LC-MSMS法测定鱼肉中氯霉素的残留.doc

LC-MS/MS法测定鱼肉中氯霉素的残留朱叶青 张晓东 王瑞生（内蒙古自治区食品药品检验所 呼和浩特 010020）摘要：目的：建立动物源性食品氯霉素的残留分析方法。方法：采用乙酸乙酯提取鱼肉中氯霉素的残留，以甲醇-水（70：30）为流动相，流速0.2ml，进样量20l，经高效液相色谱分离，以多反应监测（MRM）测定。结果：本方法在0.5 -10ng/ml内线性良好（r = 0.9996).）；检出限0.04g/kg；方法回收率为76.93%，RSD为2.90%。结论：本方法稳定、可靠、准确，可用于动物源性食品中氯霉素的残留分析方法。关键词：液相色谱-串联质谱 鱼肉 氯霉素 食品安全Vestigital of chloramphenicol residues in fish by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry zhu yeqing zhang xiaodong（Inner Mongolian Institute for the Control of Drug and Food， Hohhot，010020）Abstract：Aim：To establish a method for determination the chloramphenicol residues in fish .Methods：Ethyl acetate was used for extract chloramphenicol residues in fish. With mobile phase consisting of methanol-water（70：30）and eluted at flow rate of 0.2ml.min-1 at 25 .inject volume 20ul To Separate by HPLC, to analysis with MRM.Results The line ranges for chloramphenicol residues were within 0.510g/L .the limit of detection was 0.04g/kg.the average recorvery was 76.93%（RSD2.90%）.Conclusion：This method could be used for the determineation of the chloramphenicol residues in beef，and stable、reliable and accurate.Keywords Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry， fish，chloramphenicol residues，the safe of foods氯霉素对革兰阳性、阴性细菌均有抑制作用，且对后者的作用较强。其中对伤寒杆菌、流感杆菌、副流感杆菌和百日咳杆菌的作用比其他抗生素强，对立克次体感染如斑疹伤寒也有效，但对革兰阳性球菌的作用不及青霉素和四环素。氯霉素的主要不良反应是抑制骨髓造血机能。二是不可逆的再生障碍性贫血，虽然少见，但死亡率高。氯霉素也可产生胃肠道反应和二重感染。新生儿与早产儿剂量过大可发生循环衰竭（灰婴综合征）。2001年初，因为有消费者在食用当地“家乐福 ”超市出售的冻虾仁引起过敏反应，奥地利“绿色和平”组织紧急对本国商场内所有的水产品进行检测。结果发现德国雷斯蒂克(RISTIC)公司生产的部分虾仁产品含有违禁物质氯霉素。德国雷斯蒂克(RISTIC)公司决策层立即撤下公司所有在市场上出售的所有冻虾仁产品，连夜查验所有来自中国、印度和越南的进口库存原料。检测结果表明：中国出口的冻虾仁中含有0 .2-5ppb的氯霉素。2001年以来，中国出口水产品频频被进口国检出氯霉素残留。欧盟于2002年做出禁止中国动物源性食品进口的决议，这就意味着我国将在欧盟市场丢掉13万吨的市场份额和造成6亿多美元的经济损失，使中国水产品对欧盟出口严重受挫。药物残留已成为扩大水产品国际贸易的主要障碍。2002年8月，中国农业部、国家质检总局日前联合开展水产品药物残留专项整治活动，力求从源头控制水产品中氯霉素及其他禁用药物的使用，进行从生产到市场全程质量监控。1、实验部分1.1实验仪器与材料API3200LC-MS/MS串联质谱仪（美国AB公司），配LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）和电喷雾离子源。SIGMA 2-16K型冷冻离心机（Sartorius公司），IKA T18 basic ULTRA-TURRAX型均质机，VS-100 VORTEX SHAKER 型振荡器，TTL-DL型氮吹仪，24-Port SPE Vacuum Manifold System固相萃取装置，氯霉素标准品（中国药品生物制品检定所），乙酸乙酯（色谱纯），甲醇（色谱纯），1.2 分析条件液相色谱条件：色谱柱：ZORBAX C18 5m 3150mm；流动相：甲醇-水（70：30）；流速：0.2ml；柱温：室温；进样量：20l质谱条件：离子源：ECI，扫描方式：负离子扫描：Curtain Gas：30psi;Collision Gas：4psi;Ion Source Gas1:35 psi; Ion Source Gas2:45 psi；离子源温度350：监测离子及碰撞能量：320.6/152.0（-10eV）；320.6/256.9（-10eV）；320.6/194.2（-10eV）1.3氯霉素标准储备液的制备：取氯霉素约10mg，置100ml量瓶中，用甲醇超声溶解并稀释成浓度为100g/mL。-20保存，有效期1年。再逐级用流动相稀释至所需浓度。1.4样品的制备：取10000r/min匀浆1min试料5.00g，置50mL离心管中，加乙腈5mL，4氯化钠溶液5mL，涡旋振荡2min，4000r/min离心10min，取上清液至另一50mL离心管中，重复提取1次，合并提取液。提取液中加正己烷5mL，涡旋振荡1min，2000r/min离心10min，弃去上层液，重复1次。加水饱和乙酸乙酯溶液5mL，涡旋振荡1min，2000r/min离心10min，将上层液转移到15mL离心管中，重复提取1次，合并提取液氮气吹干，用流动相1mL溶解，备用。2结果与讨论：2.1 LC-MS/MS条件的选择选择不同的液相色谱柱及色谱质谱条件，最后确定出1.2的LC-MS/MS质谱条件检测氯霉素。氯霉素标准品的多反应监测（MRM）及质谱图见图1、图2。应用1.2中的色谱-质谱条件进行分析。通过保留时间以及各离子之间的丰度比值可以定性确定氯霉素是否存在。2.2标准曲线和检出限氯霉素在0.5 -10ng/ml范围内线性关系良好，取0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、5.0g/L、10ng/ml的溶液，用1.2的LC-MS/MS条件进行测定，得到子离子320.6/152.2的峰面积和浓度。以浓度（X，ng/ml）对二级子离子321.1/277.2峰面积（Y）进行线性分析，线性方程为Y=1.21e+0.04x+454(r=0.9996)。方法的最低检出限为0.04g/kg（S/N3）。2.3方法的准确度与精密度取经测定不含有氯霉素的样品5.00g9份，分别加入25ng/mL、50ng/ml、75ng/ml的标准工作液100l，按1.4方法操作，测得9份的回收率。实验结果见表1.表1 鱼肉中氯霉素的添加回收率序号加入量测得量回收率（）平均回收率（）RSD（）12.5081.81272.25 22.5081.98178.99 32.5081.93277.03 45.0163.84576.65 55.0163.98179.37 76.932.9065.0163.76275.00 77.5245.78976.94 87.5245.81977.34 97.5245.93278.84 2.4实际样品的测定应用本方法测定了六个地区的鱼肉共180批，共有15批检出氯霉素，最大检出量为5.91g/