实验六侧孢芽胞杆菌菌种活化及复壮.doc

实验六 侧孢芽胞杆菌菌种活化及复壮一、实验目的1.了解菌种衰退的原理2.熟悉发酵菌种活化和复壮的方法二、实验原理菌种在传代过程中，原有的生产性状会逐渐下降，这就是菌种的衰退。衰退是菌株的自发突变引起的，一旦发现衰退，就必须进行复壮。复壮就是通过纯种分离和性能测定等方法从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌种原有性状的一种措施。菌种活化就是逐级扩大培养是为了得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。菌种发酵有一般需要2-3代的复壮过程，因为保存时的条件往往和培养时的条件不相同，所以要活化,让菌种逐渐适应培养环境。三、实验器材与试剂1、菌种 侧孢芽胞杆菌斜面保藏菌种2、实验器材 天平、手提式电热灭菌锅、超净工作台、接种环、电热鼓风干燥箱、生化培养箱、光学显微镜、电炉、酒精灯、铁架台、玻璃漏斗、试管、三角瓶、载玻片等3、试剂 葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、复红染色液、结晶紫染色液、卢哥氏碘液、95%乙醇、番红染色液、香柏油、氢氧化钠、盐酸四、实验步骤1、斜面培养基配方：葡萄糖10g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化钠5g、水1000mL、琼脂20g、pH值7.27.4。2、按配方准确称取所需的药品，溶解、过滤、分装、包扎、灭菌（12130min）、冷却、摆斜面。3、斜面无菌检查。28，37恒温培养箱培养观察。4、接种：无菌室清洁、紫外灯灭菌、操作人员清洁、消毒、用接种环接种斜面。5、培养：37恒温培养箱中培养1d。6、重复转接3代斜面7、镜检。分别用简单染色或革兰氏染色涂片观察，菌的生长情况，是否有杂菌。8、生长好的菌种置冰箱中保藏备用。五、注意事项1、灭菌要彻底，冷气一定排尽，并保证灭菌温度和时间。2、接种时要严格按无菌操作规程进行。六、作业记录实验结果（培养基灭菌效果、斜面生长情况、镜检结果）七、思考题无菌操作要注意哪些问题？实验七 沙土管干燥法保藏菌种1 实验目的了解菌种保藏的基本原理。掌握几种常用的菌种保藏方法。2 实验原理菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏的方法很多。其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境，即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。斜面保藏、半固体穿刺、石蜡油封存和沙土管保藏法较为常用，也比较容易操作。3 实验材料3.1 菌株待保藏的适龄菌株斜面。3.2 培养基肉汤蛋白胨斜面、半固体及液体培养基。3.3 试剂10%HCl、无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。3.4 器具及其他用品用于菌种保藏的小试管（10mm100mm）数支、5mL无菌吸管、1mL无菌吸管、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱、无菌水、筛子（40目、120目，孔径/mm= ）、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。4 沙土管保藏步骤4.1 流程制沙土管灭菌制菌液加样干燥保藏4.2 步骤（1）制作沙土管选取过40目筛的黄沙，酸洗，再水洗至中性，烘干备用，过120目筛子的黄土备用；按1份土加4份沙的比例均匀混合后，装入小试管，装量1cm左右。（2）灭菌加压蒸汽灭菌，直至检测无菌为止。（3）制备菌液取3mL无菌水至待保藏的菌种斜面中，用接种环轻轻刮下菌苔。振荡制成菌悬液。（4）加样用1mL吸管吸取上述悬液0.1mL至沙土管，再用接种环拌匀。（5）干燥把装好菌液的沙土管放入干燥器或同时用真空泵连续抽气，使之干燥。（6）保藏干燥后的沙土管可直接放入冰箱中保藏；也可以用石蜡封住棉花塞后放冰箱中保藏。5 思考题（1）菌种保藏应注意哪些问题？（2）沙土管法适合保藏哪一类微生物？实验八 侧孢芽胞杆菌液体发酵培养基优化一、实验目的1、掌握发酵培养基配制的原则2、熟悉优化发酵培养基的方法：正交试验、均匀化设计、响应面法、二次正交旋转法。主要选用正交试验，也可用其他方法。二、实验原理发酵培养基是指大生产时所用的培养基，由于发酵产物中一般含有较高比例的碳元素，因此培养基中的碳的含量也应该比种子培养基中高，如果产物的含氮量高，还应增加培养基中的氮源比例。但必须注意培养基中的渗透压，如果渗透压太高，又会反过来抑制微生物的生长，在这种情况下可采用流加的方法逐步加入碳氮源。培养基组分对发酵起着关鍵性的影响作用。工业发酵培养基与菌种筛选时所用的培养基不同，一般以经济节约为主要原则，因此常用廉价的农副产品为原料。选择碳源时常用山芋粉、麸皮、玉米粉等代替淀粉，而用黄豆粉、豆饼粉等作为氮源；此外，还应考虑所选原料不至于影响下游的分离提取工作。由于这些天然原料的组分复杂，不同批次的原料成分各不相同，在进行发酵前必须进行培养基的优化试验。三、实验器材与试剂1、菌种：侧孢芽胞杆菌斜面菌种2、种子培养基：蔗糖1.5%、蛋白胨0.2%、酵母膏0.4%、碳酸钙0.5%、磷酸氢二钾0.1%、硫酸镁0.03%、硫酸锰0.002%3、发酵培养基：参考种子培养基进行研究4、计数用平板：牛肉膏蛋白胨培养基5、实验器材：天平、手提式电热灭菌锅、超净工作台、接种环、电热鼓风干燥箱、温控摇床、光学显微镜、电炉、酒精灯、玻璃漏斗、试管、三角瓶、载玻片四、实验步骤（正交试验）1、确定因素和水平：选蔗糖、蛋白胨、酵母膏作为主要因素2、选用合适的正交表：三因素四水平表（附三因素四水平正交表）3、表头设计：不考虑交互作用，可随机排列4、列出试验方案5、进行试验：培养条件180r/min，37.镜检80%的菌体形成芽胞，结束培养。6、正交试验结果的统计分析五、注意事项1、有条件需进行单因子试验2、培养温度、摇床转速、菌种及接种量等结果影响较大，需保持条件一致。六、思考题1、比较各种优化方法特点？2、如果不用正交实验，四因素三水平的实验总共需要做几组？发酵培养基优化用四因素三水平正交试验表组别因素A因素B因素C因素D菌数111112122231333421235223162312731328321393321发酵培养基优化用四因素三水平正交试验表组别因素A因素B因素C因素D菌数111112122231333421235223162312731328321393321发酵培养基优化用四因素三水平正交试验表组别因素A因素B因素C因素D菌数111112122231333421235223162312731328321393321实验九 侧孢芽胞杆菌分批补料发酵实验实验目的1、熟悉分批补料发酵实验操作过程。2、学习和掌握发酵过程中的取样操作。3、了解还原糖的各种测定方法；掌握DNS法测定的操作方法及注意事项。4、掌握发酵液中氨基氮测定的方法。 实验原理1、发酵过程中的取样操作取样操作是发酵过程中在线控制的重要内容；只有通过取样才能对发酵过程中的诸多参数进行测定，以求进一步的控制。操作要注意动作协调、快速，不能造成发酵罐的污染，严格按照相应程序进行。盛放样品的器皿也要洁净、无菌，以防止对测定结果产生影响。2、发酵过程中的还原糖测定单糖和某些寡糖含有游离的醛基或酮基，有还原性，属于还原糖。而多糖和蔗糖等属于非还原性糖；利用多糖能被酸水解为单糖的性质可以通过测定水解后的单糖含量对总糖进行测定。发酵工艺控制是通过一系列工艺参数来实现的。这些参数中包括物理参数，即温度、压力等。二是化学控制系数，即pH、糖的浓度等；其中糖的浓度是控制发酵过程中的重要参数之一。由于碳源对于发酵过程菌体生长及产物合成都有较大影响。因此，测知发酵过程中还原糖浓度变化，对发酵控制有重要的指导意义。还原糖的测定方法有很多，一般有菲林试剂法、酶法和DNS法。A、菲林试剂法菲林试剂由质量浓度为0.1g/mL的NaOH溶液和质量浓度为0.05g/mL的CuSO4溶液配制而成，二者混合后，立即生成淡蓝色的Cu(OH)2沉淀。Cu(OH)2在加热条件下与醛基反应，被还原成砖红色的Cu2O沉淀，醛基则被氧化为羧基。利用菲林溶液与还原糖共沸，生成氧化亚铜沉淀的反应，以次甲基蓝为指示液，以样品或经水解后的样品滴定煮沸的菲林溶液，达到终点时，稍微过量的还原糖将蓝色的次甲基沉还原为无色，以示终点。根据样品消耗量求得总糖或还原糖的含量。用菲林试剂鉴定可溶性还原糖时，溶液的颜色变化过程为：浅蓝色棕色砖红色(沉淀)。B、酶法又称葡萄糖氧化酶过氧化物酶法。葡萄糖氧化酶可将葡萄糖氧化成葡萄糖酸并产生过氧化氢，后者与苯酚及安替比林在过氧化物酶作用下生成红色化合物，葡萄糖的浓度与红色深浅成一定比例。一般可采用葡萄糖测定的试剂盒，测定方法简单、快速C、DNS法又称3，5二硝基水杨酸法。在碱性溶液中，还原糖变为烯二醇，烯二醇可被3，5二硝基水杨酸氧化为糖酸。加热进一步产生一种棕红色的氨基化合物。在一定浓度范围内，还原糖的量与棕红色物质的深浅成一定比例关系，通过此比例测定还原糖的含量。三种方法各有不同的应用和使用范围，应根据具体情况选择。例如菲林法容易受青霉素效价及其他还原性物质的干扰且滴定终点不易判断，误差较大；酶法专一性强且结果准确，但成本较高，适宜精确测定；而DNS法则结果准确且操作相对简单；在生产和研究中应用相对更为广泛。3、 氨基氮的测定氨基酸中的-NH3+基的pk值常在9.0以上，不能用一般的酸碱指示剂（包括酚酞），以氢氧化钠溶液作滴定测量。但可以用甲醛滴定法测量。在pH中性和常温条件下，甲醛迅速与氨基酸中氨基相互作用，使滴定终点移至pH9.0左右，在该过程中指示剂酚酞不与甲醛作用。pH9.0正是酚酞的变色范围，因此，可以用酚酞作为指示剂，以氢氧化钠溶液来滴定-NH3+基上的H+，每释放一个氢离子，就相当于一个氨基酸。R-NH3+ H+R-NH2R-NH2+2CH3CHO R-N(CH2OH)2实验材料1、分析试剂DNS显色剂 每1000mLDNS溶液含有酒石酸钾钠 182g，无水亚硫酸钠 3g，氢氧化钠 20g，3，5二硝基水杨酸 6.3g，重蒸馏酚 4g。配后过滤放置半月后使用。甲基红指示剂、酚酞指示剂、标准NaOH溶液、12%中性甲醛溶液，10%ZnSO4溶液.1%葡萄糖标准溶液：准确称取100mg葡萄糖，用少量蒸馏水溶解后定容至100mL，冰箱保存备用. 2、器材 机械搅拌发酵罐，分光光度计，定糖管，移液管，碱式滴定管，容量瓶，烧杯，电炉等。实验步骤1、分批补料发酵实验操作步骤（演示实验）2、发酵液中还原糖测定（一）葡萄糖标准曲线的绘制取9只定糖管（有盖子，且用绳子系住），分别按照下表1的顺序加入各种试剂，沸水浴中加热5min，后立即流动水冷却。管内溶液混匀， 用空白管溶液调零点，520nm测定光密度值(O.D.)，以葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标绘制葡萄糖溶液标准曲线。表1 制作葡萄糖标准曲线时各试剂用量项目CK12345678含糖总量(mg)00.20.40.60.81.01.21.41.6葡萄糖液(mL)00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸馏水(mL)2.01.81.61.41.21.00.80.60.4DNS试剂(m1)1.51.51.51.51.51.51.51.51.5加热均在沸水浴中加热5min冷却立即用流动冷水冷却蒸馏水(mL)21.521.521.521.521.521.521.521.521.5光密度(520nm)（二）发酵液的取样按照发酵罐取样的操作规程取样，并用洁净的三角瓶盛放。（三）发酵液检测样品的制备取一定体积的发酵液在12000rpm下离心去除产菌体。准确量取5mL发酵上清液（视含糖量高低而定，在发酵周期内不同时期取样数量应有所不同）于100mL容量瓶中，加入10mL 10%ZnSO4溶液，用碱液（NaOH 3mol/L）调节显碱性，以水稀释至刻度、摇匀；通过干燥滤纸过滤。按照表2加入相应试剂进行反应。520nm测定光密度值，最后根据葡萄糖标准曲线算出发酵液所含还原糖的量。每管测定三次，求平均值。表2 发酵液所含还原糖的测定项目CK123发酵液(mL)00.80.80.8蒸馏水(mL)2.01.21.21.2DNS试剂(m1)1.51.51.51.5加热均在沸水浴中加热5min冷却立即用流动冷水冷却蒸馏水(mL)21.521.521.521.5光密度(520nm)注意：1）实验中所有的试管要干净，加入各种试剂量要准确。2）试剂不可倒出试剂瓶，用干净的移液管吸取，用后盖好瓶塞，防回原处。3）定糖管的管口在加热时不可朝向人，以免糖液过度沸腾飞溅伤人。4）葡萄糖标准曲线绘制要准确，尽量符合统计学意义（R297）。如果绘制时浓度过度分散需重做依次。5）分光光度计使用：溶液不要倒太多；毛边不要对着透光处；用后用自来水冲洗干净，防回原处。 （四）实验结果1）填写表1，并绘制葡萄糖标准曲线图。表1 制作葡萄糖标准曲线时各试剂用量项目CK12345678含糖总量(mg)00.20.40.60.81.01.21.41.6葡萄糖液(mL)00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸馏水(mL)2.01.81.61.41.21.00.80.60.4DNS试剂(m1)1.51.51.51.51.51.51.51.51.5加热均在沸水浴中加热5min冷却立即用流动冷水冷却蒸馏水