MDA、SOD含量测定.doc

MDA和SOD的测定SOD活性测定(避光！)【实验用品和仪器】手套、称量纸、电子天平、250ml烧杯*1、500ml烧杯*1、100ml烧杯*2、50ml烧杯*6、玻棒*10、胶头滴管*4、200ml量筒*1、100ml量筒*1、1000ml容量瓶*3、100ml容量瓶*3，200ml棕色容量瓶*1、150ml容量瓶*1、恒温水浴锅、研钵*n、离心管*3n、10ml带塞试管*（n+1）、瓷盘、黑色塑料袋、黑色硬纸套、离心机、人工气候箱、分光光度计、比色杯*4、5ml移液枪、1ml移液枪、枪头、镊子、废液缸、和10ml小烧杯*（n+7）（n表示要做的样品数，x表示分X组比色）【实验药品】液氮、冰、Na2HPO412H2O、NaH2PO42H2O、甲硫氨酸、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、EDTA-Na2、核黄素、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）和去离子水【配制试剂】50 mmol/L pH7.8的磷酸缓冲溶液（PBS）（含0.1mmol/L EDTA）。（1） 磷酸缓冲液（母液）配制：磷酸A：0.2M Na2HPO412H2O： 71.64g 加水1000ml； 磷酸B：0.2M NaH2PO42H2O： 31.21g 加水1000ml。（2）磷酸A 228.75ml + 磷酸B 21.25 ml，加入EDTA-Na2 0.0372g；加水定容至1000ml。220 mmol/L甲硫氨酸：称甲硫氨酸3.2824g，用50 mmol/L pH7.8 PBS溶解定容至100ml（现用现配）。1.25mmol/L氯化硝基四氮唑蓝（NBT）：称NBT 0.1022g，用50 mmol/L pH7.8 PBS溶解定容至100ml避光保存。（现配现用）（称取时NBT的重量在0.102g-0.1025g之间均可，最好0.1022g）0.033 mmol/L核黄素：称0.00252 g用PBS溶解定容至200ml。（称取时核黄素的重量在0.0025g-0.0026g之间均可，最好0.0025g）低温避光保存，即用黑纸将装有该溶液的棕色瓶包好，三天内有效。（现配现用）【SOD提取】（1）将鲜叶剪碎混匀，称取0.5g（3份），放在研钵中，先用液氮研磨叶片，磨碎后加2 ml PH7.8的PBS，研磨后转移进离心管，加2+1ml清洗研钵。（2）4 下10000 r/min离心15min，上清液为样品提取液。放在冰上避光保存。【SOD 活性测定】 取5ml或10ml小烧杯 N+6只，N表示测定样品数，另外6只为对照，其中CK（小烧杯放在大托盘中，盘里放冰）：一个黑暗（空白对照）；一个照光；（为保证测定，黑暗和照光都3个重复比较好）（不加酶液，以缓冲液代替） 按照下表加入各溶液（加试剂前确认关灯，过程必须避光，在使用核黄素前必须避光）试剂管号最终浓度0-暗（暗对照管）0-光（光对照管）1（样品，3重复）磷酸缓冲溶液/ml4.14.14.05甲硫氨酸/ml0.30.30.313 mmol/L氯化硝基四唑蓝/ml0.30.30.375 mol/L核黄素/ml0.30.30.32.0 mol/L酶液/ml000.05CK用PBS液代替总体积5.05.05.0 将上述试剂混匀后，0-暗对照烧杯置于暗处（加入核黄素立刻用双层黑色硬纸套遮光），先调好人工气候箱的温度和光照再把0-光对照烧杯和样品一起置于4000 xl日光灯下反应20 min（要求各管受光一致，反应温度控制在25-35之间，温度高时时间缩短，温度低时可适当延长，视光下对照管的反应颜色和酶活性的高低适当调整反应时间）。 反应结束后，用黑布罩遮盖小烧杯终止反应，以0-暗对照管做空白，在560nm处测定吸光度值。【计算】SOD活性=（ACK-AE）*V/ACK*0.5*W*VtACK：照光CK吸收值AE：样品管吸收值V：样液总体积W：样品鲜重Vt:测定时样品用量SOD比活力=SOD总活力/蛋白质含量蛋白质含量单位为mg/gMDA含量测定(避光！)【配制试剂】 50 mmol/L pH7.8的磷酸缓冲溶液（PBS）20%三氯乙酸（TCA）：称20g三氯乙酸，用蒸馏水溶解并定容至100ml。可称30g三氯乙酸，用蒸馏水溶解并定容至150ml。0.5%硫代巴比妥酸（TBA）：称0.5g硫代巴比妥酸，用20%TCA溶解并定容至100ml。【MDA的提取】同SOD【MDA含量的测定】取上清液1.5 ml于10ml带塞试管中（对照管以1.5 ml蒸馏水代替提取液还是PH7.8PBS），加入0.5% TBA 2.5 ml，混合后于沸水浴上反应20min，迅速冷却后在30