云南薯蓣属植物矿质元素指纹图谱研究.docx

云南薯蓣属植物矿质元素指纹图谱研究 云南薯蓣属植物矿质元素指纹图谱研究 指纹图谱技术常用于食品、药品的质量控制及产地溯源1-2。目前应用于植物资源评价的指纹图谱技术主要针对有机化合物3-4；咖啡、小麦、水稻等物种的研究表明矿质元素及其含量可用于构建指纹图谱，辅助植物资源的评价研究5-8。周应群等采用电感耦合等离子体原子发射光谱法测定不同生产方式的甘草中16种矿质元素含量，通过指纹图谱分析，揭示矿质元素在不同甘草类型间的差异规律。Zheng等测定中国21种药用植物中Li、Mn、Ni等8种元素含量，进行药材矿质元素指纹图谱相似性分析，建立了药材质量控制的新方法。近年对杭白菊（Chrysanthemum morifolium Ramat）、 夏枯草（Prunella vulgaris L.）、铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）等物种的研究报道表明，矿质元素含量对药食同源植物的资源评价和开发利用具有重要意义11-13。 薯蓣属植物（Dioscorea L.）广泛分布于热带及温带地区，中国西南和东南部是其主要产区。中国薯蓣资源丰富，多数种类可供药用和食用，具有重要的经济价值。参薯（D. alata L.）、薯蓣（D. opposita Thunb.）、 日本薯蓣（D. japonica Thunb.）等在中国广泛栽培。其中，薯蓣具补脾养胃、生津益肺等功效，被中国药典2010版收录作为传统中药山药的植物来源。目前中国薯本文由收集整理蓣属植物资源评价研究主要集中于形态特征、分子系统学和化学成分含量16-18，关于薯蓣不同物种间矿质元素指纹图谱研究尚未见报道。本研究以产自云南的参薯、薯蓣、日本薯蓣等6种薯蓣为研究对象，采用火焰原子吸收分光光度法（FAAS）和原子荧光分光光度法（AFS）测定不同薯蓣地下块茎中Cu、Zn、Pb、Ni、Mg、Fe、Mn、As、Cd、Na和K等元素含量并构建元素指纹图谱，结合多变量分析展开薯蓣中矿质元素的评价研究。研究结果以期为薯蓣属植物资源的评价和安全食用提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 植物材料 样品信息见表1。参薯、薯蓣、日本薯蓣、毛胶薯蓣、云南薯蓣和高山薯蓣样品采集时间为2013年9月中旬至10月初，采集部位为植株地下块茎。云南薯蓣、毛胶薯蓣、高山薯蓣为野生样品，其余薯蓣均为栽培样品。样品共计10批（S 01S 10），采集地涉及云南滇中的玉溪市，滇西北的大理州和丽江市，滇东的曲靖市。每批测定样品均为10株个体的混样。鲜样采集后带回实验室，用去离子水洗净根部泥土，切片并放入60 烘箱中烘干至恒重，粉碎过100目尼龙筛，放入自封袋中避光保存 1.1.2 仪器和试剂 （1）仪器：火焰原子吸收分光光度计（TAS-990，北京普析通用仪器有限责任公司）；原子荧光分光光度计（AFS-3100，北京海光仪器有限公司）；万分之一分析天平（AR1140，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；控温电炉（DDL-4x1KW，金坛市金城国胜实验仪器厂）；高温马弗炉（SRJX-8-13，北京市永光明医疗仪器厂）；Millipore纯水系统（Milli-Q Academic，美国Millipore）。 （2）试剂：测定矿质元素Cu、Zn、Pb、Ni、Mg、Fe、Mn、As、Cd、Na、K所用标准溶液均购自济南众标科技有限公司；硝酸和盐酸为优级纯，购自西陇化工股份有限公司；高氯酸（优级纯）和硫脲（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司；去离子水用美国Millipore纯水系统自制。 1.2 方法 1.2.1 样品消解 （1）Cu、Zn、Pb、Ni、Mg、Fe、Mn、Cd、Na和K消解方法：称取样品4.000 g置于250 mL锥形瓶中，加入30 mL体积比为5 1的硝酸-高氯酸混合液，置于控温电炉上加热，待样品不再产生棕色气体时升高电炉温度，待瓶内溶液体积为1 mL时取下冷却，将溶液转移至比色管中，用去离子水定容至50 mL，摇匀备用，同时做空白实验。 （2）总砷（As）消解方法：称取样品2.000 g于50 mL瓷坩埚中，于电炉上碳化至无烟，移入550 高温马弗炉中灰化4 h，冷却后加入10 mL体积比为1 1的盐酸-水溶液溶解灰分，转移至25 mL比色管中，加入2.5 mL硫脲溶液，用体积比为1 9的硫酸-水溶液定容至25 mL，摇匀备用，同时做空白实验。 1.2.2 元素含量测定 待测样品中Cu、Zn、Pb、Ni、Mg、Fe、Mn、Cd、Na和K含量测定采用火焰原子吸收分光光度法（FAAS）。Cu含量测定参照GBT5009.13-2003；Zn含量测定参照GBT5009.14-2003；Pb含量测定参照GB 5009.12-2010的方法；Ni含量测定参照GBT5009.138-2003；Mg、Fe、Mn含量测定参照GB/T12396-2003的方法；Cd含量测定参照GB/T5009.15-2003；Na和K含量测定参照GB/T5009.91-2003；As含量测定采用原子荧光分光光度法（AFS），参照GB/T5009.11-2003。 1.2.3 回归方程 用硝酸和去离子水配置质量分数为2%的稀硝酸，将其作为11种矿质元素标准溶液的稀释剂。分别取适量Cu、Zn、Pb、Ni、Mg、Fe、Mn、As、Cd、Na和K的储备液，用稀释剂配制不同浓度的标准溶液。以吸光度A对浓度c（μg/50 mL）作回归方程，r2值、线性范围和检出限见表2。 1.3 数据分析 依据矿质元素含量测定结果建立1个np的数据矩阵用于指纹图谱分析，其中n=10，代表不同产地10批薯蓣样品；p=11，代表用于构建薯蓣样品指纹图谱的11种矿质元素含量信息。数据矩阵具体表示如下： Xi和Yi为2个指纹图谱间的元素含量，和 为元素平均值。m为元素的个数。 聚类分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）用于不同产地薯蓣属植物矿质元素含量的分类与描述；主成分分析（Principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法（Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）及变量投影重要性准则（Variable importance for the projection，VIP）用于筛选特征元素和导致样品间差异的主要元素变量。相似性分析、聚类分析和主成分分析用软件SPSS 19.0完成，偏最小二乘法及变量投影重要性准则用软件SIMC-P 11.5完成。 2 结果与分析 2.1 加标回收率 为考察方法的可靠性，精密称取已知含量样品（S 02）6份，分别加入适量标准溶液，依照1.2.1的方法制成供试溶液，进行6次加标平行测定，计算加标回收率和相对标准偏差（RSD%）。表3显示11种元素加标回收率在94.75%101.80%之间，RSD数值介于1.10%4.98%之间，方法稳定可靠。 2.2 薯蓣矿质元素指纹图谱的建立 6种薯蓣属植物中矿质元素绝对含量测定结果见表4，所有样品中均含有Cu、Zn、Pb等11种矿质元素，11种矿质元素在6种薯蓣属植物根茎中平均含量由大到小为：Fe Mg Na Zn K Cu Mn Ni Pb Cd As。不同样品间，As绝对含量变化最大，最大值为最小值的55.13倍；其次为Fe、Ni和Mn，最大值分别为最小值的31.51、25.83、20.77倍；K，Cu和Zn含量变化较小，最大值分别为最小值的1.79、2.34、3.38倍。 以矿质元素百分含量为变量，研究6种薯蓣属植物中矿质元素构成变化（图1）。结果显示，Fe元素含量占11种矿质元素总含量的25.72%至89.86%。云南薯蓣和日本薯蓣中Mg元素百分含量均低于6.00%，其余样品均高于19.00%。As元素百分含量在所有元素中最低，除样品S 06和S 07外，其余样品百分含量均低于0.01%。Cd百分含量介于0.02%至0.69%之间，Pb元素百分含量介于0.06%至0.66%之间；大部分样品Ni元素均低于1.00%；以上3种元素在薯蓣属植物中的构成比例均处较低水平。Na和Cu在高山薯蓣中百分含量最高（分别为10.65%和4.39%），Mn元素在采集自玉溪的参薯中百分含量最高（10.88%），高山薯蓣中Cu、Zn、Pb、Mg、Mn、Cd和Na百分含量在所有样品中均处较低水平。 2.3 相似性分析与聚类分析 相似性分析用于研究不同薯蓣样品矿质元素指纹图谱的相似性，Pearson相关系数显示（表5）：S 01：S 02，S 01：S 05，S 01：S 06，S 01：S 07，S 01：S 08，S 01：S 09的Pearson系数均大于0.900；S 01：S 04的Pearson相关系数为0.723；S 01：S 03与S 01：S 10的Pearson相关系数较接近，分别为0.551和0.565。夹角余弦法亦得到类似的结果（表6）。以各元素绝对含量及百分含量为变量进行聚类分析，结果显示聚类分析与相似性分析结果一致（图2），相互支持。结合以上分析结果可知，10批薯蓣样品可分成3类，S 01、S 02、S 05、S 06、S 07、S 08和S 09的矿质元素含量及构成较接近，可归为第一类；样品S 03与S 10可归为第二类；样品S 04单独归为第三类。 2.4 薯蓣类矿质特征元素和样品间主要元素变量的筛选 采用主成分分析对数据进行标准化处理，并对样品中的特征矿质元素进行研究。由表7可知前4个主成分累计贡献率达84.47%。第一主成分特征值为10.36，代表矿质元素在植物中的构成比例，包括Cu、Zn、Pb、Ni、Mg、Mn、Na和K的百分含量信息；第二主成分特征值为3.80，主要为Ni、Fe、Mn和As的含量信息；第三主成分特征值为2.49，主要反映Zn、Pb、Mg和Cd的含量信息；第四主成分特征值为1.92，反映As在植物中的元素含量构成信息。50%以上总方差来自前4个主成份，因此Cu、Zn、Pb、Ni、Mg、Fe、Mn、As、Cd、Na和K为6种薯蓣属植物的特征元素。 为进一步明确不同特征元素对样品间元素指纹图谱差异性贡献的大小，采用偏最小二乘法分析，计算变量VIP数值，结果显示（图3）Mg、Pb、As、Mn、Fe、Na的绝对含量与Mg、Fe、Cu、K、Zn的百分含量的VIP数值均大于1，以上变量对不同薯蓣样品间元素指纹图谱的差异性影响最大。 3 讨论与结论 3.1 矿质元素指纹图谱结合多变量分析可对样品指纹图谱信息进行定量评价和分类描述 Pearson相关系数和夹角余弦均可用于薯蓣样品元素指纹图谱的相似性分析。所有样品依据Mg、Pb、As、Mn、Fe、Na的绝对含量与Mg、Fe、Cu、K、Zn的百分含量可分为3类。第一类包括薯蓣、参薯和高山薯蓣，其块茎中Mg、Cu、Zn和K构成比例较高是该类薯蓣的主要特征元素。第二类植株块茎中Fe和As含量较高，包括云南薯蓣和日本薯蓣。第三类即毛胶薯蓣植株块茎中Fe、Mn、As含量均明显高于其它薯蓣。同属植物盾叶薯蓣（D. zingiberensis）和穿龙薯蓣（D. nipponica）块茎中矿质元属的积累变化研究表明，薯蓣块茎中富集特定元素，对K、Zn、Fe等元素的吸收量大于农作物，且元素含量与土壤中矿质元素含量相关性不显著20-21。本研究显示，相同产地的薯蓣样品并未完全聚为一类，6种薯蓣属植物矿质元素指纹图谱的相似性受物种的影响较大。 3.2 不同矿质元素在薯蓣属植物块茎中的累积呈现不同规律 李凤霞等测定了199种中药中41种元素含量，本研究结果与该文献报道对比发现，参薯、薯蓣、日本薯蓣、毛胶薯蓣、云南薯蓣和高山薯蓣中Cu、Zn和Pb的元素含量与199种中药的平均含量较接近，毛胶薯蓣与云南薯蓣的Fe含量高于199种中药的平均值，其余薯蓣样品Fe、Mg、Mn、As和K的含量均低于其平均值，产自云南玉溪的薯蓣和参薯的Ni含量高于199种中药的平均值，产自云南丽江和大理的薯蓣与产自玉溪的云南薯蓣、毛胶薯蓣、高山薯蓣Ni含量则低于其平均值。以上对比结果表明毛胶薯蓣与云南薯蓣对Fe元素的需求量较其它药用植物大，而Ni元素在薯蓣块茎中的积累可能受产地和植物吸收特性的共同影响。 3.3 薯蓣属植物块茎中矿质元素计量特征 Fe和Mg是6种薯蓣中的主要矿质元素，其中Fe元素在日本薯蓣、云