肝肾阴虚型甲亢和脾肾阳虚型甲减患者血清蛋白质组的比较分析.doc

肝肾阴虚型甲亢和脾肾阳虚型甲减患者血清蛋白质组的比较分析摘要：目的通过对肝肾阴虚型甲亢和脾肾阳虚型甲减患者血清蛋白质组的分析，阐述肝肾阴虚和脾肾阳虚的物质基础。方法将正常人、甲亢和甲减患者血清用亲和层析法除去其中的高丰度蛋白质，再甩双向电泳技术分析不同组样品蛋白质组的变化，所获的差异蛋白质用质谱进行鉴定。结果与正常人相比，肝肾阴虚型甲亢患者血清中RBP和TTR 的表达量降低，而IGF一2、FDAC、NFKB及PTP表达量升高；脾肾阳虚型甲减患者TTR 表达量升高，NHE一1、ZAG、UCH、IGF一2和MHCII蛋白则表达量下降。肝肾阴虚型甲亢和脾肾阳虚型甲减相比，ProapoA-I和TTR 表达量降低，而NDU、SCDHSCR、PK、Cyt P450蛋白、IGF一2和IRF一5表达增加。结论肝肾阴虚型甲亢患者机体代谢活跃而脾肾阳虚型甲减患者则机体代谢减低，合成代谢的速度分解代谢的速度。肝肾阴虚型甲亢血清IGF一2表达升高，脾肾阳虚型甲减则正好相反，说明血清IGF-2具有成为中医辨证肝肾阴虚和脾肾阳虚血清标志物的可能性。肝肾阴虚型甲亢常关键词：肝肾阴虚；脾肾阳虚；甲亢；甲减；蛋白质组中图分类号R582 文献标识码：A 文章编号：10055509(2012)010023一O4Analysing the Serum Proteomics Between Hyperthyroidism of Yin deficiency in Liver and Kidney and Hypothyroidism of Yang Deficiencyin Spleen and Kidney Lu Dezhao，Song Junling，Wang Pinger，et al College of咖Science，Zhiang Chinese Medical University,Hangzhou r310053)Abstract： ObjectiveMaterial basis of yin deficiency of liver and kidney and yang deficiency of spleen and kidney were studied by analysing thediference of serum proteome between the patients of hyperthyroidism and hypothyroidism MethodsThe I1igh abumdance proteins in the serum ofnormal people，hyperthyroidism patients and hypothyroidism patients were removed with ProteoExtract AlbuminlgG Removal Kit and the proteinswere separated by tw odimensional electrophoresis and anysised with softwareThe diferent proteins were identified with mass spectrum ResultsCompared wich the norm al people，the expression of retinol binding protein and tran sthyretin decreased while the expression of insuhn growth factor2，aldolase C，NFKB，proteintyrosine phosphatase increased in the serum of yin deficiency of liver and kidney patients，and the expression of NaHhydrogen exchanger isoform l，Zna1pha一2一glyoprotein，ubiquitin Cterminal hydrolase，insulin growth factor一2 ，MHC一 decreased while theexpression of transth，retin increased in the seru m of yang deficiency of spleen and kidneyW hen compared wim the hypothyr oidism patients of yangdeficiency of spleen and kidney，th e expression of proapohpoproteinApoA I and transthyretin decreased，and the expression of NADH ubiquinonedehydrogenase，shortchain dehydrogenasereductase，pyruvate kinase，cytochrom e P450，interferon regulatory factor 5 and insulin growth factor 2increased in yin deficiency of hver and dney hyperthyroidm eConclutionThe energy metabolism in the patients of yin deficiency of liver andkidney was activeIn contrast，there were low energy metabolism in the patients of yang deficiency of pleenkidneyThe expression of insulin growthfactor 2 has contrary variance in this experiment，so it might be a$eklm marker for diferentiating zheng in traditional chinese medicineKey words：Yin deficiency of liver and kidney；Yang deficiency of spleen and kidn ey；hyp erthyroidism；hypothyroidism；proteome肝肾阴虚证和脾肾阳虚证是临床常见的中医证候。国内诸多学者对其物质基础和客观指标做了大量的研究，但尚无确定性的结论。甲状腺功能亢进症(hypenhyroidism，简称甲亢)是以血液循环中甲状腺激素(Thyroid hormone，TH)水平增加、作用增强为特征的一种临床综合征。在中医学中归属“瘿瘤”范畴，其中典型的发病原因首推“肝肾阴虚”Bl。而与之相反。甲状腺功能减退症(hypothyroidism，简称甲减)则是由于TH合成和分泌减少或组织利用不足导致的全身代谢减低综合征。在中医学中归属“虚劳”或“虚损”范畴，其典型发病原因是“脾肾阳虚”【2】。本研究分别以甲亢与甲减患者作为肝肾阴虚证和脾肾阳虚证的研究对象，拟通过检测患者血清蛋白质组的变化，在分子水平上诠释肝肾阴虚证和脾肾阳虚证型基金项目：国家自然科学基金项目(81102841)；浙江省中医药管理局重点项目(2006Z002)Fund project：，nle National Natural Science Foundation(81102841)；Key project of Chinese medical administration in ZhejiangProvince(2006Z002)的物质基础及其与机体代谢之间的关系。l 材料和方法11 一般资料 从浙江省中医院2009年9月至2010年lO月收治的患者或体检者中选取甲亢、甲减和健康体检者各8例。男性l2名，女性12名，年龄2O40岁，平均(2976+-487)岁，无心、脑、肾等严重器质性病变。3组在年龄、性别等基线资料方面比较。差异无统计学意义f尸1610nmolL，总三碘甲状腺原氨酸(1Tr3)25 nmolL，第三代促甲状腺素(TSH)2445 pmolL一，游离三碘甲状腺原氨酸(FI3)722 pmolL。甲减患者TI458 nmolL，TT3400 mIU L，FT3323pmolL。肝肾阴虚证和脾肾阳虚证辩证由两位主任中医师共同进行，结果一致才入选。13 研究对象的基本情况分析对实验中入选人浙江中医药大学学报2012年J月第36卷第J期群的基本情况、临床表现及相关指标进行测定，甲亢患者1Tr4、TT3、Fr3、FT4增加，TSH下降，临床表现为颈部肿大伴心悸，多汗，烦躁易怒，手抖，头晕目眩，舌红少苔，脉细数，符合肝肾阴虚证表现；甲减患者TF4、Tr3下降，TSH增加，临床表现为畏寒怕冷，面色苍白，颜面浮肿，舌体胖大常伴有齿痕，脉迟缓，符合脾肾阳虚的表现。见表1、表2。表1 研究对象基本情况(n=8，Y-zts)2 9 28-oo矗s4表2 入选人群实验室检测指标(n=8。 s)14 血清蛋白质的制备采集入选人群的外周血2mL，4 ，3000rrain离心10min取上清。将同组8个血清样品等量混合后用ProteoExtract AlbuminIgGRemoval Kit fMerck)除去高丰度的白蛋白和球蛋白。采用Lowry法对蛋白质进行定量后保存于一80冰箱备用。15 双向电泳 将150g样品用水化液定溶到450L。放入胶条槽内，采用EttanTM IPGPhor等电聚焦仪进行第一向电泳分离，每组重复3次。等电聚焦参数为30V 12h；500V1 h；IO00V lh；8000V 8h；500V 4h。表面温度20 ，电流不超过50A胶。等电聚焦后经平衡转移到预先配置好的浓度为10的浓度均一的SDS聚丙烯酰胺凝胶中，进行第二向SDSPAGE电泳分离，参数设置为：5W胶45rain；15W胶6h当溴酚蓝染料迁移到胶的底部边缘即可结束电泳。16 凝胶银染后图像扫描与软件分析 电泳结束后取出凝胶转移到染色盒里进行硝酸银染色。染色后的凝胶使用UMAX ImageScanner凝胶扫描仪进行扫描成像，再用ImageMaster 2D 60图像分析软件进行差异蛋白质分析。以各组内2一DE蛋白质点最多的凝胶作为参考胶，进行组内组间匹配，选择表达水平上升或下降2OO的蛋白作为差异蛋白质。17 胶内酶解及质谱鉴定制作2块制备胶，银染后切下差异蛋白质点，置于15mL的离心管中，经脱色液(50mmolL Na2S203，15mmolLK3Fe(CN)6)脱色后加入5 L浓度为125ng 胰蛋白酶(用200mmolLNH4HCO 配制)，37酶解过夜，酶解后用15txL萃取液(45H20，5TFA，50乙腈)萃取3次，合并萃取液。用真空浓缩仪进行浓缩后溶于含121xL01 TFA中，点靶时031xL肽段和031xL饱和基质溶液(肉桂酸)直接点样，每点06txL，每点做2个重复，然后进行基质辅助激光电离飞行时间质谱分析并进行MALDITOFTOFMS检测，得到肽质量指纹图谱。通过Mascot数据搜索，结合2一D图谱上蛋白质的分子量、等电点信息鉴定蛋白质l31。18 统计分析 数据统计采用SPSS130统计软件，计量资料用均数标准差表示(Y-+-s)。有显著性差异。PO05表示 表3 肝肾阴虚型甲亢与正常对照组差异蛋白质相关信息2 结果21 差异蛋白质组分析利用双向电泳技术获得正常人、肝肾阴虚型甲亢患者和脾肾阳虚型甲减患者血清蛋白质组图谱。通过差异蛋白质组分析。并选择表达量变化在200 以上的蛋白质作为表达显著发生变化的差异蛋白质。与正常对照组比较肝肾阴虚甲亢和脾肾阳虚型甲减患者血清中分别有6个蛋白质表达显著发生变化；肝肾阴虚甲亢组与脾肾阳虚型甲减组比较，10个蛋白质表达发生了显著的变化 l 2 31正常人血清：2肝肾阴虚型甲亢患者：3脾肾阳虚型甲减患者图1血清双向电泳图谱(pH4-7，24cm122 质谱鉴定 实验所获差异蛋白质点经过胶内酶解后用基质辅助激光电离飞行时间质谱进行检测。在肝肾阴虚型甲亢患者血清中，视黄醇结合蛋白(Retinol Binding Protein，RBP)和转甲状腺素蛋白(Transthyretin，1_rR)表达量下调，胰岛素样生长因子一2(insulinlike growth factor一2，IGF一2)、果糖二磷酸醛缩酶C ffructose diphosphate aldolase C，FDAC1、NFKB 和酪氨酸磷酸酶fproteintyrosinephosphatase，PrrP1表达量增加；脾肾阳虚甲减患者血清中 rrR表达量升高；泛素C末端水解酶(ubiquitinCterminal hydrolase，UCH)、NaH 交换蛋白1(sodiumhydrogen exchanger isoforml，NHE一1)、锌a一2糖蛋白A链(ZnAlpha一2一Glyoprotein，ZAG)、IGF一2和MHCII蛋白质则表达量下降：肝肾阴虚型甲亢和脾肾阳虚型甲减患者相比，前载脂蛋白AI(Proapolipoprotein AI，ProapoAI)和rrrR表达量降低，而NADH辅酶脱氢酶(NADH dehydrogenaseubiquinone，NDU)、短链脱氢酶还原酶fshort chaindehydrogenasereductase，SCDHSCR)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)、细胞色素P450蛋白fcytochromeP450，Cyt P450)、超氧化物歧化酶2 fsuperoxidedismutase2，SOD2)、血红素氧合酶(Heme oxygenase，HO)、IGF一2和干扰素调节因子5(interferon regulatoryfactor 5，IRF一5)表达增加。见表3、表4、表5。3 讨论现代研究认为肝肾阴虚和脾肾阳虚与神经、内表4 脾肾阳虚甲减与正常对照组差异蛋白质相关信息表5 肝肾阴虚甲亢与脾肾阳虚甲减患者差异蛋白质相关信息分泌、免疫系统关系密切。表现为下丘脑一垂体一肾上腺皮质轴、下丘脑一垂体一甲状腺轴、下丘脑一垂体一性腺轴分泌紊乱。肝肾阴虚和脾肾阳虚还与糖、脂肪、蛋白质代谢、能量代谢、免疫细胞因子、细胞核调控因子、酶和蛋白质等密切相关41。因此肝肾阴虚和脾肾阳虚是多因素、多环节、多通路发生病变的综合结果，采用单因子的方法进行研究很难得到正确的结果。为此我们在I临床选择阿胶黄精丸调理甲亢经辨证确认肝肾阴虚型甲亢效果比较好应用双向电泳和质谱技术对患者血清蛋白质组进行分析测定，从血清蛋白质组表达水平上探讨脾肾阳虚证和肝肾阴虚证的物质基础，诠释肝肾阴虚证和脾肾阳虚证型与机体代谢之间的关系，这可能更符合中医辩证的本质。实验中发现了一系列的蛋白质表达发生了变化，它们可能与肝肾阴虚证和脾肾阳虚证的发病有关。RBP和TTR是肝脏合成的低分子蛋白质，1TR又称前白蛋白，是TH的运载蛋白，在血浆中二者共同参与维生素A的转运阁。甲亢时RBP和1rR表达减低，引起维生素A合成不足，进而不能转化为更多的辅酶。甲亢患者血清RBP水平较正常人低，甲减则高于正常人。同时肝肾阴虚型甲亢患者在高代谢状态下，能量代谢速度加快FDAC和 P高表达有助于糖酵解和使乙酰辅酶A进入柠檬酸循环，产生大量ATP。此外，甲亢患者在长期高浓度的TH刺激下IGF一2等各种促生长因子过表达，使细胞有丝分裂速度加快6】，导致甲状腺腺体组织增生肥大，甲状腺组织的增生反过来又释放了更多的甲状腺素，维持了