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碱性磷酸酶(AKP)的特性分析研究 摘要：碱性磷酸酶（AKP）是在碱性条件下水解多种磷酸酯并具有转磷酸基作用的一组酶，并且在较高温度下仍具有活性。本实验由含pET21a-AKP表达质粒的大肠杆菌制备碱性磷酸酶，通过一系列分离纯化的实验提纯了碱性磷酸酶。本实验通过对纯化之后的AKP进行酶促反应速率曲线的测定、测定激活剂和抑制剂对AKP活性的影响、测定抑制剂对酶的动力学参数的影响、测定AKP的最适温度和pH以及AKP的变性和复性等实验来研究AKP的特性。下载 关键词：碱性磷酸酶（AKP）； 反应速率曲线；激活剂；抑制剂；变性；复性；酶活力大肠杆菌碱性磷酸酶（ EC. 3. 1. 3. 1）， 是同二聚体金属酶，能催化非特异性磷酸单酯水解，分子量是56 Kda。它的两个单体结合成具有两个活性中心的对称的活性酶，每个活性中心包含3 个金属原子，即两个锌原子和一个镁原子。大肠杆菌碱性磷酸酶被phoA 基因编码，和其他分泌蛋白质一样，以在氨基末端带有一个信号肽的前体合成，转录后穿过细胞膜进入细胞质，信号肽被除去，两个成熟的单体二聚化。 碱性磷酸酶即AKP来源广泛，可来源于细菌、真菌、藻类、无脊椎动物及脊椎动物。AKP广泛存在于各种生物体内，参与细胞磷代谢和信号肽转导的一种磷酸酶。 AKP能催化除去DNA、RNA、三磷酸核糖核苷和三磷酸脱氧核糖核苷的5磷酸基团；去除线状DNA两端的5磷酸可以最大限度地减少质粒DNA的自身环化；蛋白质的去磷酸化。大肠杆菌碱性磷酸酶是一种有用的工具酶，在免疫学研究中常用作酶联试剂，将AKP与显色剂或去磷酸化后能发光的底物相互作用来揭示靶与检测酶复合物的存在。AKP作为一种工具酶在表位连锁图谱、组织化学、免疫印迹、突变分析等方面有广泛应用，在临床上作为同工酶，疾病诊断，研究磷的代谢等。 本实验对碱性磷酸酶的特性研究主要是通过对酶活力的测定来分析的。酶活性也 称为酶活力，按照国际酶学委员会的规定，1个酶活力国际单位是指在最适反应条件（指最适pH、温度25等）下，1分钟内能催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量。酶活力的大小可以用在一定条件下所催化的化学反应的速率来表示，反应速率愈快，就表明酶活力愈高。酶催化的反应速率可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示，实际酶活测定中一般以测定产物的增加量为准。AKP活力的测定是以pNPP为底物，采用分光光度计法来测定AKP的活力的。 一、材料与方法 1.酶促反应的速率曲线的测定： 1.1材料：由AKP分离纯化实验中制备的AKP溶液 1.2试剂：测活液（50mmol/L Tris-HCl pH 8.5，0.2mg/mL BSA，10mmol/L pNPP，2mmol/L MgAc2，pH= 8.5）、酶稀释液（50mmol/L Tris-HCl，0.2mg/mL BSA，pH=8.5）、终止液（0.5mol/L Na3PO4，10mmol/L EDTA） 1.3仪器：试管；试剂瓶；药匙；移液枪；玻棒；水浴锅；分光光度计；比色杯；烧杯；分析天平；小指管； 1.4实验方法： 1.4.1确定AKP的最佳稀释倍数。将酶分别稀释不同倍数，在30水浴锅中与测活液反应10min，测溶液在410nm处的吸收峰，取吸光度值为0.70.9之间的稀释倍数。 1.4.2 AKP特性分析一-酶促反应的速率曲线测定。用已测的倍数稀释酶，与测活液在30C分别反应0，3，6，9，12，15，18，21，24，30分钟，测溶液在410nm处的吸收值。每个反应测两次，求平均值。以吸光度A410为纵坐标，时间为横坐标绘制时间作用曲线。 2.pH对AKP的酶活性的影响： 2.1材料：由AKP分离纯化实验中制备的AKP溶液 2.2试剂：测活液（50 mmol/ L Tris-HCl，pH=7.5，8.5，9.5；50mmol/ L Caps-NaOH，pH=9.5，10.5，11.5） 2.3仪器：试管；试剂瓶；药匙；移液枪；玻棒；水浴锅；分光光度计；比色杯；烧杯；分析天平；小指管； 2.4实验方法：30条件下，分别在pH为7.5、8.5、9.5的50 mmol/ L Tris-HCl （含2 mmol/ LMgCl2）缓冲液配制的测活液及pH为9.5、10.5、11.5的50 mmol/ L Caps-NaOH （含2 mmol/ L MgCl2）缓冲液配制的测活液，反应10min后，在410nm波长下测定AKP催化pNPP水解的吸光度值。 3.温度对AKP的酶活性的影响： 3.1材料：由AKP分离纯化实验中制备的AKP溶液 3.2试剂：测活液（50 mmol/ L Tris-HCl，pH=7.5，8.5，9.5；50mmol/ L Caps-NaOH，pH=9.5，10.5，11.5） 3.3仪器：试管；试剂瓶；药匙；移液枪；玻棒；水浴锅；电磁炉；分光光度计；比色杯；烧杯；分析天平；小指管； 3.4实验方法：测活液在50mmol/L Tris-HCl （含2mmol/ LMgCl2）缓冲中液配制而成，pH=8.5，分别在温度为30、40、50、60、70、80、90和100条件下反应10min，在410nm波长下测定AKP催化pNPP水解的吸光度值。 二、实验结果 1.AKP的时间作用曲线： 表1 测活液ul360稀释液ul40AKP ul4030反应时间 min时间梯度 终止液ml3.6A 410（1） A 410（2）平均值时间设定为0、3、6、9、12、15、18、21、24min， A 410 的平均值是0、0.058、0.227、0.356、0.473、0.632、0.636、0.659、0.708、0.932。2.不同温度对AKP的酶活性的影响： 表2测活液ul360稀释液ul40AKP ul40反应时间min10 终止液ml3.6A 410（1） A 410（2）平均值反应温度设定梯度：30、40、50、60、70、80、90、100。A 410 的平均值是0.152、0.34、0.409、0.5515、0.576、0.799、0.44、0.103。 3.不同pH对AKP的酶活性的影响： 表3测活液ul360稀释液ul40AKP ul40反应时间min10 终止液ml3.6A 410（1） A 410（2）平均值pH设定梯度：7.5、8.5、9.5、9.5、10.5、11.5。A 410 的平均值是0.3395、0.375、0.4645、0.367、0.3035、0.603。 三、讨论 酶催化的反应速率通常用单位时间内产物的增加量来表示。随着反应时间的进行，产物的变化量也在发生改变。因此特定条件下，酶促反应速率只在一定的时间范围内保持恒定，也只有此时的反应速率（初速率，v0）才能真正体现酶的活力。在具体的实验中，可以通过酶促反应的时间作用曲线来寻找v0，以便确定酶促反应的特定条件。由图可知，酶促反应的速率（即图象的斜率）是随着反应时间的增大而减小的，与预期结果相符。 就理论而言，酶是蛋白质，具有许多可解离的极性基团，在不同的酸碱环境中，这些基团的解离状态不同，所带电荷不同，而它的解离状态对保持酶的结构，底物与酶的结合能力以及催化能力都有重要作用，因此溶液的pH对酶活性影响很大。若其他条件不变，酶只有在一定的pH范围内才能表现催化活性且在某一pH时，酶的催化活力最大，此pH称为酶的最适pH。正常情况下，所测得的酶活性随pH值的变化情况为一钟罩形曲线，曲线的顶点即为该酶的最适pH值。有研究表明，大肠杆菌碱性磷酸酶的最适pH值为9.510.5。显然我们的实验结果并不理想。本来可以看出最适pH为9.5，但是后来在pH为11.5时，酶的活力又增强了分析原因为碱性磷酸酶本身出现了问题，或者是被污染，或者是产生了变异。 化学反应速度一般随温度的升高而加快，但在酶促反应中，随着温度的升高，蛋白质的变性速度也在加快，因此在酶催化的反应中，升高温度既可以使反应速度加快，同时又会引起酶