利用木糖生产乙醇菌株的筛选与鉴定.doc

发酵木糖生产乙醇菌株的筛选与鉴定胡海军 梁运祥 葛向阳*（华中农业大学 农业部微生物学国家重点实验室 发酵工程研究室，武汉 430070）摘要：从花圃土和腐朽树皮中各筛选得到一株可以发酵木糖产生乙醇的菌株。乙醇产量分别可达到6.98g/L和6.05g/L。经过18S rDNA同源性的分析，菌株3鉴定为间型假丝酵母（Candida intermedia），而菌株621则为热带假丝酵母（Candida tropicalis）。对其发酵木糖、葡萄糖和混合糖的产物蒸馏后用气相色谱分析，主产物为乙醇，纯度高，副产物少。两菌株为下一步的菌种基因改造工作提供了研究基础。关键词：木糖；乙醇；中型假丝酵母；热带假丝酵母中图分类号： 文献标识码：文章编号：Strains Collection for Produce Ethanol by Xylose-Fermening Haijun Hu, Yunxiang Liang, Xiangyang Ge* (Fermentation Engineering Research Laboratory, State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, P.R. China)Abstract : Two strains of yeast respectively isolated from garden soil and rotten cortex could effectively produce ethanol from xylose in 6.98 g/L and 6.05 g/L yield. Through 18S rDNA sequence analysis, one strain No.3 is characterized as Candida intermedia and the other strain No. 621 shows highly identical with Candida tropicalis. Results of Gas Chromatography analysis to the distilled products fermented from xylose, glucose or mixture of them，showed these two strains have high efficiency production of ethanol in all of them，which could be used as orginal strains for further genic alteration work. Keyword: Xylose; Ethanol; Candida intermedia; Candida tropicalis前言石油储备与消耗的现状，迫使人们寻找乙醇作为替代品。为了避免粮食与燃料之争，乙醇发酵的原料逐渐转向了以农林业废弃物为主的纤维质原料。这些农林业废弃物资源丰富，是变废为宝的可再生性原料。纤维质原料主要由纤维素、半纤维素和木质素等组成。通过生物、物理化学等单一或联合的方法进行逐步的降解1。纤维素的降解产物中六碳糖（葡萄糖、半乳糖和甘露糖）约占2/3，五碳糖（D-木糖和L-阿拉伯糖）约占1/3。而半纤维素的水解产物中D-木糖高达90%2。众所周知，六碳糖可通过酿酒酵母Saccharomyse cerevisiae等发酵产生乙醇。而五碳糖的利用，则成为纤维质原料转变成为可利用性能源的关键问题。为了发酵D-木糖，人们试图从自然界中寻找微生物资源，目前已筛选到毕赤酵母Pichia stipitis、丝孢酵母Trichosporon sp.、管囊酵母Pachysolen tannophilus3和耐热甲基营养酵母Hansenula polymorpha4等微生物。其中P. stipitis NRRL Y-7124木糖发酵的研究最为广泛和深入，已经成功地用于发酵麦秸和水葫芦等纤维质原料生产乙醇5、6。P. stipitis的全基因组已经被测定，与木糖代谢的有关基因已经被克隆并导入到S. cerevisiae中，用于工程菌的构建7。并且对S. cerevisiae 424A工程菌株的生长动力学和在不同培养基上的乙醇产率等进行了详细的阐述8。工程菌株S. cerevisiae 259ST还被运用于处理亚硫酸纸浆废液生产乙醇9。同时也有用大肠杆菌Escherichia coli KO11构建重组菌株来进行木糖发酵的研究10。为了在发酵中同时利用五碳糖和六碳糖，休哈塔假丝酵母Candida shehatae 和S. cerevisiae被用于混合发酵的研究中11本文的研究目的是寻找新的高效发酵木糖野生菌株，利用分子生物学的方法对其特性和种类进行鉴定，为下一步的菌种改造工作提供了研究基础。在不同类型的发酵研究中，利用气相色谱（Gas Chromatogram，GC）等先进的检测手段，对乙醇的产生进行了定性和定量的分析。1. 材料与方法1.1 培养基：固体斜面培养基：木糖20 g，蛋白胨5 g，酵母汁浸膏3 g，琼脂粉20 g，水1000 mL。筛选培养基：木糖80 g，蛋白胨5 g，酵母汁浸膏3 g，水1000 mL。发酵培养基：木糖2080 g（葡萄糖2080g，木糖和葡萄糖各40g），蛋白胨5 g，酵母汁浸膏3 g，水1000 mL。115 灭菌30分钟。1.2 菌种1.2.1 根据自然界中戊糖可能的存在状况，选择了样品来源。样品来源于花圃土、菜园土、山林土、腐朽树皮、竹叶、竹林土。如果直接稀释分离，可能会遗漏数量不占优势的微生物。本次筛选就采用先富集，后分离纯化的顺序。取花圃土若干于磁盘，将切碎的玉米芯埋置其中，原位富集14天后取样。其他样品直接取样。取样品各10g，放入装有90 mL无菌水250 mL三角瓶中。120 rpm 30 min。取0.2 mL涂布平皿，每个样品3个平行。从上述平皿中挑选典型菌落，再通过平皿进行分离纯化。1.2.2 实验室保藏的酵母菌种19株。1.3 发酵试验：按照10%接种量将培养好的菌种，接种到装有90 mL发酵培养基250mL三角瓶中。摇床转速为120 rpm，温度为281 ，发酵72 h。1.4 检测方法：1.4.1 糖度检测：DNS法12。1.4.2 乙醇含量检测：筛选时先对发酵液进行蒸馏 13，蒸馏样品再使用重铬酸钾-比色法14检测；定性时用GC检测，GC检测条件为：GC-9A气相色谱仪（岛津公司）；色谱柱为SUPELCO公司WAX-10，FUSED SILICA CAPILLARY COLUMN（石英毛细管柱），30 m0.32 mm 0.25m（长度内径膜厚）；柱温80 ；检测器FID；检测器温度200 ；进样口温度200 ；载气N2，流量20 mL/min；分流比1:6；尾吹气N2，流量20 mL/min；进样量1 L。1.5 菌种鉴定：引用第三版分子克隆实验指南中的方法，使用苯酚-氯仿-异戊醇（Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol=25:24:1）提取菌体的总DNA后，对所提取的菌体总DNA进行18S rDNA的PCR扩增。PCR扩增反应的使用的引物为一对通用引物，正向引物为EF3（5-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3），反向引物为EF4（5-GGAAGGGRTGTATTTATTAG -3）。将文献15的方法进行改进，PCR反应体系（50 L）为：无菌超纯水30.5L，5PCR缓冲液5L，dNTP 2L， 两个引物（10mol）各2L，DNA模板1L，Taq DNA酶0.5L。PCR反应条件：95 预变性3 min，95 变性 1 min，48 退火1 min， 72 延伸2 min，共30个循环，最后72 延伸5 min。将PCR产物送Takara公司检测。测序结果先使用BioEdit软件进行分析，然后使用DNAstar软件进行处理后，在Genbank数据库进行Blast比对。1.6 菌种保藏：40%甘油管保存16。2 结果与分析2.1筛选结果：筛选培养基中没有添加抗生素，目的是期望把在木糖培养基上可生长的微生物都筛选出来。筛选得到的菌株酵母占多数，细菌占少数。从样品中筛选得到118个菌株。从来源分布来分析，山土、竹林土等自然状态样品中的微生物种类和数量比玉米地、水稻田等耕作地块中的要丰富。人为的劳作对微生物存具有很大的影响。根据菌株在平板上菌落的形态特征，结合水浸片镜检观察结果，把具有典型酵母形态的菌株进行菌种保藏后，进入后续的发酵试验。具有典型细菌形态的菌株进行甘油管保藏。这些细菌可以在只含有木糖为碳源的培养基上生长，表明它们存在着发酵木糖的可能性，可能应用于今后的研究工作。2.2 发酵结果：2.2.1 筛选过程的发酵结果：将实验室保藏的酵母，与分离得到的菌株一起进行发酵试验。经过初筛，得到35株乙醇产量相对比较高的菌株；对这35个菌株再进行了相同条件的复筛。分析筛选结果中，乙醇产量低于1.00g/L的菌株数量和高于4.00g/L的菌株数量比较少，大部分菌株的乙醇产量都在1.004.00 g/L之间。结果如下表1： 表1：35个菌株发酵实验的乙醇产量范围分布统计 （g/L）Table 1 Range Stat. for Ethanol Yield of 35 Strains Xylose-ferment （g/L）范围菌株数量范围菌株数量1.0063.004.0041.002.00114.005.0012.003.00125.0012.2.2分析筛选结果的同时，我们发现菌株3和菌株621对木糖的发酵能力相对与其他的菌株高而且稳定，而且有逐步提高的趋势，可能跟传代过程中的驯化作用有关。使用与筛选不同的培养条件，在4%木糖，0.5%蛋白胨和0.3%酵母汁浸膏的培养基上，菌株3的乙醇产量可以达到6.98g/L。菌株621在5.3%木糖，0.5%蛋白胨和0.3%酵母汁浸膏的培养基上的乙醇产量可以达到6.05 g/L。所以我们选择这两个菌株进行18S rDNA菌种鉴定。2.3不同糖的发酵产物分析：使用GC法分析了2个菌株分别发酵碳源为木糖（4%）、葡萄糖（4%）和混合糖（8%）（木糖与葡萄糖1:1）培养基的蒸馏产物。从得到的图谱，可以判定菌株3和菌株621发酵上述液体培养基上的蒸馏产物在GC色谱分析中的保留时间与乙醇一致，可以定性为乙醇；从图谱的积分面积分析，乙醇峰面积占到了98.67%99.43%；相对应的杂峰面积总和占总面积的1.33%0.57%。发酵液蒸馏产物的纯度高，副产物种类少，数量少。这个特性可以为工业生产的后处理减轻压力。图1：菌株3发酵木糖（4%）的产物图谱 图2：菌株3发酵葡萄糖（4%）的产物图谱Fig 1: Product fron strain No.3 ferment 4% xylose Fig 2: Product from strain No.3 ferment 4% glucose图3：菌株3发酵混合糖的产物图谱 图4：菌株621发酵木糖（4%）的产物图谱Fig 3: Product fron strain No.3 ferment 8% mixture Fig 4: Product from strain No.621 ferment 4% xylose图5：菌株621发酵葡萄糖（4%）的产物图谱 图6：菌株621发酵Mix的产物图谱Fig 5: Product fron strain No.3 ferment 4% glucose Fig 6: Product from strain No.3 ferment 8% mixture2.4菌株3和菌株621的菌种鉴定结果：18S rDNA是编码真核生物染色体的核糖体小亚基RNA的基因 17。在生物进化过程中，18S rRNA的功能保持不变。其分子的排列顺序，有高度保守序列区域，也有中度保守和高度变化的序列区域。适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究18。18S rDNA序列分析中，菌株3与Candida intermedia具有高度的一致性， Max ident值为99%。Candida intermedia的中文名称是间型假丝酵母19，或中型假丝酵母20。Candida intermedia 拥有一个特殊的木糖转运系统21。另外该菌与解脂假丝酵母（Candida lipolytica）混合接种时，可以分别氧化高碳腊中的C15-28和柴油中的C15-28的正烷烃类20。这个特性为被泄漏原油污染地区的生物修复提供了一个可能的方向。菌株621与Candida tropicalis具有高度的一致性， Max ident值为99%。Candida tropicalis中文名称是热带假丝酵母19、20。热带假丝酵母的很多种有酒精发酵能力20、22。3. 结论经过筛选，得到35个可以利用木糖生产乙醇的菌株，其中2个高产菌株的乙醇产量分别可以达到6.98g/L和6.05g/L。经过18S rDNA的菌种鉴定，菌株3为中型假丝酵母（Candida intermedia），菌株621为热带假丝酵母（Candida tropicalis）。这两个菌株发酵不同碳源的产物蒸馏后用GC分析，主要为乙醇，纯度高，副产物少，没有过多副产物3，便于发酵产品的后期处理，具有一定工业应用的优势。本研究完成了菌种的筛选、鉴定和发酵产物的分析。更多的工作还可以围绕两个方面来开展。一个方面是从改善菌株外部发酵环境，对其生理生化特性深入研究，可以优化发酵条件，提高乙醇产量。另一个方面是从菌株的内部进行改造。既可以对它进行化学物理诱变，又可以从更高的层次来进行基因工程改造，以期获得发酵木糖性能更加出色的工程菌株。而且菌株3和菌株621只是35个筛选结果中的一部分，对其他菌株进一步的深入研究是很有必要的，这样可能发现更多的优良菌株，为工业生产提供更多的选择。参考文献1 Beatriz palmarola-Adrados, Pavla Chot borsk, Mats Galbe et al., Ethanol production from non-starch carbohydrates of wheat branJ. 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