我做PCR一年的总结.doc

今天到PCR技术讨论版逛逛，看到pgming2004的精华原创贴，下载附件后读了一遍佩服楼主善于总结的同时也想补充一点个人不同的看法。RNA 抽提（RNA Extraction）原文：三，抽提步骤1 匀浆化作用取约100mg鼠脑组织放于玻璃研磨器内，先加0.2ml的Trizol溶液，研磨组织后，倒入1.5mlEP管中，再在研磨器内加入0.8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。颠倒混匀10下，室温静置5分钟。2 分离阶段每1mlTrizol中加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，使其充分混匀，室温静置5分钟。后12000rmp离心15分钟。3 RNA的沉淀将上层水相转入新的1.5mlEP管中（约400-500ul），加入0.5ml异丙醇，混匀后放于-20中1小时，后12000rmp离心10分钟。4 RNA的洗脱小心倒掉上清，留取沉淀。加1ml现配的75%的乙醇（预冷）振荡洗涤RNA沉淀一次，后7500rmp离心5分钟。5 RNA的再溶解小心倒掉上清，取沉淀置超净工作台开风机吹干（约30分钟，此时RNA沉淀变透明）。注意不能让RNA沉淀完全干燥（会极大地降低它地可溶性）。再在管中加20ul的DEPC水溶解，在55-60下孵育10分钟助溶。6，RNA的保存提取的RNA保存于-70超低温冰箱中，或立即用于逆转录。抽提步骤中1.匀浆化，我一般将组织直接放入1ml Trizol后打碎组织，分装到EP管2.分离，个人认为人手用力摇晃和用 机器最大速度vortex效果差不多，但是人手摇晃有点辛苦，特别是RNA含量少的组织（例如人椎间盘组织），抽提需要大量组织次数也会随之增加（常为15-20次）这是机器vortex的优势便显示出来。3.RNA沉淀，经过许多次抽提RNA，我总结加入异丙醇后可以将盛有样品的EP管置于-20C 冰箱过夜，这样可以大大提高RNA析出的效率。4.RNA洗脱，倒掉EP管中上清后直接加入新配制80%酒精（是否预冷不是十分重要，但是也不要加热酒精），随即倒出酒精再重复上述操作2次。倒入酒精清洗RNA沉淀时可不进行振荡，个人认为振荡离心可能丢失少许RNA。5.RNA再溶解，一定要控干多余酒精，这一步很重要，因为抽提产物中如果有酒精可能会影响你接下来的RT-PCR, Real-Time PCR等操作。逆转录（reverse transcription）原文三，RT步骤用SS逆转录酶进行RT（20ul体积）1， 准备0.65ml的EP管2， 冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暂离心。3， 65水浴5分钟后，立刻0冰水浴至少1分钟。4， 短暂离心后，冰上操作：加入4ul 5First-Strand Buffer，1ul 0.1MDTT，1ul RNAse Inhibitor，1ul SS逆转录酶。5， 短暂离心6， 50水浴60分钟进行逆转录。7， 70水浴15分钟灭活逆转录酶8， -20保存，或立即进行PCR。用AMV逆转录酶进行RT（10ul体积）1， 准备0.65mlEP管2， 加入4.5ul DEPC水，1ul引物，1ul模板RNA3， 稍离心，100沸水裕1min4， 加入0.5uldNTP，2ul 5Buffer，1ul AMV逆转录酶5， 稍离心，封口膜封口，42水浴90作RT6， 100沸水裕3min灭活RT步骤1.首先检测RNA样品的浓度，并稀释至10ng/ul以供RT-PCR（RT-PCR需要100ngRNA，10ulX10ng/ul）2. 10X RT Buffer 2ul25XdNTP mix 0.8ul10X RT Random Primer or Oligo DT 2ulMultiscripe Reverse Tanscriptase 1ulRNAse Inhibitor 1ulDEPC水 3.2ulRNA 样品 10ul3.循环为 25C 10分钟， 37C 120分钟， 85C 5秒。聚合酶链反应（PCR）原文四，PCR步骤1， 准备100ul EP管2， 依次在管中加入：（50ul反应体系）ddH2O 37.5ul ？10mM dNTP 1ul ？10PCR buffer 5ul ？25mM Mgcl2 （加之前要摇匀） 3ul ？上游引物 1ul ？下游引物 1ul ？模板cDNA 1ul3， 稍离心4， 100沸水浴1分钟5， 趁热加入Tag酶0.5ul（冰上操作）6， 再加入50ul液体石蜡封闭7， 10000rmp离心1分钟8， PCR条件94 1min58 50sec72 1min30sec进行40个循环，然后72 10min 完后4保温。9，10000rmp离心5min10，将下层水相转入新的0.65mlEP管中，-20保存。PCR1.PCR反应需要 10-100ng DNA模板，50mM dNTP 0.5ul, Taq酶0.25-0.5ul足够，引物我常将其稀释成0.1ug/ul后再向50ul反应体积中加1ul即可。2. ddH2O 39ul10mM dNTP 2.5ulPrimers 1ul each10X PCR Buffer 5ulTaq Enzyme 0.5ulDNA Template 1ul3.PCR的条件，我一般使用94C 45秒55C 45秒72C 1分钟/1Kb循环30次左右当然万一做不出来，参考引物的Tm再调节温度。电泳鉴定原文3, 试剂配制和准备：(1) 电泳缓冲液（TAE）：先配制0.5mol/L,PH8.0的EDTA溶液：将37.2g EDTA-Na加入160ml蒸馏水中，在搅拌器上剧烈搅拌。在用NaOH调节溶液PH值至8.0（约需4gNaOH）。用蒸馏水定容至200ml。后送至高压灭菌。室温保存。再配制50TAE溶液：在400ml蒸馏水中溶解121g Tris碱，加入28.55ml冰乙酸和50ml 0.5ml/L EDTA溶液，再加蒸馏水定容至500ml，室温保存。（2）琼脂糖溶液（1.0）：50TAE溶液取10ml，稀释成500ml，取50ml溶解0.5g琼脂糖，电炉上煮至沸腾，溶化的琼脂物冷却至60左右时加入10mg/ml EB 5ul，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中，在室温下放置45min左右后进行电泳。（3）溴化乙锭（EB）（10mg/ml）：在20ml水中加入0.2g溴化乙锭，磁力搅拌数小时。然后用铝箔包裹容器或将溶液转移至棕色瓶中，室温保存。（4）加样缓冲液（Loading Buffer）一般为6Loading Buffer电泳鉴定1.针对大分子产物可以适当降低胶的浓度0.7%，0.8%都可以，产物分子小也可提高胶的浓度至1.2%，1.4%。2.对于EB，我首先将其稀释为1ug/ul，每100ml胶加入10ul 1ug/ul EB。3.关于电压，一般来说根据胶的长度确定，1cm 胶 - 10V 电压。 胶长度为8cm则设定电压为80V，但是电压要求我认为不是十分严格，我常用160V跑8cm胶，结果不受不同电压大小影响。以上