期中融合了现有的知识和 实验设计得到的研究结果 ， 运用了质量风险管理和知识管 理 （ 10） 。 该方法增强 了产品质量目标的实现能力 ， 有助于监管者更好理解公司的战略 。 导的药物开 发主要包含以下内容：制订产品质量目标文件（ 、确定 产品关键的质 量 属 性 （ 、 风险评 估 （ ： 将原材料属性和工艺参数与产品 系在一起、限定设计空 间 （ 、 设计 和 实 施 控 制 战略（ 、管理 产 品 生 命 周 期 （ 和持续 改 进 ( 7。 其中 ， 将原 材 料属性与终产品 3 结在一起是一种有价 值的科学过程，有助于确定哪些材料属性和工艺参数严重影响产品的 药品的质量保证并不能通过测定来达到 ， 而是通过对药物的研 发 过程中科学信息 的积累和对药物性能和生产工艺的了解 ， 包括生产过程中各参数与药品中各组分的相 关作用 ， 以及可靠的质量管理体系 。 最 终目的在于药品应当为病人的需要和药 物性能而设计 。 而生产过程则应设计成为达到生产中关键技术指标 ， 熟悉原料和生产 过程中各参数对药品质量的影响 ， 辨别生产中各种误差来源并能有效控制 、 以及持续 不断的监控生产过程 。 所有这些信息应及时反馈到设计程序中以达到 对生产工艺的不 断改进，进而达到对药品质量改进之目的。 图 1程和各元素间的质量关联图 8 在 . 列举了当前医药界一般开发方法与使用 方法比较 7，详见表 1 制药行业的应用情况 2005 年，以美国 代表的发达国家的药政监管部门开始积极倡导和推行美国制药业在 2005 年开始讨 论 2006 年 美国正式启动。 为， 基本组成部分，是科学的、基于风险的全面主动的药物开发方法，从 4 产品概念到工业化均精心设计 ， 是对产品属性 、 生产工艺与产品性能之间关系的透彻 理解。对按照 念开发的药品， 审评的过程中将乐意更多地与企业进行沟 通 ， 并在日常的监管中对于设计空间范围内的操作变更不再进行审批 ， 实行更为宽松 的“弹性监管”。这一切都是因为 申报项目有了更多的了解，这增加了 信心，也有利于申报项目获得批准。 表 1药界一般开发方法与使用 方法比较 7 项目 施前 施后 药物开发 主要靠经验 系统化，深刻理解原材料属性和工艺 全过程 一次仅研究一个变量 参数与产品 联系 多变量的实验，以便理解产品和工艺 流程 建立设计空间 运用 制造流程 制造流程固定，验证完整批， 在设计空间范围内调整 关注优化和重现性 验证整个生命周期，理想状态是连续 的流程验证 关注控制策略和稳定性 运用统计学流程控制方法 流程控制 过程质量控制系统和离线分析 制和实时监控 产品参数 测试产品质量 根据产品所需性能的相关支持性数 根据注册时每批的数据 据，科学优化出设定参数 控制策略 药物质量控制主要是中间体和 基于风险和知识管理，质量控制转移 产品测试 到上游，使实时放行测试或减少终端 产品测试变为可能 生命周期 反应行为（如解决问题，纠正 预防性的持续改进 管理 措施） 2005 年 7 月开始， 募了辉瑞、默克和礼来等 9 个国际大公司企业的 11 个项目进行 册申报试点。目前，其中的 9 个项目已经通过了注册审批。辉瑞伐 5 尼 克兰片剂（ 马拉韦罗片剂（ 新药申请中参与了 试点计划。辉瑞可以立即对伐尼克兰的生产过程进行变更，从而实现了上市后监管的灵活性，这一计划预期将会为辉瑞节省 2 亿美元 6。 退休前一直负责 点项目，现任辉瑞全球化学药品生产监管部高级总监的 陈琪婉博士认为，下一步， 会在国际上继续积极推动 运用，并帮助工业界实施 过， 法办公室生产与产品质量部副主任 示， 成一个强制执行的要求 ，但会鼓励企业实施 南。这点在 疗器械和 国医疗器械的发展现状 医疗器械监督管理条例 9规定，医疗器械是指单独或者组合使用于人体的仪器、设备、器具、材料或者其他物品，包括所需要的软件；其用于人体体表及体内的作用不是用药理学 、 免疫学或者代谢的手段获得 ， 但是可能有这些手段参与并起一定 的辅助作用；其使用旨在达到下列预期目的： （一）对疾病的预防、诊断、治疗、监护、缓解； （二）对损伤或者残疾的诊断、治疗、监护、缓解、补偿； （三）对 解剖或者生理过程的研究、替代、调节； （四）妊娠控制。 我国将医疗器械分为三类 9，具体分类情况如下： 第一类是指，通过常规管理足以保证其安全性、有效性的医疗器械； 第二类是指，对其安全性、有效性应当加以控制的医疗器械； 第三类是指，植入人体；用于支持、维持生命；对人体具有潜在危险，对其安全性、有效性必须严格控制的医疗器械。 上述分类是根据安全性来分类的 ， 医疗器械使用的风险从低到高次序依次为一类、 二类、三类，因此监管的严格程度也逐级提高，生产第二类、第三类医疗器械应当通 6 过临床验证 。 第一类医疗器械由 设区的市级食品药品监督管理局审批 、 发产品注册证。 第二类医疗器械必须由省级食品药品监督管理局审批 、 发产品注册证 。 第三类医疗器 械必须由国家食品药品监督局审批、发产品注册证。 尽管“七五”至“九五”期间，国家对医疗器械科技攻关项目投入的总资金即已近 3000 万元，但由于医疗器械产业整体基础薄弱，销售总额低，大多数企业自身的 研究开发费投入和销售额之比至多也不超过 3%。欣慰的是，近十年来随着国家经济实力的增强，有关部门设立的多种类型科研或开发资助项目（如 863 计划、国家重点专项、产业化专项、中小企业创业基金等等 ）中，列入医疗器械相关课题明显增加， 大大增强了支持力度。仅 2002 至 2004 年的短短三年中，国家利用国债资金投入 30 多个医疗器械项目 ， 其投入总额就达到 3 亿元 10。 高比 率 、 高额度 研 发投入的直接效 果是产品换代周期缩短 ， 创新产品上市加快 ， 同时也催生了一批有较强国际竞争力的 名 优企业和一批有自主知识产权的核心产品 ， 如迈瑞的病人监护仪 、 汕头 B 超 、 万东 的中型 X 射线诊断机、苏州医疗的裂隙灯显微镜、长峰呼吸麻醉机。 但是我国医疗器械产业从总体上来说与美日等国外发达国家相比还有很大差距。中国医疗器械总产值仅占世 界的 2%左右 ， 而美国占 42%左右 。 不仅表现在总体规模， 在医疗器械核心技术、重大装备研究和发明专利数量方面，我国也有较大差距。大部分企业仍然在创新和研发方面存在着种种问题 ， 企业总体竞争力依然缺乏 ， 大型企业 占全部医疗器械生产企业的比例远远低于发达国家平均水平 。 国内医疗器械生产企业 12000 余家，但年营业额超过 1 亿元的仅 35 11。 和药品行业相同的是，医疗器械行业也是高投入、高增长、高回报的产业。然而摆在众多医疗器械厂家的第一道难题便是高投入 ， 以美国为例 ， 美国产品开发平均投 资占销售的 其中化学工业为 航空航天为 计算机为 而医疗器械高达 12。 相当多的企业存在畏难情绪和急功近利的想法，放弃了新产品的开发，另有许多企业未及见到高增长和高回报的光明大道 ， 便倒在了高投入的路上 。 因此我国的医疗 器械生产企业在开发产品的过程中更迫切需要引入先进的管理思想 、 方法 ， 保障和提 高产品的质量 ， 确保产品安全有效 。 为切实高效使用有限的研发经费 ， 提高研发质量， 本文引入 则指导新产品的研发。 7 着科学技术的飞速发展，检验医学的医疗器械发展 出现两极分化：一方面是各类大型自动化 、 高效率仪器设备的相继问世 ， 模块式的组合和流水线式 的 “ 大大提高了临床实验室的工作效率；另一方面是实验仪器小型化、操作简便化、结果 报告及时化、准确化，越来越受到临床医护人员、病人及其家属的青睐。 1995 年，在加利福尼亚召开的 国临床化学协会）年会展览会上辟出一个特殊的展区 ， 专门展示一些可以快捷移动 、 操作简便 、 结果准确可靠的技术与设备， 这些新颖的技术和设备带给所有参观者以崭新的概念。 品即契合了上述特点的检验设备。 美国国家临床 生化科学院（ 义为“在接近受试者处 ， 由未接受临床实验室科学训练的人员或受试者笔者进行的实验检验 ； 它 是在传统的中心实验室以外进行的一切检验” 13。 随着免疫反应和分子生物技术的引进， 使用更为便捷，检测和应用的范围更为广泛 。 从最初的检测血糖 、 妊娠 ， 扩展到监测血凝状态 、 心肌损伤 、 酸碱平衡、 感染性疾病和治疗药物浓度监测（ ；使用的场所，从事故现场、家庭，延伸到了病房、门诊、急诊、监护室、手术室甚至海关、社区保健站、私人诊所；应 用的领域也已经从临床扩展到食品卫生、环境检测、禁毒、法医。 真正含义即： 不仅是专业的医护人员 ， 经过简单培训的病人及其家属也能独立完成并能获得有助于 临床诊断的信息的移动检验系统。 据报道， 2007 年 全球销售额约 113 亿美元，占到全球检验市场份额的34%，并以每年 11%的速度增长 14我国的市场规模大约为 12 亿美元，年增长速度约 15国内仅血糖仪一项产品就有数十个品牌，其市场前景可见一斑。由于技术与原材料等方面的原因 ， 我国 业发展总体上远远落后于发达国家 。 目前 ， 注册企业数量少 ， 品种也主要集中在 “尿十项 ” 、 “尿八项 ” 、 血糖等常规检测 项目上 。 2004 年我国自产 品销售额约 9 亿元人民币，其中“尿十项 ” 、血糖 等5 个品种的销售额约 8 亿元人民币 ， 占 89%16。 由于缺乏自主知识产权的独创技术， 再加上市场开发不充分，我国居家健康自检产品十分落后，目前仅血糖、骨健康、微 营养评价等的十余个品种在市。 8 测仪器满足了临床医护人员 、 病人及其家属对仪器小型化 、 操作简便化、 结果报告及时化 、 准确化的需求 。 精 髓 之一就是指导生产企业在 设计阶段就考 虑产品质量和顾客需要，因此希望利用 则指导 器的研究开发，在满足顾客需求甚至超越顾客需求方面做出更多努力。 析式胆固醇自测仪的研究背景 随着人们生活水平的不断提高，高脂血症发病率也不断增加。高脂血症是动脉粥样硬化的主要发病因素 。 临床证实经降脂治疗能使心血管疾病死亡率下降 13%。 为更 好尽早进行调脂治疗 ， 降低动脉粥样硬化的发生率 ， 血脂的早期诊断和监测具有重要 意义。总胆固醇（简称胆固醇， 血脂中的主要成分之一，因此总胆固醇含量成为重要的监测对象 ， 例如使用脂质调 节药他汀类药物 就要求定时检查胆固醇 总量，以确保治疗的安全、连续、有效。 长期以来，临床上一直采用实验室的大型自动生化分析仪来检测血液中胆固醇的含量，由于经常去医院检测非常不方便，而人们又需要经常监测胆固醇的含量，因此满足 求的操作简单 、 测量值精度满足监测需求 、 体积小的胆固醇快速检测仪 应运而生。 近年 7和 8等公司生产出电子式总胆固醇 专用监测仪，需配合使用一次性测试条，在测试条的加样区滴加一滴指尖血， 几分钟 后仪器的屏幕上给出胆固醇总量的检测数值 。 这类仪器使用比较方便 ， 类似于普遍推 广的血糖仪，此类产品虽然具有快速、便携、用血量小的特点，但其仪器价格高昂、 试纸使用成本高 ， 使用前需要校正 ， 且存在血液污染的危险 。 美国 9和 0两家公司提供一次性非电子式胆固醇测试盒。在测试时需要一或两滴血样，大约 15 分钟后，通过读数卡的比对即可读出总胆固醇含量的数值。 国内有关总胆固醇检测仪器或血清总胆固醇的测定方法（包括酶法和比色法等）方面的研究报道非常少 。 国内尚 未见用于 一次性非电子式胆固醇测试盒或装 置。 究内容 在医疗器械行业 ， 为确保医疗器械的安全有效 ， 国际标准化组织 疗 9 器械质量管理和通用要求技术委员会 )制定了关于医疗器械行业管理标准 医疗器械质量体系 用于法规的要求 21。 目前在世界范围内广泛使用的是经过修 订的 2003 版，我国已将该标准等同转化为医药行业标准 0287 标准。 003 医疗器械质量管理体系可作为企业进行医疗器械的设计和开发 、 生产 、 安装和服 务，以及相 关服务的设计、开发和提供的标准，同时也可用于内部和外部 (包括认证 机构 )评定组织满足顾客和法规要求的能力。 准的颁布和贯彻实施对规范医疗器械生产企业的质量管理 ， 提升医疗器械生产企业的管理素质 、 技术素质和整体 实力，促进行业发展起到巨大的推动作用。 准在世 界 范围内受到广泛认同 ， 通过此标准的认证表示产品可以得到 医疗工作者和最终用户的信任。欧盟、加拿大、亚洲等众多国家或者正式要求出具符合 准的证明，或者在进口许可程序中非正式地要求遵循 准。美国质量 体系标准 即 1996 年颁发的 21在导言中述及 准和它基本一致 22。 现在广泛推广的 准并不矛盾。从法规的要求看， “保持其有效性 ” ，是医疗器械产品准入市场的基本要求。 前仅属于指导性原则，非强制性标准。从内容看， 对 准内容的加深。 准更侧重流程管理，需对每个规定流程的动作进行确认和控制 。 强调如何 实 现产品质量和工艺的可控 ， 那就是从产品研发阶段就考虑顾客 的需要，从设计输入开始就通过设计把质量筑进产品中。 在满足法规要求使用 准对医疗器械开发进行管理的基础上，为追求产品卓越和最大程度满足顾客的要求 ， 因此考虑借鉴发展较为成熟的药品行业的管理 方法，前瞻性地尝试将 用在 疗器械研发管理中，提高新产品的研发质量和效率。笔者所在企业刚跨入医疗器械行业，开发 第一个产品，对产品也仅有模糊的定 位 （快速 、 便携 、 用血量小 、 价廉 ） ， 尝试探索 导原则在全新 的领域内 ， 全新的产品上 ， 对研发不同阶段及各个环节设计空间的指导作用 。 现在广泛推广的 准并不矛盾，而是加深。 准中对医疗器械的设计开发做了详细要求，从设计的多个环节进行管理，这种管理强调过程控制，产品质量和工艺控制的可控性 。 强调了如 何 实现产品质量和工艺的可控 ， 那就是从 10 产品研发阶段就考虑顾客的需要 ， 从设计输入开始就通过设计把质量筑进产品中 。 产 品质量管理应该从产品设计开始 ， 而不是从原料药采购 ， 这是对原来产品质量管理认 识的革命性提高。 满足了 准的要求只能认为是满足了法规和市场准入的基本要求，对于追求产品卓越和最大程 度满足顾客的要求 ， 企业要对自己提出更高的要求 。 因此考 虑借鉴发展较为成熟的药品行业的管理方法，前瞻性地尝试将 用在 疗器械研发管理中，提高新产品的研发质量和效率。 笔者所在企业刚跨入医疗器械行业，开发 第一个产品，对产品也仅有模 糊的定 位 （快速 、 便携 、 用血量小 、 价廉 ） ， 尝试探索 导原 则 在全新的领域内， 全新的产品上，对研发不同阶段及各个环节设计空间的指导作用。 究意义 本文探讨了 疗器械研发管理中的实证研究，是对 医药行业研发管理方法的初步探索 ， 是现代管理理论与医疗器械研发实践相结合的产物 。 借 鉴了在其他行业应用成熟的 则来指导医疗器械研发实践，对作者所在企业以 及医疗器械行业研发管理具有一定的指导意义。 论文的研究方法 本文在对 导 原 则的研究文献进行综合分析的基础上 ， 通过 在 北京大学学习 期间对国内外制药企业利用 则指导新产品开发的实际运作状况的考察和学习， 总结自身从事新产品开发管理和海内外市场营销管理工作的经验 ， 基 于医疗器械新产 品开发项目技术性和经济性评价的特点 ， 运用 验设计 ） 、 险评估 ） 和 程分析技术 ） 、 项目评价方法 、 逻辑分析方法等定性或定量方法进行新产品设 计开发。本文既包括对 导医疗器械研发管理的研究分析，也包括研发实践的 经验总结。 11 第二章 层析式总胆固醇自测仪的设计 本文将 指导 原 则与医疗器械产品的一般开发原则有机结合 ， 并合理运用到 产品的设计开发中。运用 则指导产品的设计开发，有利于从宏观上把握产品的开发方向及开发内容，从而使产品的每一个模块处于合理的控制中。在导原则下，层析式总胆固醇自测仪的设计包括检测原理设计和仪器设计两大部分 ， 同时每 一部分又可进一步划分 。 在项目启动时 ， 以鱼骨图为例对产品的设计和 开发过程进行概括，如下图所示： 人员 系统选材 检测模拟 成品验证 原材料 设备 胆固醇 动物血清 人血清 人全血 过滤系统 稳定性 测仪 方法筛选 定量方法 酶系统 显色系统 性能测试 原理设计 仪器设计 成品测试 图 2品设计和开发的鱼骨图 测原理设计 胆固醇定量分析方法概述 法测定总胆固醇 人体中 2/3 胆固醇 以酯的形式存在， 1/3 以游离的形式存在，所以测定胆固醇的第 一步是 使 胆固醇酯在胆固醇酯化酶 (作用下释放出游离的胆固醇 ， 这样才能测出 总的胆固醇含量。游离的胆固醇在胆固醇氧化酶（ 作用下生成过氧化氢，生 成的过氧化氢在过氧化氢酶 (作用下跟显色剂反应生成有色物质，根据有色物 质在特定波长的吸光度，计算血清中总胆固醇的浓度 23，其反应过程用反应式见图 2中应用最广的是用 色反应系统，试剂含过氧化物酶（ 4替比林 (4酚，三者合称 前国内胆 固醇试剂盒广泛采用这种方法。 12 4 2法测定总胆固醇原理 效液相色谱法测定总胆固醇 血清样品用氢氧化钾醇溶液 皂化，将其中的胆固醇提取到正己烷中并衍生为苯甲酸酯 ， 以高效液相色谱仪测定胆固醇的峰面积 。 由于不同浓度的标准或样品的内标量 相等 ， 故胆固醇色谱峰面积与内标峰面积的比随胆固醇浓度的增高而增高 ， 将样品的 峰面积比与标准的峰面积比比较即得到样品胆固醇浓度。由于使用了有效的色谱分离，能有效地消除血清中其它甾醇的干扰 24。 图 2定总胆固醇原理 25 13 学显色法测定总胆固醇 1） 高铁 以丙醇沉淀血清蛋白质 ， 提取上清 液 中的胆固醇 ， 再用氧化铝吸附胆红素 、 磷 脂、甘油等干扰物，离心后于上清液中加入高铁 应产物显紫红色，其显色程度与总胆固醇浓度成正比。 胆固醇酯与游离胆固醇在高铁反应显色程度一致，所以可以免去胆固醇酯水解反应，但不能省去抽提与吸附剂去除干扰物的过程 26。 2）邻苯二甲醛显色法 胆固醇及其酯在硫酸作用下与邻苯二甲醛产生紫红色物质 ， 此物质在 550长 处有最大吸收，可用比色法作总胆固醇的定量测定。胆固醇含量在 400mg/，与 呈良好线性关系。 本法不必离心，颜色产物也比较稳定，胆红素及一般溶血对结果影响不 大，严重 溶血者才使结果偏高 。 本法在 20 37条件下显色 ， 显色后 5 分 钟开始至半小时以 上颜色基本稳定。温度过低，显色剂强度减弱；加混合酸后振摇过激能使产热过高， 也可使显色减弱 27。 量分析方法选择 血清胆固醇 ( 定方法种类繁多 ， 化学方法大都用有机溶剂提取血清中的 用特殊试剂 显 色 ， 然后比色测定 。 主要显色反应有 反应及高铁 些方法须用腐蚀性的浓酸试剂，特异性差，干扰因 素多 ， 准确测定 有 赖于从血清中提取胆 固醇 ， 并对抽提液进行纯化 。 因此操作步骤多， 不适于常规应用 。 美国疾病控制中心 (类测定标准化实验室所审定的 ， 由于抽提液中基本上不存在 应的干扰 物 ， 结果准确 ， 为目前 国 际上通用的参考 方法。此法虽然不很复杂，但也不易准确掌握。现在还有少数实验室应用 LB 试剂直接显色法、邻苯二甲醛法等，准确性差，已在淘汰之列 23。 高效液相色谱法测定总胆固醇是中华医学会检验学会血脂测定推荐方法 血清总胆固醇测定参考方法，但由于样品的前处理复杂、且需要大型仪器，不适合用于开发。 酶法测定 总胆固醇是中华医学会检验学会血脂测定推荐方法 血清总胆固醇测 14 定推荐方法，血清样本不需要前处理、酶反应的高效性、检测产物为过氧化氢，这都有利用 品的设计和开发。因此，总胆固醇自测仪采用酶法进行设计和开发。 器设计 器原理设计 总胆固醇自测仪应当可以把全血处理后得到血浆。血浆中胆固醇酯经过胆固醇酯酶 反应后游离出胆固醇 ， 游离胆固醇在胆固醇氧化酶作用下产生过氧化氢 ； 过氧化氢 应 该 与显色系统产生显色反应 ， 而且产生一定高度的显色色带 。 显色高度 总胆固 醇浓 度 之间应有一定的数量 关系 ， 从而检测出总胆固醇的浓度 ， 而 且 能达到一定准确 度和精密度。 测系统设计 总胆固醇自测仪应当至少包括三个部分：血液过滤系统、反应系统、载体容器。这三个部分即独立又紧密结合 ， 每个部分的功能必须完全实现 ， 才能保证总胆固醇自 测仪设定功能的实施。 滤系统设计 过滤系统的主要功能是将从血液中分离出血浆，去除血细胞等物质对检测的潜在干扰。根据滴加血液体积的多少，可以尝试不同结构的过滤系统。图 2示是血液体积较小时的结构，一般适合 20L 以下；图 2示是血液体积较大时的结构 ，一般适合 20L60L。当实验需要大量进行血液过滤系统时，在批量生产之前，可以按图 2激光快速成型或 板制作少量的血液过滤板，以提高实验效率和尽量保证过滤系统的一致性。 图 2滤系统 A 15 图 2滤系统 B 图 2滤系统 C 应系统设计 反应系统的功能主要是使血浆与酶进行反应产生过氧化氢 ， 同时使过氧化氢被捕 捉，而与显色剂进行显色反应，并且使显色的高度与总胆固醇的浓度有数量关系。为实现以上功能，反应系统应当至少包括样品接收区、反应控制 区、显色系统 3 部分。样品接收区和反应控制区可能含有酶 ， 显色区含有显色剂 。 当血浆的体积不足以虹吸 满所有试纸时 ， 还需要增加一个溶液区或者以外加的方式补充溶液 。 结合以上功能的 描述和现有的诊断材料 ， 产品选择用层析的方式实现 。 反应系统的形式 如 图 2示。 体容器设计 16 载体容器的功能是容纳过滤系统和反应系统 ， 为它们提供支撑载体 ， 同时需要进 行结构设计，解决两个系统的结合问题。载体容器的实现形式如图 2示。 图 2应系统示意图 图 2体容器示意图 测系统选材 过滤系统、样品吸收区、反应控制区、显色系统的功能是否能实现还决定于材料的选择 。 近年纸诊断的技术得到了广泛的应用 ， 利用这些技术所开发 的 层析诊断产品 能做到高灵敏、重复性好和经济化生产，适合在很大范围领域内