分光光度法测定茶叶中多糖含量.doc

中国药科大学成人教育学院毕业设计（论文）1绪论1.1 茶多糖的结构与功能茶多糖是茶叶中极具开发价值的一种生理活性物质，是一种酸性糖蛋白,并结合有大量的矿质元素，称为茶叶多糖复合物，简称为茶叶多糖或茶多糖（Tea Polysaccharide）。其是蛋白部分主要由约20种常见的氨基酸组成，糖的部分主要由阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖等，矿质元素主要由钙、镁、铁、锰等及少量的微量元素，如稀土元素等组成。现代药理研究证实，茶多糖具有降血糖、降血脂、降血压及减慢心率、耐缺氧的作用，同时茶多糖在抗凝血、防血栓形成、保护血相和增强人体非特异性免疫功能方面均有明显效果1。1.2 茶多糖测定的现状茶叶中多糖含量的测定对于提取茶多糖所用原料的选择及茶多糖提取工艺提取率高低的评价都具有重要的意义。汪东风等2研究表明对同一品种的红茶和绿茶，均为六级茶，茶多糖的含量，红茶为0.85 0.10 ，绿茶为1.41 0.06 ，但该研究是以葡萄糖作标准曲线，而实际上如王丁剐3、汪东风4等报道，茶多糖是由阿拉伯糖、核糖、木糖、甘露糖、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖等组成的杂多糖，其具体的单糖组成与茶叶的品种有关。而不同的单糖与蒽酮硫酸试剂显色情况不同，不同单糖标准曲线的斜率不同，因而仅采用葡萄糖做标准的测定结果，会存在一定的误差，结果比实际含量偏低。1.3 本文研究内容本文用精制茶多糖测得茶多糖对葡萄糖的换算因子，然后将经前处理除杂后的茶样用水提取，蒽酮一硫酸法比色测定，对江西婺源不同茶场茶叶中多糖的含量进行了测定，并与其它产地、品种的茶叶进行了比较。2 实验部分2.1 实验仪器与材料2.1.1 实验仪器分光光度计，电子天平，水浴锅，旋转蒸发仪，真空干燥箱，离心沉淀机；2.1.2 实验试剂蒽酮、浓硫酸、无水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、正丁醇，以上试剂均为分析纯；2.1.3 实验原料江西婺源红碎茶、绿茶、分宜绿茶、福建安澳乌龙茶。2.2 实验方法2.2.1 实验原理 选用精致茶多糖测得茶多糖对葡萄糖的换算因子，然后将经前处理后的茶样用水提取，蒽酮硫酸法比色测定，对不同茶场茶叶中多糖的含量进行测定。 2.2.2 茶叶多糖的提取与精制5、6称取已干燥的40目茶叶粉末20g，置索氏提取器中，加入石油醚(沸程60C一90C)lOOml，90C 回流提取1h脱脂，抽滤，滤渣挥干溶剂后加80乙醇200ml，90C水浴回流lh，重复提1次，双层滤布过滤，滤渣加400ml蒸馏水，沸水浴回流提取1h，间歇搅拌。双层滤布过滤，滤渣加200ml蒸馏水，沸水浴再回流提取1 h，间歇搅拌，过滤，合并两次滤液，离心分离(400Or/min，10min)，真空浓缩(60C ，50r/min，真空度0. 095Mpa)至20ml,Sevage法除蛋白，反复进行三次至无蛋白层，然后用流动自来水透析48h，蒸馏水透析24h，透析液中加人无水乙醇使乙醇浓度达80 ，于4C冰箱中过夜醇沉，再离心分离(400Or/min，10min)，沉淀依次用无水乙醇 丙酮、乙醚各洗两次，真空干燥(45C，0.095Mpa)至恒重，即得精制茶多糖。称重，计算得率，备用。2.2.3 标准曲线的绘制7、82.2.3.1 标准溶液的配制精密称取105C干燥至恒重的葡萄糖标准品0.2508g，置于250ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，配成1.O03mg/ml的标准溶液，然后分别提取2.5ml、5ml、lOml、15ml、20ml标准溶液，置于100ml容量瓶中稀释至刻度，摇匀，配成系列标准溶液。2.2.3.2 蒽酮一硫酸试液的配制称取0.33g蒽酮，加100ml浓硫酸，置于棕色瓶中，混合摇匀置于冰箱中(现配现用)。2.2.3.3 吸光度的测定分别准确移取lml系列标准溶液于具塞试管中以lml蒸馏水作空白，每管再加入4ml蒽酮硫酸试液，立即摇匀，置于冰水浴中，然后一起置于沸水浴中加热7min之后用流动自来水迅速冷至室温，放置10min后，于62Onm处测定吸光度。以吸光度(A)对葡萄糖浓度(C)作回归处理，得回归方程：C=-0.00253+0.317A，r=0.9993。2.2.4 换算因子的测定精密称取45C真空干燥至恒重的精制茶多糖10mg，置于25m1容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，90C水浴加热超声1min增溶摇匀，制得茶多糖贮备液蒽酮一硫酸比色法测定其吸光度(A)，由回归方程求出此精制茶多糖贮备液中葡萄糖浓度，测得其葡萄糖含量，按下式计算换算因子。因茶多糖干燥后溶解性降低故按2.2.2中的方法制得多糖透析液后取等量10ml透析液两份经醇沉洗涤后，一份直接加蒸馏水溶解(复水性好)，定容，比色，测定多糖含量, 另一份真空干燥至恒重，称得精制茶多糖的干重，由二者计算平均换算因子。换算因子f=W/(CD) (11)式中：W为称取多糖的重量(mg)，C为精制茶多糖贮备液中葡萄糖浓度（mgm1)，D为多糖的稀释因素。再按上法测定婺源红碎茶、分宜绿茶、福建安溪乌龙茶的换算因子f。2.2.5 样品中茶多糖含量测定2.2.5.1 样品溶液的制备精密称取40目茶粉1g，加80乙醇40ml，95C水浴回流l h，趁热抽滤，滤渣用80 热乙醇洗涤(10ml x 2)。蒸干溶剂后，滤渣连同滤纸置于烧瓶中，加100ml蒸馏水,100C水浴浸提1h，趁热过滤，滤渣用热蒸馏水洗涤(1Omlx2)，合并滤液，离心分(4OOOr/min,10min)，上清液置于100ml容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。2.2.5.2 茶多糖含量测定精密吸取2.2.5.1 所得样品溶液lml于具塞试管中，按照2.2.3.3下的方法测定吸光度(A)，由回归方程计算供试液中葡萄糖浓度(C)，按下式计算样品中茶多糖含量。多糖含量()=CDfW100 (12)式中：C为供试液中葡萄糖浓度(mg/m1)，D为多糖的稀释因素，f为换算因子，w为供试茶样的重量(g)。2.2.6 重现性试验精密称取4份40目江西婺潭大鄣山五级绿茶粉各1g，按照2.2.5.l下的方法同时制取4份样品溶液。精密移取各样品溶液各lml，分别置于具塞试管中，按照2.2.3.3下的方法测定吸光度（A)，计算茶叶多糖含量。2.2.7 稳定性试验精密吸取按2.2.5.1中样品溶液制备方法制取的江西婺源大鄣山五级绿茶提取液1ml于具塞试管中，按照2.2.3.3下的方法测定吸光度(A)，每隔1h测定1次，连续4h考察其稳定性。2.2.8 加样回收率测定精密称取4份40目江西婺源大鄣山五级绿茶粉各1g，加入精制茶叶多糖约20mg，按2.2.5.1样品溶液的制备和2.2.3.3下的测定方法操作测定吸光度，据2.2.6节的结果，该绿茶中多糖的平均含量为5.23 ，计算回收率。2.2.9 不同茶叶中多糖含量的比较精密称取粉碎成40目的各种茶样1g，各3份，按2.2.5.1样品溶液的制备和2.2.3.3下的测定方法操作，测定吸光度(A)，从回归方程中计算供试液中葡萄糖浓度(C)，据式(11)和式(12)计算出样品中多糖的含量。2.3 实验结果(1)精制茶多糖的得率以40目江西婺源大鄣山五级绿茶粉20g制得精制茶多糖3.6230.849g 得率为18.1 O.4(n=2)。(2)换算因子：对江西婺源大鄣山五级绿茶将真空干燥的多糖溶于水，测得换算因子f=4269；利用等体积多糖提取液，醇沉洗涤后，一份直接加蒸馏水溶解，另一份真空干燥至恒重，测得换算因子f=4.267，则f=4.268。其它茶叶的换算因子f见表1表1 不同茶叶品种的换算因子茶叶品种婺源红碎茶婺源绿茶分宜绿茶福建安溪乌龙换算因子f3.9614.2684.2204.272(3)重现性：以江西婺源大鄣山五级绿茶为样品测定茶多糖含量，检验此测定方法的重现性，结果见表2,RSD=1.69 ：表2 茶多糖含量测定重现性试验结果样品号1234多糖含量(%)5.285.335.135.19(4)稳定性 测定结果见表3表3 茶多糖含量测定稳定性试验结果时间(h)01234吸光度(A)040204040.4020.4000.4O1(5)加样回收率：以江西婺源大鄣山五级绿茶为样品测定加样回收率，结果见表4。表4 加样回收率测定结果(n=3)取样量(g)原含量(mg)加样量(mg)吸光度(A)测定量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)1.02552.4619.70.54071.9899.11.003052.4818.20.52770.2199.499.21.801.821.012152.9620.20.55073.36101(6)不同茶叶中多糖含量的比较：测定所采集的茶叶样品中多糖含量的结果见表5表5 不同茶叶中多糖含量的比较(n=3)产地品种等级海拔(m)含量(%)RSD(%)婺源古坦红碎茶(CTC)统4003.5290.0511.43婺源段莘红碎茶(CTC)统8003.0980.0481.53婺源鄣山车炒青绿茶三级4004.6180.1423.08婺源鄣山车炒青绿茶五级4005.2330.0881.69婺源浙源绿茶特级8006.3510.1842.90婺源段莘青山炒青绿茶三级8004.1740.0713.11婺源大鄣山顶绿茶特级16005.1390.1112.17婺源(市售)绿茶五级5.5140.0581.05江西分宜绿茶茶末4.6000.1082.34福建安溪乌龙茶三级7.0230.0430.623 总结童小群等8研究发现用蒽酮比色法测定茶叶中的可溶性糖时，茶叶可溶性蛋白质中的色氨酸、半胱氨酸会产生干扰，生成棕褐色的络合物，此外，茶多酚与蒽酮一硫酸试剂反应后在620nm处也有吸收。若直接测定，提取液与蒽酮硫酸反应显色后为棕褐色，测定结果偏高。在茶叶提取液中加人一定数量的饱和碱式醋酸铅可除去这两种物质，多余的碱式醋酸铅用饱和Na2SO4沉淀除去。故采用此法测定总糖。但我们采用此法测定时发现，由于过滤时滤纸及加醋酸铅生成的沉淀会吸附一部分多糖，致使测定结果偏低，回收率也较低；干抗物质不易完全除去,费时,重现性也不好；而且测定结果为总糖。本实验多糖的含量测定的原理是先用80乙醇回流提取以除击单糖、双糖、低聚糖、甙类、生物碱、茶多酚、氨基酸及醇溶性蛋白等干扰性成分，从而不必用饱和碱式醋酸铅除去杂质，然后用水提取其中所含的可溶性多糖。多糖类成分与硫酸起反应，脱水生成羟甲基糖醛，其与蒽酮缩合成蓝色化台物，其颜色深浅与糖的浓度成正比。经本实验发现，此法简便，且供试液在4h内显色稳定，重现性较好。 资料表明，江西婺源绿茶中多糖含量在4.17 6.35之间，两种CTC红碎茶多糖含量分别为3.10 和3.53。福建安溪三级乌龙茶中多糖含量为7.02 。汪东风等2测定某同一品种的六级红茶、绿茶和乌龙茶的荼多糖含量红茶为0. 85 0.l0 ，绿茶为1.43 O.06,乌龙茶为2.630.27。其测定结果较本实验有较大差异，原因是该实验以葡萄糖作标准曲线，未乘以换算因子。因为组成多糖链的单糖种类不同，它们在浓硫酸下脱水的难易程度、脱水产物的结构和稳定性以及其与蒽酮互变异构体的显色情况均存在差异，不同单糖的标准曲线的斜率不同，因而采用葡萄糖做标准的测定结果，必然会存在一定误差。董群9等用杂多糖或寡糖的组成单糖相对于葡萄糖的校正系数及组成单糖的重量百分含量计算杂多糖或寡糖的校正系数，从而以葡萄糖为标准测定组成已知的杂多糖或寡糖的含量，但此方法要求知道杂多糖的准确组成。当然也可采用与杂多糖组成相同的混合单糖制作标准曲线，但这样较繁琐。本实验用精制茶多糖计算换算因子，一方面避免了用葡萄糖做标准引起的系统误差，另一方面较之据杂多糖组成计算校正系数或用与杂多糖组成相同的混台单糖制作标准曲线简便，而且由于组成上与待测样最接近，结果较真实。实验结果表明，茶叶中多糖的含量与品种、等级、生长海拔、产地等因素有关：对同一产地、品种的茶叶，等级越低，茶叶越粗老茶多糖含量越高；对同一等级、产地、品种的茶叶，茶树生长海拔高度越低，茶多糖含量越高。参考文献1严鸿德等主编茶叶深加工技术北京：中国轻工业出版社19988186.2汪东风等.粗老茶治疗糖尿病的药理成分分析.中草药，1995.26(5):2552573王丁刚等茶叶多糖的分离、纯化、分析及降血脂作用中国药科大学