毛细管气相色谱法测定牛奶中的甜蜜素1.doc

大理学院药学与化学学院本科毕业论文毛细管气相色谱法测定牛奶中的甜蜜素学生：张利刚指导老师：杨盛春 杨卫花论文指导教师单位:大理学院药学与化学学院实习单位：大理州质量技术监督局综合检测中心摘 要：甜蜜素是一种应用非常广泛的食品添加剂，食品安全对其添加使用有严格的要求，本实验探讨了毛细管气相色谱法测定牛奶中的环己基氨基磺酸钠的方法，环己基氨基磺酸钠在硫酸介质中与亚硝酸反应生成环己醇亚硝酸酯，经正己烷提取后，经RTX非极性毛细管分离检测，以不同浓度的环己醇亚硝酸酯对应的峰面积进行定量检测；该方法简便、准确，样品处理方法简单，方法精密度高。关键词：甜蜜素；牛奶；气相色谱法；毛细管柱Abstract: Sodium cyclamate is a very wide range of food additives, food safety add use strict requirements of the experiment was to investigate the method of capillary gas chromatography method for the determination of the milk cyclamic sodium, sodium cyclamiccy clohexanol nitrite ester reacts with nitrous acid in sulfuric acid medium by n-hexane extraction, separation and detection of non-polar capillary RTX qualitative and quantitative peak area corresponding to different concentrations of cyclohexanol nitrite ester; The method is simple, accurate and simple method of sample handling, high precision of the method.Key words: Sodium cyclamate; Milk;GC; Capillary column1.前言1.1牛奶牛奶是我们生活中最为常见的一种营养饮品，被营养学家称之为 “接近完善的食品”、“白色血液”。，其中所含有的营养几乎是全方面的。到目前为止，已经知道牛奶中至少有百种以上的营养物质12， 主要含有：水分、蛋白质、脂质、糖、脂溶性维生素、无机盐、色素、水溶性维生素、气体等。科学家相信牛奶中还有很多营养物质未被发现；牛奶中有优质的蛋白质。蛋白质以醇蛋白为主，其次还有乳白蛋白和乳球蛋白，这三种蛋白质都是生理价值高、 消化吸收率也很高优质蛋白质。喝牛奶的好处有很多，比如增强免疫力、补钙、美白等，这些都是喝牛奶的好处中的一部分。作为一类营养全面的理想食品，已成为人们日常生活中不可或缺的一部分。但与此同时人们也越来越关注乳制品的质量和品质，实时、快速、准确地检测牛奶及其制品成分和其他物质含量是 提高乳制品质量进行牛奶及其制品质量控制的首要条件11。近年来一系列粮食安全事件已经引起人们的注意，人们也越来越关注粮食的质量，实时、快速、准确地检测粮食成分和其他物质含量是提高粮食质量和进行质量控制的首要条件。1.2甜蜜素1.2.1甜蜜素性质甜蜜素又名环己基氨基磺酸钠结构式：C6H12NNaO3S，结构见下图图1 甜蜜素结构Fig.1 The structure of Sodium Cyclamate是一种新型的低热值人工合成甜味剂，英文名为Sodium Cyclamate，相对分子量为201.22,在高甜度甜味剂中，其甜度是最低的，甜度为蔗糖的3080 倍。从外观上看是白色针状、片状结晶或结晶状粉末，熔点约为170，水溶性100 g /L( 20) 。甜蜜素 10%水溶液呈中性( pH 值为6.5) ，对热、光和空 气稳定。加热后略有苦味。分解温度约为280， 不发生焦糖化反应。酸性环境下稳定，碱性时略 有分解。溶于水( 1 g /5mL) 和丙二醇( 1 g /5mL) ， 几乎不溶于乙醇、乙醚、苯和氯仿1。日前被广泛用作饮料、蜜饯、糕点等多种食品中其风味较自然，后苦不明显，热稳定性高，是不被人体吸收的低热能甜味剂。甜蜜素与糖精具有协同作用，价格低于天门冬酰苯丙氨酸甲酯，甜度高、热量低、不易发生龋齿、安全性高，在代谢过程中不受胰岛素的控制，不会引起肥胖症和血压升高，甜味纯正, 口味极似蔗糖, 无后苦味, 风味自然,适合糖尿病、肥胖症患者食用，溶解度高、甜味清爽、安全性高、稳定性好、健康超值等这诸多优点使得甜蜜素已成为目前中国食品行业中应用最多的一种甜味剂，广泛用于酱菜类、调味汁、糕点、配制酒和饮料等食品中21.2.2甜蜜素的发展及安全性甜蜜素虽是一种很好的甜味剂，但关于甜蜜素的安全性，至今仍无定论，甜蜜素甜蜜素在1937年被伊利诺伊大学的学生麦克尔斯维达（Michael Sveda）发现并申请了专利，美国于1949年将其用于食品，1958年，美国食品药品监督管理局(FDA:Foodand Drug Administration)将其列为工认的安全物质名单(GRAS)，1960年代工业生产并上市成为一般性代糖甜味剂，1969年美国国家科学院研究委员会收到有关甜蜜素：糖精的 10:1 混合物可致膀胱癌的动物实验证据，同年10月，美国国家科学研究委员会否决了甜蜜素在GRAS的地位。不久后英、日、加拿大等国随后也禁用。1982年, 世界卫生组织食 品添加剂专门委员会根据甜蜜素转换成环己胺的 比例以及两者分子量的差异, 计算出甜蜜素的无 作用量(NOEL) 为1058mg/kg, 进而得到每日最 大摄入量(ADI) 60mg, 并将其列入食品添加剂品种名单, 1984年7月美国科学技术委员会的研究结果, 又排除了甜蜜素 的致癌性，但其研究结果表明有致癌的可能性，故联邦法律到现在一直禁止甜蜜素用于食品3，我国已对食品中甜蜜素含量提出了明确的限量标准4。目前，虽然美、英、法、日等发达国家和地区禁用甜蜜素，但包括中国、欧盟、澳大利亚、新西兰在内的80多个国家和地区允许其作为非营养型添加剂使用，1986年，卫生部批准甜蜜素作为食品添加剂使用。同年，我国广东开始批量生产甜蜜素。20多年来，随着甜蜜素 应用范围和消费市场的扩大，甜蜜素消费量越来越大。现在，我国已成为全球最大的甜蜜素生产国和出口国。甜蜜素作为食品添加剂而被广泛使用的问题虽仍存在一些争议，但只要合理利用，科学管理，便可扬长避短，充分发挥其价值；因此，关注食品中甜蜜素检测对人类的健康显得尤为重要，尤其像牛奶这种营养价值高的饮品更需引起重视，建立甜蜜素的科学检测方法具有显著的重要性和必要性。1.3甜蜜素检测方法概述目前国内外食品中甜蜜素含量的检测方法主要有: 气相色谱法、比色法、薄层色谱法、高效液相色谱法、离子色谱法。5气相色谱法:为国标食品中环己基氨基磺酸钠的检测方法。该方法主要原理是试样与酸性介质中与亚硝酸钠反应。将甜蜜素转化为环己醇亚硝酸酯，以环己醇亚硝酸酯的浓度对应的峰面积测定样品中的含量，以保留时间、峰面积定量，需严格控制温度及酯化时间。比色法:因甜蜜素具有微弱的紫外吸收，故不可直接进行紫外检测，需要进行衍生化反应后才能通过紫外检测，常用的衍生化方法是重氮化和氯化，在酸性介质中环己基氨基磺酸钠与亚硝酸钠反应生成环己醇亚硝酸酯在与磺胺重氮化后与盐酸奈乙二胺偶合生成红色染料，在550nm波长下测定其吸光度，次方法也是国标GB/T 5009.97-2003的第二法。比色法操作简单，不需要安装大型仪器，故多为一般基层实验室检测较好的选择，但具有样品预处理较为繁琐、灵敏度不高等缺点。6薄层色谱法:提取试样进酸化处理后，用乙醚提取，将试样提取液浓缩，同时将试样提取液、标准溶液点于聚酰胺薄层板上，置于展开剂中展开10cm，取出自然挥干，经显色剂显色后，甜蜜素为黄色斑点，背景为蓝色，7试样中环己基氨基磺酸钠的量与标准斑点比较定量，该方法可定性，概略定量，且对操作者要求较高，实验步骤复杂，不适合用于用于精密的食品分析。因此目前运用较少。高效液相色谱法: 目前报道的高效液相色谱法测定食品中甜蜜素甜蜜素(环己基氨基磺酸钠)在强酸性环境中与次氯酸钠反应，生成N，N一二氯环己胺，后者在紫外区具有较大吸收，用正己烷进行萃取后经过高效液相色谱分离，314 nm检测定量8或用柱前衍生(常用试剂如次 氯酸钠、亚硝酸钠、2, 4, 6一三硝基苯磺酸) , 在反相柱中被不同洗脱剂洗脱, 用紫外、示差折光、质谱、间接光度法等检测器检测。9也有不少学者再次基础上改进以得到更为严谨的检测方法。液相色谱法要用到紫外和示差检测器串联以达到同时检测，操作不方便。离子色谱法: 离子色谱法(IC)是20世纪70年代发展起来的一种高效液相色谱法其原理是利用离子交换的方法对液体样品中的阴、阳离子进行交换分离，然后用电化学检测器或光学检测器检测分离后的离子组分，并根据检测色谱峰的保留值(保留时间)进行定性分析，根据样品离子和对照溶液的信号峰的峰面积进行定量分析目前，离子色谱技术已广泛应用于环境监测、化工、冶金、地质、水文：土壤、电子工业、食品饮料、临床化验等科学研究领域，9一般步骤为:准确称取一定量的样品与比色管中，加入一定量的去离子水，振摇溶解，超声浸提一段时间后，再加入一定量的沉淀剂(多为乙酸锌+亚铁氰化钾)，用水定容至刻度，摇匀，静置或离心分离，经滤膜过滤后进样分析。10目前气相色谱(GC)已经成为丰富多彩、灵活多变的分析化学方法，GC已经在许多分析实验室起着极为重要的作用，GC已成为一种成熟的分析技术，是一种高柱效、高峰容量及高灵敏度的分离分析方法，它可以使用多种灵敏的检测器，并可以和多种谱学仪器联用，以弥补其高分离功能、低鉴别能力的问题，因而广泛地用于石油、石化、环境、它能获得如此大的成就最重要的因素之一是柱工艺的发展14,在GC的发展历史上，一直以填充柱为重，后引入的毛细管气相色谱使GC得到了高柱效和高分离度，热稳定性好、玻璃化温度低、黏度高、化学惰性高、溶质渗 透性高、对分离对象有选择性好的产品15，本实验选用泽伯隆公司(Zebron)的ZB-WAX毛细管柱。2.实验部分2.1实验仪器101型电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗仪器有限公司)；AL204电子天平(METTLER TOLEDO仪器(上海)有限公司)；岛津GC-2010plus气相色谱(SPH-300氢气发生器，SPH-3空气发生器)(上海仪电分析仪器有限公司)；AS20500BDJ超声波清洗器；M37610-33CN涡旋器(Thermo Scientific)；LD4-2A离心机(北京医用离心机厂)；Direct-Q5超纯水净化系统(miliipore公司)；冰箱；滤纸；移液管；锥形瓶；2.2化学试剂甜蜜素标准品(Supelco公司，色谱纯)；氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)；正己烷(上海试四赫维化工有限公司)；硫酸(重庆川东化工集团有限公司化学试剂厂);乙酸锌(天津市博迪化工有限公司)；亚铁氰化钾(天津市化学试剂三厂)；亚硝酸钠(北京红星化工厂)，无水硫酸钠(上海试四赫维化工有限公司)以上试剂除标明外均为分析纯。市售某品牌甜牛奶2.3实验步骤2.3.1试样制备充分震荡混合均匀后准确称取20.0g(准确至0.0005)试样于100mL具塞比色管中，加入10mL蒸馏水后再加入100g/L乙酸锌溶液、32g/L亚铁氰化钾，然后用蒸馏水定容至刻度，充分混均，静置30min待蛋白质沉降完全后，用滤纸过滤，收集滤液至50mL或100mL锥形瓶，收集时弃去初滤液约5mL，收集滤液备用。2.3.2样品测定待上述滤液静置澄清后用10mL移液管吸取20mL滤液于100mL具塞比色管中，在向比色管中加入10mL蒸馏水。在比色管中分别加入50g/L亚硝酸钠溶液和100g/L硫酸溶液各5mL,充分混合均匀后放入冰箱(保持冰箱温度在0左右)30min，(高温导致反应过程中生成的HNO2 挥发分解而不能参与酯化反应，不利于环己醇亚硝酸酯在正己烷中的 溶解)期间并经常摇动。取出后立即用分液漏斗加入10mL正己烷和5mL氯化钠，漩涡器上充分震荡1min，静置，待有机相与水相分层后，有机层经无水硫酸钠脱水后用刻度较小的移液管吸取1.5mL-2.0mL有机相于进样瓶中，待气相色谱进样分析。检测条件：进样体积：1uL；毛细管柱：ZB-WAX；进样口温度：160.0；检测器：FID；柱温75；分流比:10；载气：氮气；线速度：23.6cm/sec；柱流量：0.8mL/min；H2流量：40mL/min；空气流量：400mL/min。2.3.3计算结果X=式中：X-样品中甜蜜素的含量，g/kg；m0-试样质量，g；v1-样品定容体积，mL；v2-所试样的体积，mL；10-正己烷加入量，mL;c-测定所得溶液的浓度，mg/mL。3.结果与分析3.1沉降剂用量的选择牛奶中含有酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白等多种蛋白质，蛋白质的存在会加剧酯化过程中的乳化现象，有机相与水相不易分层，实验前需净化样品，目前常用的净化方法有化学净化法、固相萃取法 (SPE)和凝胶渗透色谱法(GPC)等，其中Carrez(乙酸锌+亚铁氰化钾)试剂沉淀是化学净化法中较为常用的方法之一，实验发现，Carrez能很好的消除酯化过程中的乳化现象，去除样品基质的干扰，而且，Carrez试剂试剂不会在色谱分析中引入额外的杂峰，是一种广泛使用的沉降剂，本次实验探究了Carrez的使用量，分别准确称取20.0g(准确至0.0005)试样于6只100mL具塞比色管中，加入10mL蒸馏水后再加入100g/L乙酸锌溶液、32g/L亚铁氰化钾，Carrez沉降剂的依次分别为：0mL、1mL、3mL、5mL、7mL、10mL结果见表1，实验结果表明未加入Carrez沉降剂的样品不能沉降蛋白质，最终正己烷与水相也不能分层，有机相呈乳白色色无法进样测定，实验中以加入5mLCarrez最为合理，蛋白质沉降最彻底。提取液经涡旋离心后液体清澈，酯化过程不发生乳化现象，有机相与水相分层明显见图1，GC分析峰型较好见图2。图1 沉降效果比较Fig.1 Sedimentation effection图2 Carrez试剂量对结果的影响Fig.2 Effects of Carrez reagent amount on the detection resultsTab.1Carrez试剂量峰面积12575.232024.452844.772401.4102415.1表1 不同量Carrez试剂对应的峰面积Table.1 Carrez reagent amount correspond to peak area3.2酯化时间优化实验还对最佳酯化反应时间进行了探讨，准确称取20.00g的样品，用移液枪准确移取1.0mL1.0mg/m的甜蜜素标准品于上述样品中，按2.3.1步骤处理样品得到滤液静置澄清后用10mL移液管吸取20mL滤液于100mL具塞比色管中，在向比色管中加入10mL蒸馏水。在比色管中分别加入50g/L亚硝酸钠溶液和100g/L硫酸溶液各5mL，充分混合均匀后放入冰箱10min、20min、30min、40min、50min，取出后立即按2.3.2进行实验，以峰面积定量。实验结果见图3：实验结果表明，起初反应快速剧烈已得到大部分酯化中产物，所以，在反应之前做好先冷藏滤液后在加入亚硝酸钠和硫酸；之后反应缓慢增加到30min左右达最大，结果表明，反应进行40min后终产物也不在增加。因此，本实验选取0和酯化30min。图3 酯化时间对试验结果的影响Fig.3 Effects of time on derivatization reaction酯化时间峰面积103298203290303407.4403270.6503160.6表2 酯化时间对应的峰面积Table.2 The time of derivatization correspond to peak area3.3甜蜜素标准曲线分别取浓度为1mg/mL的甜蜜素标准品0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL于50mL比色管中，蒸馏水定容至20mL，按2.3.2的方法进行试验处理，经正己烷萃取后，正己烷中甜蜜素的浓度一次为0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.40mg/mL，移蒸馏水为参照，经GC分析后，以不同浓度的环己醇亚酸酯A对应的峰面积对甜蜜素标准品的浓度C(mg/mL)进行线性回归，试验结果见下图图4 甜蜜素标准曲线Fig.4 The standard curve of sodium cyclamate浓度/(mg/ml)峰面积0.0572110.1174670.2337850.466039从图中可以得出：线性回归方程Y = aX + b 其中：a = 165596.4，b = 201.65，R2 = 0.998，R = 0.9994；0.998以上的相关系数较为满意的结果。3.4检出限当信噪比=3时计，计算该方法的方法检出限为5mg/L(10mg/kg),远远高于国标中的4ug，根据进样量为1ul计算，对应的进出限为4g/L，说明此方法优于国标。方法检出限色谱图3.5回收率与精密度实验测定序号加标量/(mg/ml)测定值/(mg/ml)RSD/回收率/12.50.05411108.2222.50.0555011132.50.05000100450.11248112.25550.0984498.44650.0983798.374.结论实验后期萃取环己醇亚硝酸酯时选用氯化钠作为盐析剂，添加盐析剂可以增加物质的活度系数，降低待测组分环己醇亚硝酸酯在溶液中的溶解度13，从而使实验的准确度更高，本实验以添加5g氯化钠最为适宜；最后吸取正己烷(正己烷低毒操作时应在通风厨中进行且加戴口罩)层进样时，需待溶液静止分层，操作要小心，用移液管吸取上层有机层，不可吸入水相，体积约为进样瓶的2/3体积即可以免影响测定结果。5.展望本实验选取市场上常见的甜牛奶为样品，经Carrez沉降净化后，在硫酸环境中，和亚硝酸钠的衍生得到环己醇亚硝酸酯，最后用正己烷萃取经GC分析后，以甜蜜素对色谱峰面积的相应，测定甜蜜素的含量。此方法操作简便，稳定性好，适用于市场上个各种类型的牛奶分析检测，鉴于本人理论知识有限，个中确有不足之处，但我相信广大学者和科研工作者定会慢慢完善甜蜜素的测定方法，为食品安全提供有力的保障。参考文献1 程水连,吕革,王泽科等.气相色谱外标法测定食品中甜蜜素含量方法的改进J.食品与机械,2005,2(01)11-122 马建华,赵笑虹等.食品中甜蜜素的测定J.现在食品科技,2005(01)3 苏扬,张聪.甜蜜素及检测方法J,江苏调味副食品，2011(01)4GB/T 5009.97-2003食品中环己基氨基磺酸钠的测定S,北京:中国标准出版社，1997.5 刘波,甜蜜素检测方法研究进展J.中国食品添加剂,2007(2)6 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