生化大实验感悟.doc

生化大实验感悟本次大实验题目为酵母蔗糖酶的提取、分离、纯化及鉴定。蔗糖酶又称转化酶，在六大蛋白酶类中属于水解酶类，作用于糖基，水解氧糖化合物，蔗糖在蔗糖酶催化下，水解成 D葡萄糖和D果糖两种还原糖。啤酒酵母中蔗糖酶繁含量丰富，该酶以两中形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧外酶、内酶。本实验提纯的主要是外酶。实验大体流程为蔗糖酶的提取（细胞壁裂解）蔗糖粗酶液分离（乙醇分级沉淀）蔗糖酶半纯化（透析）蔗糖酶纯化（离子交换层析）测定酶纯度（凝胶电泳）测定酶活性酶的定性定量分析。6月11日实验的第一天，主要工作是清洗器皿，配制药品及样品处理，在清洗器皿中应注意不能用洗衣粉，要用洗洁精，因为洗洁精中不含磷离子，不会造成污染，清洗至器皿内水不结珠即为干净；配制药品时要注意烧杯、容量瓶不能用作长期贮存，要用试剂瓶；试剂瓶上的标签要贴在容器上方1/3处，并注明溶液浓度、配制时间、配制人员；药品称量要选择适当的器材。清洗器皿是由本组全体组员一起完成的，相互协作，使器皿的洁净程度都达到了要求，药品配制时分工明确，有专人分别计算，称量，溶解，在全体组员努力下一次性完成全部所需溶液的配制。样品处理是由张晶、朱占柱负责，样品用甲苯在水浴锅中水浴溶解，处理过程应注意甲苯为易挥发的毒性液体，搅拌人员要戴口罩，保持通风。搅拌30min后，将样品密封后放入温箱中过夜保存。6月12日实验的第二天，上午主要工作是蔗糖酶粗提、半纯化及制作蛋白质与葡萄糖的标准曲线。首先由样品处理的两位组员将用甲苯处理的样品离心分离得到上层为细胞壁，中层为清夜，下层是沉淀的样品。用药匙将上层细胞壁取出不得有任何残留，吸取中层清夜，注意不要吸太干防止沉淀被吸走，然后弃去沉淀，留上清夜，再由闫冬杰、张平负责酶液的乙醇分级处理，以获得粗蔗糖酶，处理前要计量酶液体积加入适量乙醇使乙醇含量为35%左右，摇匀后调平，在冷冻离心机中离心处理，取上清弃沉淀，然后计量体积继续加入适量乙醇至乙醇含量79%左右，摇匀调平离心，弃上清取沉淀，用7mlPBS缓冲液溶解。上述处理过程一定要在低温下进行（冰浴），将溶液倒入透析袋中密封，放入在冷冻柜中的PBS缓冲液中进行透析，并且在每隔两小时换一次缓冲液，透析过夜。在制得粗酶液时靳晶、陈丽莉和张晶、赵凯月分别制作蛋白及葡萄糖标准曲线，要做到所有点处在同一直线为止，在她们的努力下各做了两次实验才得到符合要求的标准曲线。然而直到第二天才发现考马斯亮蓝溶液被污染，导致蛋白的标准曲线需要重新制作，在组员们不懈努力之下，我们及时纠正了错误，得到需要的标准曲线。下午我们的主要工作的装层析柱，由朱大宇、邓俊华、张运畅负责，装柱过程要保持柱子平衡，防止装柱不均匀，要用胶头滴管沿管壁恒速滴入纤维溶液，不要产生旗袍，同时控制好稀释的PBS缓冲液流速，不要过快，由于操作的失误致使我们的柱子装得太满，为后续的上样工作带来了困难，柱子装好够，调节PBS缓冲液流速，然后过夜平衡。6月13日是任务最繁重的一天，老师和部分同学的午饭都是在实验室吃的。主要工作的上样，对样品进行纯化。首先取出透析袋中的酶液，进行离心，取上清液即得到原酶液，取出2ml低温保存。然后将其余原酶点进层析柱中，由于我们的柱子装的太满，所以只能采取极端方法，一点点的将样品上进层析柱，无法象其他组那样一次性将样品全部加入，只能待样品全部点进柱子后封闭柱口，通入PBS缓冲液连接仪器，并调节流出液流出速度为0.8ml/min，控制好流速后由张晶、赵凯月负责记录数据（每两分种一次）画图，观察波峰变化，不知道是什么原因导致我们的数值比其他组要小200多（达到了-394）。理论上来说流出液应该是一些杂蛋白，但为了谨慎起见在这个过程中每隔五分钟即对流出液做定性检测。有可能我们测定的比较晚，在整个层析过程中我们并未观测到有杂蛋白的流出。等流出液为300ml时，即等6个小时左右就可以进行样品洗脱了，将PBS换成含0.15ml/LnaCl的PBS缓冲液对柱子进行洗脱，洗脱时要连接样品收集器，并且继续记录数据作图。收集时为防止记录错误，将收集管标上序号，每5min收集一个管，然后由我对流出液进行定性分析，由于我们的收集器有些问题，需要在流出管出垫上东西才能使溶液顺利收集，而这样的结果导致我们流速过快，在第三支收集管中就检测到了蔗糖酶的存在，在第五支收集管中酶的含量最多，在全组焦急的等待中直到第二十九管中才观测到颜色明显变浅，这也让我们同时松可口气，证明我们终于要收集完毕了，最后将收集到的酶液低温保存起来，这时我们全体组远也都露出了笑容，虽然不知道最终结果会怎样，但在这一天的等待中终于得到了较好的结果，在这个过程中全体组远密切配合，每一步都有专人负责，合理分配任务，整体协调的很好，让我看到了团结的力量。6月14日，可以说是实验的最后一天，也是最关键的一天，我们怀着即高兴又忐忑的心情走进实验室，高兴是因为实验过后可以好好的休息下了，而忐忑是怕实验失败不出结果。今天的工作的点样做凝胶电泳，所以制胶的工作非常重要，制胶用水必须是去离子水，以防止发生离子效应影响几，将平板清洗烘干，配完分离胶后立即灌胶，在这个过程中不能产生气泡，当灌到大约2/3处时立即在上面封上一层去离子水，防止氧化，等胶凝固后用滤纸小心的吸去水层，然后灌入配好的浓缩胶，插入梳子，等凝固后开始点样，每次点样20ul。在等待电泳的过程中做好蛋白含量及酶活力测定。之后，每位同学做个简单的实验总结，看到同学在台上讲述自己的实验过程让我深受感动，来到这个学校已经三年了，这是我们第一次团队合作，也将是最后一次。通过本次实验，让我看到了自身的不足，无论做什么事一定要认真细心，不得有丝毫马虎，也许你的一点失误就会影响到最后的结果，也让我认识到了团结的力量，人的潜力是无穷的，只要去努力、坚持就没有什么是你做不到的。虽然最后我们的电泳跑的不是很理想，但我认为实验的结果不是最重要的，重要的