菠菜中提取叶绿素.doc

实验 菠菜色素的提取和色素分离（extraction of pigments from spinach and chromagraphic isolation）【实验目的】（1）通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；（2）通过薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理；（3）从菠菜中提取出叶绿素、胡萝卜素、叶黄素等色素并加以分离。【实验原理】色谱法利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。薄层色谱法是其中一种微量快速的分析分离方法。它具有灵敏、快速准确等优点。薄层色谱属于固-液吸附层析的类型。通常是把吸附剂放在玻璃板上成为一个薄层，作为固定相，以有机溶剂作为流动相。实验时，把要分离的混合物滴在薄层板的一端，用适当的溶剂展开。当溶剂流经吸附剂时，由于各物质被吸附的强弱不同，就以不同的速率随着溶剂移动。展开一定时间后，让溶剂停止流动，混合物中各组分就停留在薄层板上显示出一个个色斑的色谱图。若各组分无色，可喷洒一定的显色剂使之显色（如图）。混合物中各物质在薄板上随溶剂移动的相对距离称为比移值（Rf值）。如下图中： （a）原板 （b）已展开层析板图 薄层色谱装置图图 薄层色谱效果图在一定条件下，各物质具有一定的Rf值。不同物质在相同条件下，具有不同的Rf值。因此，可利用Rf值对物质进行定性鉴定。但物质的Rf值常因吸附剂的种类和活性、薄层的厚度、展开剂及温度等的不同而异。所以在鉴定样品时，常用已知成分作对照试验，在同一个薄层板上进行层析，然后通过Rf值的比较，对物质作定性鉴定。根据斑点的面积大小和颜色的深浅的标准物的对照下还可进行定量。化合物的吸附性与其极性成正比，化合物分子中含有极性较大的基团时吸附性也较强。展开剂（溶剂）的极性越大，则对化合物的洗脱力越大，则Rf越大（如果样品在溶剂中有一定的溶解度）。绿色植物如菠菜叶中含有叶绿素（绿）、胡萝卜素（橙）和叶黄素（黄）等多种天然色素。本实验从菠菜中提取上述几各色素，并通过薄层层析进行分离。 叶绿素存在两种结构相似的形式叶绿素a（C55H72O5N4Mg）以及叶绿素b（C55H70O6N4Mg），其差别仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。 胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即a-,-和-胡萝卜素，其中-异构体含量最多，也最重要。在生物体内，-体受酶催化氧化即形成维生素A。目前-胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色素。 叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。叶绿素a（R = CH3）叶绿素b（R = CHO） -胡萝卜素（R = H） 叶黄素（R = OH）维生素A【实验试剂】20g菠菜叶，20mL甲醇，40mL石油醚（6090）甲醇（3:2）溶液，硅胶G，0.5%羧甲基纤维素钠，无水硫酸钠，石油醚丙酮（8:2），石油醚乙酸乙酯（6:4）【实验步骤】1、薄层板的制备取四块显微载玻片，洗净晾干。在小烧杯中，放置3.0g硅胶，逐渐加入0.5%羧甲基纤维素钠水溶液67mL，调成均匀的糊状，其稀稠为在震动下可流动，倒在洁净的载玻片上，用食指和拇指拿住玻璃板，前后左右振摇、摆动，并不时转动方向，制成薄厚均匀、表面光洁平整、无气泡的薄层板，厚度为0.251.0mm。涂好后的硅胶G薄层板置于水平的玻璃板上，在室温下放置0.5h后（注意：室温放置必须使玻板干透，否则会出现断裂现象），放入烘箱中缓慢升温至110，恒温0.51h后取出，稍冷备用。2菠菜色素的提取 称取20g洗净用滤纸吸干的的新鲜（或冷冻）的菠菜叶，用剪刀剪碎并与20mL甲醇拌匀，在研钵中研磨约5min然后用布氏漏斗抽滤菠菜汁，弃去滤液。 将菠菜汁放回研钵，每次用20mL 3:2（体积比）的石油醚-甲醇混合液萃取两次，每次需加以研磨充分并且抽滤。注意：因石油醚易挥发，抽滤时先倒少许清液浸润滤纸，抽滤时真空度不要太大！合并滤液，用吸管取上层深绿色萃取液，转入分液漏斗，每次用10mL水洗涤两次，以除去萃取液中的甲醇。洗涤时要轻轻旋荡，以防止产生乳化。弃去水甲醇层，石油醚层用无水硫酸钠干燥30min后，滤入圆底烧瓶（勿将干燥剂滤入），在水浴上蒸去大部分石油醚至体积约为1mL为止。石油醚回收。 3、点样取活化后的层析板，分别在距一端1cm处用铅笔轻轻划一横线作为起始线。另一端距约1cm处也划一横线作为终止线。取毛细管（直径0.5mm）插入样品溶液中，在一块板的起点线上点两个点。样点间相距11.5cm。样点直径不应超过2mm。注意：点样时手指捏住毛细管下端，垂直点样，轻触薄层板后立即抬起。点样要轻，不可刺破薄层。因溶液太稀或样点太小，可重复点样。但应在前次点样的溶剂挥发后，方可重点，以防样点被溶解掉。薄层色谱中样品的用量对物质的分离效果有很大在影响，所需样品的量与显色剂的灵敏度、吸附剂的种类、薄层厚度均有关系。样品太少时，斑点不清楚，难以观察，但样品量太多时往往出现斑点太大，造成拖尾，扩散等现象，影响分离效果。 4、层析展开 薄层色谱展开剂的选择主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素。溶剂的极性越大，则对化合物的解吸能力越强，即Rf值也越大。如Rf值较大，可考虑换用一种极性较小的溶剂，或在原用展开剂中加入适量极性较小的溶剂。相反，如原用展开剂使样品各组分的Rf值较小，则可加入适量极性较大的溶剂，如氯仿中加入适量的乙醇。常用展开剂的极性大小如下：水乙醇乙酸乙酯 氯仿苯环己烷石油醚本次实验采用的以下展开剂：（a）石油醚-丙酮=8:2（体积比） 点三块板（b）石油醚-乙酸乙酯=6:4（体积比） 点一块板薄层色谱的展开，须在密闭容器中进行（如图5-11）。在容器中加入一定体积的展开剂，内壁贴一张高5cm，绕周长约4/5的滤纸（目的是为了使展开剂蒸汽在烧杯内迅速达到平衡），下部浸入展开剂中，盖好表面皿。点样后的薄层板小心放入预先加入选定展开剂的烧瓶