PCR专题讲座.ppt

,Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应,PCR,.,定义,是一种模拟天然DNA复制过程,由引物介导、耐热DNA聚合酶催化，在体外扩增特异DNA片段的一种快速而有效的方法。,历史沿革,1958 Enrmberry 分离出DNA多聚酶 1976 Chien 分离出热稳定性多聚酶 1985 Mullis 发明多聚酶链式反应 1988 复旦大学 研制出FD多聚酶 1989 分子年 PCR爆炸年,技术特点,一、特异性强 针对性强 二、灵敏度高 可达fg级 三、简便快速 检测周期短 四、样品取材要求低 所有临床标本,基本原理,一、生化原理 1、变性作用 2、复性作用 二、操作原理,扩增材料,一、仪器 1、台式高速微量离心机 2、PCR热循环仪 3、微量塑料离心管 4、微量加样器 5、电泳仪、电泳槽 6、紫外分析仪 二、模板DNA,扩增体系,一、引物 二、TaqDNA聚合酶 三、标准PCR缓冲液 四、底物 五、模板核酸,操作步骤,一、建立扩增体系 二、模板提取 三、上机扩增 四、检测 五、报告,质量控制,避免交叉感染，防止假阳性出现 1、实验室管理 2、室内控制外源性核酸 3、阴、阳性对照,临床应用,.,泌尿系列,一、淋病双球菌 NG 二、沙眼衣原体 CT 三、解脲支原体 UU 四、人乳头瘤病毒 HPV 五、单纯疱疹病毒 HSV 六、梅毒螺旋体 TP 七、金黄色葡萄球菌 SAU,肺科系列,一、结核杆菌 TB 二、肺炎支原体 MP 三、肺炎衣原体 CP,优生优育,一、人类巨细胞病毒 HCMV 二、弓形虫 TOX 三、单纯疱疹病毒 HSV 四、风疹病毒 RV 五、地中海贫血 a THA,肝炎系列,一、甲型肝炎 HAV 二、乙型肝炎 HBV 三、丙型肝炎 HCV 四、戊型肝炎 HEV,双链DNA分子,单链DNA分子,变性,复性,PCR由高温变性、低温退火和适温延伸反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA片段迅速扩增，扩增产物的量取决于最初靶DNA的数量、PCR扩增率及循环次数。通常反复进行30次循环后，使目的DNA片段成百万倍增加，便可用肉眼从染色的琼脂凝胶中见到清晰的区带。,NG,由淋病双球菌引起的泌尿生殖器黏膜化脓性炎症，普通培养基不易生长，镜检漏检率高。 检测范围：临床可疑患者、孕妇检查、体检等,取材：尿道 子宫颈拭子 血液 心包液 脑脊液,CT,不仅引起眼部感染，而且是性传播疾病的主要病原体，感染常无特异症状。,取材：尿道 宫颈内膜 眼分泌物拭子,UU,又叫解脲脲原体，常在临床上误为淋病，长期治疗效果不佳。,取材：收集宫颈口（女性）棉拭或尿道口（男性）分泌物及前列腺液。,HPV,检测范围： 尖锐湿疣 宫颈癌及癌前病变 HPV分型,取材： 分泌物 活检组织 宫颈刮片,HSV,检测范围： 可疑对象 流行病调查 病原体分型 指导用药 孕妇常规检查,取材： 角膜拭子 口腔拭子 宫颈拭子,TB,检测范围： 早期诊断 鉴别诊断 流行病学调查 随访,取材： 痰 腹水 脑脊液 支气管灌洗液 脓液 尿 活检组织,MP,检测范围：对支原体肺炎、原发性典型性肺炎的确诊,取材：收集患者的咽拭子、痰或肺泡灌洗液送检。,HCMV,标本收集：取患者血液、尿液、唾液、咽拭子、支气管洗液、乳汁等。,先于病毒感染的临床症状或免疫学指标的出现。,TOX,标本收集：收集脑脊液、羊水、脑组织、宫颈、阴道、外阴、阴茎分泌物等。,弓形虫可寄生在哺乳类、两栖类、鱼类、爬行类的任何有核组织细胞中，选择性不强。,RV,标本收集：采集患者、孕妇血液或胎儿羊水、宫颈分泌物、痰液、咽拭子等。,只对人致病。预防重点是育龄妇女。,HBsAg + + - - HBsAb - - - + HBeAg + - - - HBeAb - + - - HBcAb + + + - 意义 急慢性 恢复 窗口 免疫 乙肝 期 期 后 PCR 高度 HBV HBV HBV （+） 复制 复制 复制 复制 PCR 无 无 感染 免疫 （-） 复制 恢复 后,HBsAg - + - HBsAb + - - HBeAg - - - HBeAb + - - HBcAb + - - 意义 康复 携带者 未感染 PCR+ 慢活肝 HBV复制 感染早期 PCR- 恢复 携带者 未感染,肿瘤 1、鼻咽癌 EBV 2、幽门螺旋杆菌 HP 伤寒杆菌 其他 1、腺病毒 Adv 2、柯萨奇病毒 Cox 3、轮状病毒 ROV 4、狂犬病毒 RT 5、细小DNA病毒B19 6、霍乱弧菌 VCH,荧光定量技术 1996年由美国Applied Biosystems公司推出,采用先进的Taqman荧光探针技术，比常规多了一个寡聚核苷酸探针，Taq酶分子在链延长过程中可以通过自身的5，-3，核酸外切酶降解与模板结合的特异性荧光探针。,技术特点,一、污染最少 二、灵敏度更高 三、可准确定量 四、特异性增强 五、定量范围宽 六、操作简便