课件：医用分子遗传学DNA复制.ppt

第三章 DNA 复制 (Replication of DNA),DNA 复制一般特征 参与DNA复制的酶类 DNA复制基本过程 DNA复制的调控 DNA损伤与修复,第一节 DNA复制的一般特征,一、DNA的生物学功能 1、储存遗传信息 2、复制遗传信息 3、表达遗传信息 4、遗传变异,1962, Nobel Prize,Watson(Nature,1953) :我们假设的特异的（碱基）配对方式提示了遗传物质可能的复制机制：每一条链均可作为合成一条新链的模板，就使子代双螺旋与母本完全一致。,二、DNA复制方式,DNA如何进行复制？,Meselson-Stahl experiment 1958, PNAS,根据实验结果： 第一代DNA仅有一条带否定了全保留复制的可能,DNA的半保留复制 Semiconservative Replication DNA双链解开，以单链做模板，碱基互补原则，各自合成一条链。在新合成的DNA双链分子中，一条是原来的老链，一条是新链。,第二代出现两条带，一条完全轻带一条中带否定了分散式复制的可能，证明DNA只能是半保留方式进行复制,2 DNA复制的半不连续性,复制时DNA链延伸可能有三种方式：,1,2,3,1967年，日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生1001000bp的短片段,没有从3 5 延长DNA链的聚合酶,2 DNA复制的半不连续性,一条链连续合成，称主导链，Leading Strand 另一条链分段合成，称随从链Lagging Strand 。 原因：DNA双螺旋分子两条链方向相反，新链合成的方向只能53一个方向合成。,3 DNA复制的双向性,在两个方向同时进行，形成两个复制叉(Replication Fork ).,概括：,半保留 半不连续性 双向性,第三节 参与DNA复制的酶类,参与DNA复制的酶或蛋白因子： 1 DNA聚合酶 催化DNA的合成 2 引物酶 起始RNA的合成 3 连接酶 连接冈崎片段 4 DNA解链，解旋酶 5 DNA结合蛋白,一 DNA聚合酶(Polymerase),1956年，大肠杆菌DNA聚合酶 1959，Nobel Prize （一） 作用机制 以DNA做模板，碱基互补配对，催化4种dNTP之间形成磷酸二酯键，从而延长DNA链。,Mg2+,在模板链上进行 不能从头合成，在引物的3OH端上延长 新链延长方向为53延长,（二）原核生物DNA聚合酶,有3种：DNA聚合酶 I，II，III。 多功能酶： 合成DNA的活性 聚合酶作用,延长DNA链。 水解DNA的活性 外切核酸酶活性,切除不配对碱基，起校读作用,1、DNA聚合酶 I,大肠杆菌DNA聚合酶I ： 单链多肽蛋白质,分子量为109KD. 性质：多功能酶 大亚基：53聚合酶活性 35外切酶活性 小亚基：53外切酶活性。 1000nt/min,35外切酶活性 从游离3OH端切割,识别和消除不配对的核苷酸，保证了DNA复制的忠实性。 53外切酶活性 DNA聚合酶I中的小亚基带有5外切酶活性，从双链DNA的5端降解释放出单核苷酸或寡聚核苷酸。,35外切活性示意图,DNA聚合酶特有活性,DNA聚合酶I 在DNA复制中所起的作用,不是主要的复制酶 RNA引物的切除 DNA损伤的修复：紫外线作用形成的TT二 聚体的切除 链置换： 可能参与遗传重组 切口平移（nick translation） 探针标记,2 DNA聚合酶II,不是复制酶，主要在DNA修复中起作用，无53外切酶活性。 5% DNA聚合酶I的活性,3 DNA聚合酶 III,1972年发现 催化效率高，主要复制酶。由10种亚基组成： （1）核心聚合酶： ：53DNA聚合酶活性 ：3-5外切酶活性，控制 复制忠实性 ：核心酶的组建,（2） 二聚体： 构成滑动钳，将全酶固定在DNA模板上，提高合成速率（20/秒-750/秒。 （3） 复合物 ：2 协助 二聚体结合到 DNA,E. coli DNA 聚合酶不对称二聚体,DNA聚合酶 III,形成不对称的二聚体，与DNA双链结合，后随链折叠1800，使后随链的物理方向与主导链一致，同时催化两条链的复制。,领头链 (leading strand),后随链 (lagging strand),DNA 聚合酶 pol pol pol 亚基数目 1 7 10 5 3 聚合酶活性 + + + 3 5 外切酶活性 + + + 5 3 外切酶活性 + - - 聚合速度(核苷酸/分) 1 000-1 200 2 400 15 000-60 000 持续合成能力 3-200 1 500 500 000 功能 切除引物,修复 修复 复制,大肠杆菌3种DNA聚合酶性质比较,（三） 真核生物DNA聚合酶,DNA聚合酶的作用,DNA聚合酶 : 多亚基、多功能酶。 大亚基：DNA聚合酶活性。 100nt/次 小亚基：引物酶活性，合成RNA。 起始DNA的合成：合成RNA引物和在RNA3羟基端合成一段DNA。,DNA聚合酶的作用,DNA聚合酶的结构 多亚基组成： P125 大亚基，催化亚基，含聚合酶和 外切酶活性 P50 与增殖细胞核抗原(PCNA)结合相关 P66 P12,DNA聚合酶的功能,主要DNA复制酶：DNA聚合酶活性，延伸DNA链。 与RFC和PCNA形成“全酶”，在RFC和PCNA等的协同下，促使DNA聚合酶的解离， DNA聚合酶接替DNA聚合酶继续DNA链的合成- DNA聚合酶向DNA聚合酶的转换。 复制校正功能：3-5外切核酸酶活性,DNA聚合酶 、 主要功能：DNA修复。 DNA聚合酶：线粒体DNA复制,二、真核生物DNA聚合酶附属蛋白,1、PCNA：增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen)， DNA聚合酶的附属蛋白，参与DNA的合成，类似二聚体。 2、RFC：复制因子C(Replication Factor C)。多亚基复合物，DNA聚合酶的附属蛋白，识别引物末端,参与链的延长。类似复合物。,3、PRP1和PRP2 Primer Recognition Protein 增加DNA聚合酶与模板引物末端的亲和力，增加DNA聚合酶的活性。,PCR 与Taq DNA 聚合酶,Taq DNA聚合酶特性（Taq DNA polymerase） 最初由H.A.ErlicH从热泉中的细菌中出来 性质 具有53聚合酶活性以及依赖于聚合作用的 外切酶活性 耐热性 此酶是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶 最适反应温度为7280 应用 能以高温变性的靶DNA分离出来的单链DNA 为模板，进行DNA的体外扩增PCR反应。,三 引物酶 primase,DNA聚合酶不能引发DNA新生链的合成，只能在已存在的DNA链或RNA链上延长DNA。引物酶催化引物RNA的合成。,四 连接酶 ligase,1967年发现 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成，二个片段必须都与完整的模板链结合。 大肠杆菌的连接酶需NAD+，真核细胞的连接酶需要ATP。 可连接双链DNA中的单链切口，RNA-DNA杂交体双链单链切口，不能连接双链RNA中的单链切口。,五 与DNA解链和解旋有关的酶,五 与DNA解链和解旋有关的酶,（一）DNA螺旋酶（Helicase） 催化双螺旋解旋和解链 需消耗ATP,（二）拓扑异构酶（Topoisomerase) DNA 回旋酶（Gyrase） 促进DNA双链的解开,需消耗ATP。 兼有内切酶和连接酶活性, 可迅速使DNA两条链断开又接上, 消除解链酶产生的拓扑张力。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量, 同复制有关。,（三）单链结合蛋白,DNA单链结合蛋白（Single Strand Binding protein，SSB） 复制因子A 主要功能： 与单链亲和力大，稳定单链结构，保护单链免受核酸酶水解和阻止双链形成，有利复制进行。,第二节 DNA 复制的基本过程,复制子 Replicon,Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单位称复制子, 或者说单个复制起始点控制的DNA,包含从起始位点到终止位点的全部DNA。 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点。 终止位点 终止复制的位点 每个细胞周期启动复制一次。,复制在特定部位起始。 原核生物仅有一个起始部位。 真核生物有多个起始部位。,复制起始点、复制子与复制叉,半保留复制，必须解决解开双螺旋的问题。 250Mb的1号染色体，需要旋转250万次。,DNA拓扑异构酶解决了解开DNA双螺旋的问题,一 复制的起始 （一）起始部位的序列特征 同位素标记显示复制起始在特定部位开始 复制起始点:origin, ori,DNA复制过程：,1、 M13噬菌体的起始部位顺序特征 59bp的发夹结构,2、大肠杆菌(OriC)的起始部位顺序特征 240bp的唯一起始部位 2个区域： 起始蛋白识别结合区：4个9bp重复顺序 邻近的AT富含区3个13bp重复顺序。,大肠杆菌基因组复制起始部位,3、酿酒酵母起始部位顺序特征,A: 含ARS一致序列（ACS），复制起始识别复合物结合 B：增加复制起始位点的效率,100200bp,4、 SV40起始部位的顺序特征 Simian vacuolating virus 40 猴空泡病毒,5211 5220 5230 5240 1 10 20 30 CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT 反转重复序列 大T抗原结合部位 II A/T 富含区 图3-7 SV40 复制起始部位结构,复制起始位点特征：,独特重复序列 起始结合蛋白识别 AT富含序列，有利于DNA双链解旋,5、起始部位的顺序特征（高等真核生物）,多个复制起始点，有人发现任何大于15kb的DNA就能自主复制。 起始不是随机的，但未发现起始位点的特征序列。 特征：结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异,（二） 起始需要多种蛋白因子参与,1 噬菌体（X174） priA 识别起始位点，ATP酶活性 priB 起始引发 priC 起始引发 DnaT 起始引发 DnaB 起始引发 DnaC 起始引发,与DnaB一起作用 DnaG RNA引物合成,2 大肠杆菌 DnaA 识别并结合于oriC区，有ATP酶活性，使AT富含区解链，促进DnaB结合形成起始复合物。 DnaB DNA螺旋酶，有解旋和解链作用。 DnaC 运输DnaB，形成起始复合物。 DnaG DNA复制引发酶，合成引物。 Hu 促进复制复合物的形成。 回旋酶 松弛正超螺旋，促进单链DNA产生。 单链结合蛋白 促进DNA解链，稳定单链DNA。,n site, primosome assembly site, n-pas,3、真核细胞（SV40）,真核细胞（SV40）的DNA复制至少需要6个蛋白因子参与。 T抗原：N端为DNA结合区，识别起始位点，C端具有螺旋 酶活性，在RFA的协助下解开双链。 SV40 编码 RFA：人单链结合蛋白 拓补异构酶I或II：解开超螺旋。 复制因子C（replication facter C, RFC）：形成起始复合物 DNA聚合酶-引物酶复合物：合成引物，起始DNA合成。,4、真核细胞（Yeast）,（1） ORC（ Origin Recognition Complex） 6个亚基组成 在真核生物中相当保守 特异识别ARS （Autonomously replicating sequence） ORC1p，ORC2p，ORC4p 与A 元件结合， ORC5p与B元件结合 结合过程需要ATP,（2） Cdc6/Cdc18 （3）微染色体支持蛋白（Minichromosome maintenance proteins，MCMp） 与DNA发生周期性的作用，与复制叉运动有关。 （4） Cdc45 与DNA复制起始位点相互作用。,（三）复制的起始引发（Priming） 合成RNA引物的过程,单链结合蛋白SSB与M13噬菌体单链DNA结合，在发夹结构前6 bp处，RNA聚合酶合成 2030个碱基的RNA. 破坏发夹结构；SSB结合；DNA聚合酶III在3OH延长DNA链。 DNA聚合酶I水解RNA，并补平缺口，连接酶连接。,1、M13噬菌体,priA,priB,priC识别起始点,在DnaT帮助下DnaB,DnaC复合物结合形成前引发体,引发体,引发体可沿着DNA链移动，在合适的位点起始引物RNA的合成,引发体的装配只能在起始点，引物合成可在多处。 引发体移动的方向与DNA链延长的方向相反。 类似冈崎片段的合成,2、 X174DNA,PAS：primosome assembly site,3、大肠杆菌,Hu因子促进复合物形成,DnaA结合OriC,富含AT区解链,2DnaB-DnaC复合物,DnaB解链,4 SV40,T抗原识别起始点和解链,RFA结合到单链DNA,拓扑异构酶参与下形成前引发体,DNApol -引物酶结合形成引发体,SV40 DN