三蛋白质含量测定.docVIP

实验三 奶粉中蛋白质含量的测定1.1实验目的要求： 1、掌握样品处理方法2、掌握凯氏定氮法2.1 蛋白质含量测定蛋白质是生命的物质基础，是人体重要的营养物质，因而也是食品中重要的营养指标。测定食品中蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。测定蛋白质最常用的方法为凯氏定氮法。此法是通过测定出样品中的总氮含量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的。经过人们长期的应用和不断改进，凯氏定氮法已演变成常量法、微量法、半微量法、改良凯氏法及自动定氮法等，具有应用范围广、灵敏度高、回收率好及不需要昂贵仪器等优点。但凯氏定氮法操作较费时（除自动凯氏定氮法外），单消化过程一般系要23h，如果遇到高脂肪、高蛋白样品消化需要5h以上；而且，在操作过程中会产生大量有害气体。因此，为了满足生产单位对工艺过程快速控制分析，减少环境污染和操作简便省时，后来再凯氏定氮法的基础上又陆续出现了水杨酸比色法、双缩脲法、福林-酚比色法、染料结合法、紫外分光光度法、折光法旋光法及近红外线光谱法等蛋白质快速测定法。本节重点介绍凯氏定氮法和水杨酸比色法两种方法，要求掌握这两种方法的测定原理和操作技术。2.1.1 凯氏常量定氮法 （1）原理 样品与硫酸和催化剂一同加热后消化，使蛋白质分解，其中的碳和氢分别被氧化成二氧化碳和水逸出，而有机氮转化成氨后与硫酸结合生产硫酸铵，然后在碱性条件下蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再用硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即得蛋白质含量。以甘氨酸为例，该过程的反应方程式如下。 消化：NH2CH2COOH+3H2SO4 2CO3+3SO2+4H2O+NH3 2NH3+H2SO4 (NH4)2SO4蒸馏：（NH4）2SO4+2NAOH 2H2O+NA2SO4+2NH3 吸收：NH3+4H3BO4 NH4HB4O7+5H2O 滴定：NH4HB4O7+HCL+5H2O NH4CL+4H3BO3在消化过程中，为了加速蛋白质分解，缩短消化时间，常加入硫酸钾、硫酸铜等物质。加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物分解，因为它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度。但其加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。硫酸铜除起催化作用外，还可作消化终点和下一步蒸馏时碱性反应的指示剂。（2）适用范围 凯氏定氮法适用于各类食品中的蛋白质测定，最低检出量为0.05mg氮，相当于0.3mg蛋白质。由于样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故本法测出的结果为粗蛋白质含量。（3）药品1浓硫酸2硫酸铜3硫酸钾4 40%氢氧化钠溶液5 4%硼酸吸收液：称取20g硼酸溶解于500ml热水中，摇匀备用。6甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：5份0.2%溴甲酚绿95%乙醇溶液与1份0.2%甲基红乙醇溶液混合均匀。7 0.1mol/L盐酸标准溶液（4）主要仪器1 500ml凯氏烧瓶，2定氮蒸馏装置（5）操作方法1样品处理：准确称取固体样品0.22或半固体样品25g，或吸取液体样品1020ml，小心移入干燥洁净的500ml凯氏烧瓶中，然后加入研细的硫酸铜0.5g、硫酸钾10g和浓硫酸20ml，轻轻摇匀后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至液体至蓝绿色且澄清透明后，再继续极热30min。冷却，小心加入200ml蒸馏水，待冷却后，加入数粒玻璃珠以防蒸馏时暴沸。2碱化蒸馏：将凯氏瓶按图蒸馏装置方式连接好，塞紧瓶口，冷凝管下端插入吸收瓶液面下，吸收瓶内预先装入了50ml%4硼酸溶液及混合只指示剂23滴。放松小漏斗处的夹子，通过漏斗徐徐加入7080ml40%氢氧化钠溶液，当漏斗中尚有少量氢氧化钠溶液时，夹紧夹子，在漏斗中加入约5ml的蒸馏水，松开夹子使水流入烧瓶中，注意留少量水在漏斗中作水封，夹紧夹子。加热蒸馏，至氨全部蒸出（馏液约250ml），将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏1min，用表面皿接几滴馏出液，以奈氏试纸检查，如无红棕色物生成，表示蒸馏完毕，即可停止加热。 3滴定：将上述吸收液0.1mol/L盐酸标准溶液滴定至由蓝色变为微红色即为终点，记录盐酸溶液用量。同时做一空白试验（除不加样品外，从消化开始操作完全相同），记录空白实验消耗标准盐酸溶液体积。（6）计算蛋白质含量=【Cx（V1V0）x M氮 / m x 1000】 x F x100%式中：c为盐酸标准溶液的浓度，mol/L：V1为滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，ml：V0为滴定空白吸收液时消耗盐酸时消耗标准溶液体积，ml：m为样品质量，g：M氮为氮的摩尔质量，14g/mol：F为氮换算为蛋白质的系数（蛋白质中的氮含量一般为15%17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质含量。不同食物中蛋白质换算系数不同。乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米为5.83，芝麻、向日葵为5.30）。（7）说明及注意事项 1所有的试剂溶液应用不含氮的蒸馏水配制。 2将样品加入凯氏烧瓶中时，应注意勿使样品沾于烧瓶颈部放置液体样品时，需将吸管插至瓶底部再放样品；如是固体样品，可将样品卷在纸内，平插入烧瓶底部，然后再将烧瓶竖起，卷纸内的样品即完全放在烧瓶底部。 3消化时由于会放出SO2,，因此需将烧瓶放置在通风橱内或通风处进行消化，或在消化架上进行。消化时不要用强火，应保持和缓微沸，以免粘附在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在方的情况下未消化完全而造成氮损失。 4消化过程中应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。 5样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在消化开始时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。 6当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢23ml再继续加热消化。 7若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5ml的比例增加硫酸用量。 8一般消化至透明后，继续消化30min即可，但对于特别难以氨化的氮化合物样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁较多时，呈较深绿色。 9蒸馏时加入氢氧化钠溶液必须小心轻加，而且蒸馏装置不能漏气。 10蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。 11硼酸吸收液的温度不应超过40度，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。另外，冷凝管下端不能插入硼酸液面太深，一般约为0.5cm。这样万一发生倒吸现象时，硼酸液不致吸入反应室内。 12蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1min后关掉热源，否则可能导致吸收液倒吸。 13混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。 14一般样品中尚含其他含氮物质，测出的蛋白质为粗蛋白。若要测定样品的蛋白氮，则需向样品中加入三氯乙酸溶液，使其最终浓度为5%，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，进一步一计算出蛋白质含量：蛋白氮=总氮-非蛋白氮,蛋白质含量=蛋白氮x F x 100% 。2.1.2 凯氏微量定氮法 （1）试剂 同常量法，其中硼酸溶液为2%。 （2）仪器 1.100ml凯氏烧瓶。 2微量凯氏蒸馏装置，如图5-2所示。图5-2 微量凯氏蒸馏装置示意图1.热源 2. 烧瓶 3. 玻璃管 4. 橡皮管5玻璃杯 6. 棒状玻塞 7. 反应室 8. 反应室外壳 9. 夹子 10. 反应室中插管 11. 冷凝管 12. 锥形瓶 13. 石棉网 （3）操作方法 1样品处理：样品消化步骤常量法。样品消化完冷却后，完全转入100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀。 2碱化蒸馏： a.蒸馏装置的安装：微量凯氏测氮的氨蒸馏装置有几种不同的结构类型，但它们的原理相同。此处采用如图5-2所示的蒸馏装置。按图装好定氮蒸馏装置，并检查各接头处是否漏气。在水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加数毫升硫酸及甲基红指示剂，以保持水呈酸性，并加入数粒沸石以防暴沸。 b.蒸馏装置的洗涤：蒸馏装置在使用前需用蒸汽洗涤，目的在于洗去冷凝管中可能残留的氨。对于处于使用状态的仪器，在将反应室中废液排除并用蒸馏水洗涤数次除去反应室中的洗涤废液后，用蒸汽冲洗12min即可加样。对于较长时间未使用的仪器，必须先用蒸汽冲洗10min左右，然后将一支盛有硼酸液和指示剂的锥形瓶置冷凝管下端，并使冷凝管的管口插入酸液内，继续蒸馏1-2min，如硼酸溶液颜色不变，表示仪器洗净，否则需再洗。移去锥形瓶，蒸馏1min，用水冲洗冷凝管口。移开火焰，准备样品测定。 C.蒸馏：打开蒸汽发生器上面的的夹子3和反应室下端的夹子9，夹紧水蒸气发生器和反应室之间的夹子5，在接受瓶内加入10ml2%硼酸溶液和23滴混合指示剂，置于冷凝管下端并使其插入液面下。提起棒状玻塞6，吸取10ml消化稀释液由小玻杯4加入反应室内，塞上玻塞，然后在小波杯中加入10ml40%氢氧化钠溶液，轻轻旋转并向上提起玻塞，使氢氧化钠溶液慢慢流入反应室中，另一半留在玻杯中作水封。打开夹子5，关闭夹子3和9，开始蒸馏。蒸馏至吸收液中所加的混和指示剂变为绿色时，再继续蒸馏5min后，将冷凝管下端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管下端，取下接受瓶。将反应室中废液排除洗净，再用水蒸气冲洗12min，准备下一次蒸馏。 d.滴定：用常量法。 （4）计算 蛋白质含量=【Cx(V1-V0)xM氮xFx100% /m x 1000x10】x F x 100% 式中各符号意义与常量法相同，其中10是指测定时呼吸消化液的毫升数。 （5）说明及注意事项 1水蒸气发生器内的水应保持酸性，这样可避免水中的氨被蒸出而影响测定结果。为此，在发生器内的水加入数毫升硫酸及甲基红指示剂，水应成橙红色。 2定氮仪各连接处不能漏气。 3可用橡皮管、塞需经处理。方法是：浸在10%NAOH溶液中煮约10min，水洗，水煮10min，再水洗数次。 4在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断汽，否则将发生倒吸。 5废液排除及洗涤：一次蒸馏结束后，在小玻璃杯中倒入冷蒸馏水，并加大煤气灯火焰，待蒸汽很足，反应室外壳7温度很高，反应室中液体沸腾，连续不断冒泡后，用右手轻提棒状玻塞，使冷水流入反应室的同时，立即左手用劲捏橡皮管5，这时因反应室外壳8中的蒸汽比反应室7中的多，遇到收缩较大，压力降低较多，结果反应室7中废液通过反应室插管10自动被抽到反应室外壳中。塞住玻塞，去蒸馏水约20ml，加入小玻杯，冷水再流入反应室，又自动抽出，如此反复几次即可排尽反应废液及洗涤废液。若外壳中已有较多的废液，可在反应室外壳蒸热后，右手捏夹子9，放出一些废液，左手立即捏一下橡皮5，积存废液即从反应室中排出，这样左右交替几次，也可排除反应室内的液体。如此冲洗3或4次，打开夹子9，排斥反应室外壳中积存的废液，关闭夹子9，再用蒸汽冲洗数分钟，继续下一次蒸馏。 6其他注意事项同常量法。2.1.3 水杨酸比色法（1） 原理： 样品中的蛋白质经硫酸消化转化为铵盐溶液后，在一定的酸度和温度下可与水扬酸钠和次氯酸钠溶液作用生成有颜色的化合物，可以在波长660nm处比色测定，所求出的含氮量，换算成蛋白质含量。（2）试剂1氯标准溶液：称取经110干燥2h的硫酸铵0.4719g，用水溶解后定容至100ml，此溶液含氮量为1.0mg/ml。使用时用水配制成含氮量为2.50ug/ml的标准溶液。 2空白酸溶液：称0.50g蔗糖，加15ml浓硫酸和5g催化剂（一份硫酸铜溶液和9份无水硫酸钾研匀而成），与样品一起处理消化后定容至250ml。使用时吸收10ml定容至100ml，作为介质溶液。 3磷酸盐缓冲液：称7.1g磷酸氢二钠、38g磷酸三钠和20g酒石酸钾钠，加400ml水溶解过滤；另称35gNaOH溶于100ml水中，再与磷酸盐溶液混合，最后加入水稀释至1000ml备用。4水扬酸钠溶液：称25g水杨酸钠和0.15g亚硝基铁氰化钠，溶于200ml水中，过滤，加水至500ml 5次氯酸钠溶液：吸4ml次氯酸钠，加水至100ml（3） 仪器 1分光光度计。2恒温水浴锅。（4）操作方法1样品处理：称取0.2001.000g样品，置于凯氏烧瓶中，加15ml浓硫酸和5g催化剂，如同常量凯氏定氮法对样品进行消化，最后定容至250ml。2标准曲线的绘制：准确吸取含氮量为2.50ug/ml标准溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，分别置于25ml容量瓶或比色管中，各加入2ml空白酸=5ml磷酸盐缓冲液，并分别加水至15ml，再加入5ml水杨酸钠溶液，至于3637C的恒温水浴中加热15min后，逐瓶加入2.5ml次氯酸钠溶液，摇匀后再恒温加热15min，取出加水至标线，在660nm处测各标准溶液的吸光度并绘制标准曲线。3样品测定：准确吸取上述消化溶液10ml（如取5ml则要加5ml空白酸溶液）定容至100ml，吸取2ml置于25ml容量瓶或比色管中，加入5ml磷酸缓冲液，以下操作按标准曲线绘制的步骤进行，并以试剂空白为对照测定样品的吸光度，从标准曲线查出其含氮量。 （5） 计算