SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量.doc

项目三SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定蛋白质分子量一实训目的1掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作步骤2学会聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量的原理二实训原理用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离鉴定蛋白质（protein），主要依赖于电荷效应和分子筛效应。再与标准样品对照即可确定各区带的成分。要利用凝胶电泳测定某样品的蛋白质分子量就必须去掉其电荷效应，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小。SDS能破坏蛋白质分子间以及其他物质分子间的非共价键使蛋白质的构象发生变化，继而使蛋白质变性解离成单一亚基，从而降低或消除了各种蛋白质分子间的天然电荷差异，形成SDS-蛋白质负离子，因此，当电泳时，蛋白质分子的迁移率取决于其分子大小，当蛋白质分子量在1.2X10416.5X104之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈直线关系，符合下列方程。LogMWKbm(LogMW为分子量的对数，K、b为常数，m为迁移率)若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得其分子量.三、实训器材序号设备名称规格，型号数量1垂直板电泳槽及附件12直流稳压稳流电泳仪可变压13微量进样器24玻璃注射器15玻璃平板46电炉1序号试剂纯度、浓度作用配制方法需要工具需要工具1低分子量标准蛋白质样本2mg/ml以标准样品为对照即可确定样品各区带的成分见表格下方水浴锅、小烧杯，玻璃棒2样品1020mg/ml作为实验组来测定蛋白质的分子量同上水浴锅、小烧杯，玻璃棒3浓缩胶缓冲液呈弱酸性，使甘氨酸解离很少，在电场作用下，涌动效率低，二氯离子含量高，形成较高的电位梯度压着蛋白质聚集在一起，凝缩为一狭小区带。同上天平、容量瓶、棕色试剂瓶4分离胶缓冲液呈碱性，甘氨酸解离度大，涌动速率增加，紧随氯离子之后，在电场作用下，蛋白质根据其固有的电性得到分离。同上天平、容量瓶、棕色试剂瓶5电极缓冲液保证电泳的PH，起传播电流作用同上1000ml的容量瓶、天平6过硫酸铵（AP）1%作为催化剂，产生自由基，加速凝胶聚合。同上天平、容量瓶7SDS1%去掉其电荷效应，使样品的蛋白质分子的迁移率完全取决于分子量同上天平、100ml容量瓶8样品缓冲液同上天平、100ml容量瓶9样本变性液使蛋白质变性，固定在凝胶上同上天平、100ml容量瓶10固定液使蛋白质固定在凝胶上，便于后续过程中色普带的确定同上天平、100ml容量瓶11染色液同上天平、100ml容量瓶12脱色液脱去凝胶上的染色液，使蛋白质谱带清晰同上天平、100ml容量瓶13保存液保存凝胶，便于下次使用同上天平、100ml容量瓶14指示染料液便于观察蛋白质在凝胶电泳中的位置，有利于调节电流同上天平、100ml容量瓶15TEMED加速剂，可催化过硫酸铵产生自由基，从而加速丙烯酰胺的聚合同上天平、100ml容量瓶配制方法1、浓缩胶缓冲液：1.5克Tris、12.0毫升1mol HCl，加水混匀定容至25毫升。2、分离胶缓冲液：18.15克Tris、48.0毫升1 mol HCl，加水混匀定容至100毫升。3、电极缓冲液：3克Tris，14.4克甘氨酸、1克SDS，加水混匀定容至1000毫升。4、1过硫酸铵：1克过硫酸铵溶于l00ml蒸馏水中，临用前配制。5、样本缓冲液(Tris-HCl pH6.8 I0.0625M)：取浓缩胶缓冲液(B液)1：7(v/v)稀释。6、样本变性液(Tris-HCl pH6.8 I=0.01M，2SDS， 10蔗糖，0.001溴酚兰)；0.8克SDS， 4克蔗糖溶于样本缓冲液定容至20毫升，再1滴0.1溴酚兰。使用时与样本l:1(v/v)混匀。7、固定液：57.0克TCA，17.0磺基水杨酸，150毫升甲醇，加水350毫升混匀。或25异丙醇和10乙酸的混合液中1h，蛋白质就得到固定了。8、染色液：1.25克考马斯亮兰R-250，227毫升甲醇，227毫升水，46毫升冰乙酸混匀，滤纸过滤。9、脱色液：10乙醇-70醋酸。100毫升乙醇，70毫升醋酸加水混匀定容至1000毫升。10、保存液：10乙醇-10醋酸-10甘油，100毫升乙醇，100毫升醋酸，100毫升甘油加水混匀定容至1000毫升。11、指示染料液：0.1溴酚兰(BPB)，100毫克溴酚兰溶于100毫升水中。四、实训步骤（一）制备聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 电泳槽的安装：干燥的两块玻璃板装入配套塑料夹套内，垂直固定在电泳槽上，周边用1.5的琼脂密封。2. 样品处理：将各种标准蛋白质和待测样品分别溶于蛋白质处理液（浓度2mg/ml），在沸水中加热34min，待冷却后作点样用。3. 制胶：选择合适的胶浓度按下表配制7.5的分离胶，（为小孔胶，进行电泳和分子筛分离）1、分离胶的制备：10（催化剂过硫酸铵，加速剂N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED） 试 剂 分离胶 （10）（单位：ml）A液 3C液 1.85蒸馏水 3.51%TEMED 0.6 E 0.05 总量9ml，化学聚合3060分钟2、浓缩胶的制备：4.5为大孔胶，进行样品浓缩， 试 剂 浓缩胶 （10）（单位：ml）A液 0.43C液 1.25蒸馏水 0.91%TEMED 0.25 E 0.015 总量2.845ml，光聚合3060分钟（催化剂核黄素，加速剂（TENED）混合后将其沿长玻璃板加入两块玻璃板之间（小心不要产生气泡），加到距短玻璃板上边缘3cm处，立即覆盖23mm水层，静止聚合约40min左右。胶聚合好的标志是胶与水之间形成清晰的界面。吸取分离胶的水分，将配制好的浓缩胶注入分离胶之上，立即插上有机玻璃的点样槽模板，待浓缩胶聚合好备用。4. 点样：用微量注射器分别吸取标准蛋白质样品液5l，按分子量（从小到大）的顺序注入样品槽内的浓缩胶面上，同时吸取待测样品液25l，注入其它样品槽内，在样品上小心地注入电极缓冲液。5. 电泳：加样完毕，两槽注入电极缓冲液，接通电源（上负下正），调节电流为15mA，当指示剂进入分离胶后，电流需加大到30mA，电压恒定在80100伏之间，约34h后，指示剂达到距前沿12cm时，可终止电泳。6. 固定：胶取出后，在水中浸泡10min，浸出部分SDS，然后将胶浸泡在25异丙醇和10乙酸的混合液中1h，蛋白质就得到固定了。7. 染色：取出凝胶板，测定胶长（D1）后，加入染色液染色2h。8. 脱色将胶放在脱色液中脱色0.5h，每隔0.5h换一次脱色液，至少换3次，待蓝色基本脱掉，再放在脱色液里浸泡至蛋白质谱带清晰为止，精确测定胶长（D2）。（二）、蛋白质标准样品迁移率和待测样品分子量的计算根据蛋白质分子量对数和电泳迁移率的关系，精确测量溴酚蓝和各种蛋白质迁移距离。把溴酚蓝迁移的距离定为d1，蛋白质迁移距离定为d2，并以D1定为凝胶染色前的长度，D2定为凝胶染色后的长度。根据下面公式计算各种蛋白质的迁移率Rm：Rmd2d1D1D2以标准蛋白质的迁移率为横座标，以其对应的分子量对数为纵座标，绘制标准曲线，可得到一条直线，然后根据未知样品的迁移率，在半对数座标图上查出其对应的分子量。要得到一个可靠的结果，实验需多次重复。五、实训结果分离胶未凝固六、实训结果分析