水产动物组织胚胎学实验指导书.doc

水产动物组织胚胎学实验指导书编 著：钟 蕾适用专业：水产养殖 水族科学与技术湖南农业大学印制二零零七年三月目 录一、课程的性质和任务1二、实验教学目的和基本要求1三、实验考核方式及办法1 四、实验项目2五、实验课注意事项2六、课堂实验3实验一、显微镜的构造和使用、细胞、上皮组织、结缔组织的观察3实验二、血液涂片的制作，血细胞、肌肉组织、神经组织的观察6实验三、血管、呼吸、泌尿器官的观察11实验四、消化、免疫、内分泌器官的观察17实验五、生殖器官、鱼类早期发育的观察22七、教学实习24八、主要参考书28实验课程编号：20505B3sy课程属性：必修实验属性：非独立设课学时学分：20学时，计入课程学分实验应开学期：春季先修课程：基础化学试验、鱼类学实验一、课程的性质与任务 组织胚胎学实验是组织胚胎学的重要组成部分。它是在理论讲授的基础上，通过实验观察，使学生掌握动物体的微细结构，并能从细胞、组织和器官三个层次上对鱼类有机体的形态结构与功能有一个总体认识。通过胚胎实验课，使学生掌握普通胚胎学的基础知识及鱼类发生的一般规律。通过实验特别是一周的综合实验，使学生掌握生物绘图、切片、染色等一些基本技能或能力，为以后的生产实践和科学研究打下坚实的基础。二、教学目的与基本要求（一）教学目的 1掌握光学显微镜的一般构造和使用方法。 2通过切片观察，掌握细胞的一般构造，四大基本组织的一般构造和器官组织的一般构造。 3在显微镜下，对照实物切片，如何科学地、真实地掌握生物绘图技术。 4掌握组织切片技术的基本原理和制作一般组织学切片标本的程序。（二）基本要求 1.能熟练掌握显微镜操作技术。 2.能按实验指导书提供的方法进行验证性实验。三、实验考核方式及方法1实验前要求对实验内容先进行预习。讲解实验内容时可采用提问的方式进行检查了解。2每次实验结束时，对实验的基本内容要进行实地检查。3每次实验要求绘24个图。作为当日实验作业上交。 4对作业图进行认真批改。成绩计入30的平时成绩。 5实验前要对上次实验中发现的问题进行讲评；不及格者要补考。平时成绩不及格不能参加期末考试。6综合实验每人要求交一张自己制作的切片和一张血液涂片，并进行综合评分。四、实验项目一览表 水产动物组织胚胎学实验项目一览表序号 实验项目名称 实验类型 实验要求 适应专业 学时1显微镜使用及细胞、上皮组织、结缔组织的观察 验证 必做 水产养殖 42血液涂片制作、血细胞、肌肉、神经组织观察 技能 必做 水产养殖 43血管、呼吸、泌尿器官的观察 验证 必做 水产养殖 44消化、免疫、内分泌器官的观察 验证 必做 水产养殖 45生殖器官、鱼类早期胚胎发育的观察 验证 必做 水产养殖 4五、实验课注意事项1、 实验前应认真预习实验指导书，明确实验目的、要求，了解实验内容和方法，熟悉操作环节，以提高实验效果。2、 实验前仔细清点实验材料。实验后须经指导教师检查无误，方可离开实验室。如有损坏，应及时报告指导老师，认真填写好损坏的物品登记。3、 实验时应按照指定方法观察、操作，培养严肃认真一丝不苟的科学态度和工作作风。4、 认真记录实验结果，按时完成实验报告。作业力求简明扼要，清晰正确，绘图用实验报告纸，绘图要认真，不得草率和照抄。注明绘物及其各部分的名称，实验报告不合要求者，教师有权要求重做。5、 爱护实验仪器及用具，要特别注意显微镜和解剖镜的正确使用和保护。遇有故障或损坏时，应立即报告指导老师。6、 爱护实验材料，不得浪费和随意丢弃。珍惜实验标本。节约药品。实验材料、用具等，用后要及时清整，物归原处，由值日生统一归整交还老师。7、 遵守实验秩序，保持室内安静，有事先报告，未经指导老师允许，不得擅自提前离开实验室。8、 每次实验结束后，由值日生作好清洁整理工作，要特别注意水、电等的安全检查，关好门窗，方可离开实验室。9、 实验课不认真完成，未经指导教师通过者，不得参加期末考试，成绩以“不及格”论处。10、每次实验成绩作为平时成绩加权到课程终成绩。第一部分 课堂实验实验一、显微镜的构造和使用、细胞、上皮组织、结缔组织的观察（一）实验目的和要求1、通过实验过程中的操作和观察来验证和巩固理论知识，加深学生对理论课内容的理解。2、通过对各种组织切片的观察，逐步培养学生学会观察、比较、分析和综合各种现象的科学方法，培养学生独立思考和独立工作的能力。3、进行本学科的基本技能训练，使学生能够熟练使用光学显微镜，了解组织和器官切片的一般制作过程，学会在光镜下正确绘图和描述观察到组织或器官的形态结构特点。4、掌握多种细胞、被覆上皮、疏松结缔组织的结构特点。（二）教学仪器多媒体教学互动设备，显微镜、切片，以及相关的挂图、相关的教学课件等。（三）实验内容一、光学显微镜的构造、使用方法和保护1显微镜的主要构造：（1）镜筒、物镜转换器、滤片槽、载物台、粗调焦手轮和细调焦手轮。（2）照明器：是显微镜的灯光照明系统，直接组装在镜座内部。（3）集光器：是一个装在载物台下可以沿着光轴方向垂直移动的透镜系统，它的主要作用时把照明光线聚集在被观察的物体上。（4）光阑：在集光器上装有孔径光阑，它对物像的质量和分辨力的大小有着重要的作用。（5）物镜：分低倍、高倍和油镜三种。低倍镜是4和10，高倍镜是40，油镜是100。（6）目镜：常用放大倍数为10的目镜，物像的放大倍数=目镜倍数物镜倍数。目镜内有一黑色指针，可作指示镜下结构。2显微镜的使用方法:（1） 取镜：拿显微镜时必须一手紧握镜臂，另一手平托镜座底，切忌单手提取以免目镜脱落。（2） 放置组织切片：将组织切片的盖玻片朝上，放在载物台上，然后用标本夹固定。（3） 调节焦距：从侧面观察低倍镜头，旋转粗调焦手轮使镜头接近玻片为止，从目镜观察，同时旋转细调焦手轮，边旋转边观察，直到视野物像清晰为止。（4） 转换高倍镜：需转换高倍镜头时，必须先在低倍镜下将要观察的部分移到视野正中，然后直接转换高倍镜头，此时镜下隐隐约约可见物像，再稍微转动细调焦手轮即可看清楚物像。（5）收尾工作：显微镜用毕，取下玻片，物镜转成“八”字形，下降镜头使之轻触载物台，最后将显微镜放入镜箱。3.使用显微镜的注意事项:（1）不能拆卸显微镜的任何部件或与其他显微镜调换部件，使用前后要检查各零部件是否齐全，如发现损坏应及时报告教师，以便修理。（2）目镜、物镜和玻片要保持干净。（3）不要随便用其它抹布或普通纸擦镜面。必要时可用擦镜纸，蘸少许二甲苯擦去镜头的污物。二、切片观察（一）单层柱状上皮取材：鱼肠和猪的十二指肠，染色：HE1. 肉眼观察切片呈长条状。有凹凸不平突起的一面是腔面，突起称皱襞。皱襞表面有一层蓝色结构，即为单层柱状上皮。2. 低倍镜观察在绒毛表面找到单层柱状上皮。上皮有两个面：游离面即为空肠腔面，没有任何组织相连接，其对应的另一面是基底面，与结缔组织相连接。移动切片，选择蓝色椭圆形或杆状细胞核排列整齐的部位转高倍镜观察。3. 高倍镜观察上皮细胞呈柱状，胞质着浅红色，胞核呈椭圆形或长杆状，着紫蓝色，排列于细胞基底部（思考：单层柱状上皮还分布在哪里？有何主要功能？）（二）单层扁平上皮单层扁平上皮正面观取材：动物肠系膜，铺片。染色：镀银1. 肉眼观察铺片为一小块方形棕黄色组织，色深的细条状结构是肠系膜中的毛细血管和结缔组织，淡黄色部位是单层扁平上皮。2. 低倍镜观察可见许多不规则的黑色或棕色网格（实为细胞间质，嗜银颗粒沉积在细胞间质而形成的）。网格内即为单层扁平上皮细胞。3. 高倍镜观察单层扁平上皮细胞呈多边形，两相邻细胞交界处呈棕色锯齿状，细胞中央有一圆形或椭圆形白色结构即为细胞核的位置。（三）复层扁平上皮 取材：动物食管和乌鳢皮肤染色：HE1.肉眼观察切片是食管横切面，管腔面收缩形成许多皱襞，使管腔变小而不规则。沿管腔表面有一层紫蓝色结构，即为复层扁平上皮。1. 低倍镜观察在管腔面找到复层扁平上皮，其细胞层数约为数十层，基底面呈波浪状以结缔组织连接。结缔组织形成乳头（色较浅）突到基底层的凹面（为什么？）。从基底面到游离面，细胞分界不清，但可从细胞核的形态变化观察其特点。2. 高倍镜观察从基底面到游离面观察各层上皮细胞形态特点，基底层细胞矮柱状（一层），核呈卵圆形，着色深，排列紧密，胞质很少（有些部位基底层细胞核可见23层，是因为切斜了；有些部位在上皮内可见圆形或不规则形的浅色结构，是因上皮切斜，切到了深处突入基底层凹面的结缔组织乳头，乳头周围染色较深部分即为上皮基底层细胞）。中间部有几层多边形细胞，分界清楚（细胞间的分界线实为细胞间质），胞质着色浅，胞核圆，位细胞中央。近游离面有数层扁平细胞，胞核椭圆形，其长轴与表面平行。（四）疏松结缔组织铺片取材：小鼠肠系膜铺片。染色：混合染色为显示疏松结缔组织中巨噬细胞的形态特点，在活体小鼠皮下注射台盼蓝染料，存活数日后处死，取其肠系膜，用分离针分离平铺于玻片上，经固定、脱水和复合染色后即可在镜下观察。这种铺片在光镜下可见有两种纤维（胶原纤维、弹性纤维）和两种细胞（肥大细胞、巨噬细胞）。有时可见成纤维细胞。1. 肉眼观察： 铺片呈紫红色不规则组织块。2. 低倍镜观察选择薄而较透明的部位观察。较粗的粉红色纤维是胶原纤维。混杂在胶原纤维之间的细如发丝的紫色纤维即为弹性纤维。弹性纤维常为单条直行，有分支，交织成网，断端常卷曲。网状纤维用浸银法方可显示，故此片看不到。上述纤维之间有肥大细胞和巨噬细胞。胞质中可见紫蓝色颗粒的是肥大细胞。3. 高倍镜观察: 选择纤维较分散、细胞较多的部位观察，可见下列细胞：成纤维细胞：只见浅蓝色椭圆形细胞核，胞核中有12个核仁。细胞质染色很浅，隐约可见淡紫色的细胞轮廓，有的细胞质模糊不清。此种细胞量最多。巨噬细胞：细胞轮廓清楚，形态多样，呈卵圆形或不规则形；细胞核小着色深（注意与成纤维细胞比较），胞质中可见吞噬的紫蓝色台盼蓝染料颗粒。肥大细胞：细胞三五成群分布，胞体呈圆形或卵圆形，胞质中充满着色深粗大的具有异染性的嗜碱性颗粒（因颗粒太密集而不能分辨）。实验二、血液涂片的制作，血细胞、肌肉组织、神经组织的观察（一）实验目的和要求1、掌握Giemsa染色血涂片方法，红细胞及各类白细胞的形态；熟悉血小板的形态。2、掌握骨骼肌、心肌、平滑肌在不同切面的形态结构。3、掌握神经元的形态结构特点。 4、掌握有髓神经纤维的结构特点。（二）教学仪器多媒体教学互动设备，显微镜、切片，以及相关的挂图、相关的教学课件等。（三）实验内容一、血涂片的制作1、Giemsa染液配制称取0.50g姬姆萨染料放入研钵中, 边研磨边加入33ml丙三醇, 使之研磨成糊状，最后加33 ml甲醇混匀，放56温箱内124h，即为姬姆萨贮存液。临用前在1 ml姬姆萨贮存液中加入磷酸缓冲液20ml，配成使用液。2、血液涂片制作：从鱼尾静脉（或牛蛙腹部静脉）取血0.01ml于载玻片上常规涂片，自然干燥。Giemsa染色：将涂片置于纯甲醇中固定13min，自然晾干；稀Giemsa染液（10滴Giemsa染液原液+10ml磷酸缓冲液）染色15min；用蒸馏水冲洗，干燥后，可用人工树胶封片或不封，即可进行观察。二、血细胞的观察 取材：人外周血液涂片染色：Giemsa 或Wright染色1、肉眼观察经染色后的血涂片为淡橘红色，因制作方法不同于切片，其外观也有别于切片材料，涂片标本一般较细腻、平整，稍加注意即可辨认。2、低倍镜观察数量众多的红细胞分散或成群附着于玻片上，在红细胞群之间可看到细胞核染色成紫蓝色的白细胞。挑选白细胞较集中的区域，转高倍镜对各类血细胞逐一仔细观察。3、高倍镜观察红细胞：为镜下主要细胞，体积大小较接近，细胞无核，多数细胞周边着色较深、中央着色浅。白细胞：观察时应根据细胞大小、胞质内特殊颗粒的类型、胞质染色特征和细胞核形态及分叶特征，区分出五种不同类型的白细胞。中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。中性粒细胞：数量最多，细胞核呈弯曲杆状或分叶，分叶25叶，叶间有染色质丝相连，胞质浅红色，胞质内隐约可见数量较多、细小均匀染成淡紫红色的颗粒。嗜酸粒细胞：标本上较难找到。胞体较大，数量少于中性粒细胞，核形态较饱满，以2叶多见，核染色较中性粒细胞浅，且核外形较丰满。胞质内充满粗大、均匀、橘红色颗粒。嗜碱性粒细胞：数量少，故标本上及难找到。细胞大小与中性粒细胞相近。细胞核着色浅，呈S型或不规则形，轮廓模糊。胞质内可见分布不均、形态不规则、大小不等的染成紫蓝色颗粒，常覆盖核。淋巴细胞：可以观察到中、小淋巴细胞两种。小淋巴细胞数量较多，小淋巴细胞圆形，一侧常可见到凹痕，体积大小与红细胞相近，核大圆形，核因异染色质多聚集成块而染成深蓝色，少量天蓝色胞质环绕胞核。中淋巴细胞体积较大，以卵圆形多见，核染色质略稀疏，染色较浅，胞质较小淋巴细胞多，胞质内可见少量嗜天青颗粒。大型淋巴细胞在血涂片中不易看到。单核细胞：体积较大，细胞形态卵圆、椭圆多见，细胞核呈肾形或马蹄形，但核内异染色质量较少，染色较浅，呈网格状。胞质较丰富，染色灰蓝，胞质内可见少量嗜天青颗粒。血小板：体积较小，形态多样，在制作血涂片时，常发生凝集，造成分布上的不均等和成群现象，观察时应注意。4. 高倍镜观察: 选择纤维较分散、细胞较多的部位观察，可见下列细胞：成纤维细胞：只见浅蓝色椭圆形细胞核，胞核中有12个核仁。细胞质染色很浅，隐约可见淡紫色的细胞轮廓，有的细胞质模糊不清。此种细胞量最多。巨噬细胞：细胞轮廓清楚，形态多样，呈卵圆形或不规则形；细胞核小着色深（注意与成纤维细胞比较），胞质中可见吞噬的紫蓝色台盼蓝染料颗粒。肥大细胞：细胞三五成群分布，胞体呈圆形或卵圆形，胞质中充满着色深粗大的具有异染性的嗜碱性颗粒（因颗粒太密集而不能分辨）。三、骨骼肌、心肌、平滑肌 （一）骨骼肌取材： 兔骨骼肌 染色：HE 1肉眼观察 切片上有两块标本，长条形的为纵切面，椭圆形的为横切面。纵切面：重点观察骨骼肌纤维的结构。 2低倍镜观察骨骼肌纤维呈长带状，相互平行排列。肌纤维之间有少量结缔组织、成纤维细胞核及毛细血管。 3高倍镜观察（适当将视野调暗） 每条肌纤维有许多椭圆形的核，位于肌纤维的周边。注意与周围结缔组织细胞核相区别，骨骼肌纤维的核位于肌膜内侧。肌浆丰富。每条肌纤维上可见明暗相间的横纹。色深的是暗带（A带），暗带中间有色浅的H带。明带（I带）色浅，其中央有条细线为Z线。 横切面 ：重点观察骨骼肌做为器官的结构。1低倍镜观察 标本为一块肌肉器官的横切面，表面有致密结缔组织包绕为肌外膜（即深筋膜）；肌外膜伸入肌肉内，形成隔，包裹着每一束肌纤维形成肌束膜；肌束的大小不等，形状不规则。每条肌纤维周围有薄层结缔组织为肌内膜。（不易分辨） 2高倍镜观察 肌纤维的横切面呈多边形，大小不一。核位于肌膜下，呈圆形或卵圆形。肌纤维内有许多红色点状的肌原纤维，肌原纤维之间是肌浆，呈粉红色。 （二）心肌 取材：动物心脏 染色：HE 1肉眼观察：标本为心脏壁的一部分，绝大部分着色较红为心肌。 2低倍镜观察 由于心肌纤维排列方向不一致，有纵、横、斜等切面，故要全面观察标本，熟悉各种切面的部位。 肌纤维之间有结缔组织和毛细血管。3高倍镜观察：注意与骨骼肌相区别。 纵切面：心肌纤维较骨骼肌纤维细而短，有分枝，相互吻合成网。细胞核卵圆形，位于肌纤维的中央。 有时可见双核。细胞核周围肌浆丰富，故着色浅。有暗带和明带构成的横纹，但不如骨骼肌明显。相邻肌纤维的连接处深暗的线条即闰盘。 横切面：心肌纤维呈圆形或不规则，大小不等。肌原纤维呈点状，着红色，分布在肌纤维的周边。细胞核位于肌纤维中央，呈圆形，有的未见核。肌浆着色甚浅，由于肌浆在核的周围较多，故在末切到核的细胞中央往往可见浅染区。 （三）平滑肌取材：动物空肠 染色：HE 1肉眼观察：小肠壁光滑面一侧，染成红色的是平滑肌。 2低倍镜观察 平滑肌分两层。纵切面平滑肌纤维呈长梭形，横切面平滑肌纤维呈大小不一圆点形。 3、高倍镜观察纵切面：平滑肌呈梭形，相邻的肌纤维彼此交错相互嵌合，肌浆染色红呈均质性；核位于细胞的中央，呈杆状，由于细胞收缩使核变形而呈螺旋形或边缘为锯齿形，染色质较少，故核着色较浅。 横切面：平滑肌纤维呈大小不等的圆形， 有的切面中央有圆形的核， 有的切面不见核。四、多极神经元、有髓神经纤维和神经、运动终板、环层小体（一）多极神经元取材：猫的脊髓 染色：HE 1肉眼观察脊髓横切面为椭圆形。周围浅红色的是白质。灰质居中，着色较红，呈蝴蝶形，两个较短粗的突起为前角，两个较细长的突起为后角。 2低倍镜观察光镜辨认灰质和白质及灰质的前角和后角。前角中有许多体积很大的细胞，着紫蓝色，为前角的神经元的胞体。后角的神经元较小。神经元之间可见许多小而圆的细胞核是神经胶质细胞的核。选择一个切面结构完整的神经元置于高倍镜下观察。3高倍镜观察： 前角多极神经元属于运动神经元。胞体：大，呈多角形，伸出数个突起。核位于细胞中央，大而圆；常染色质多，染色 浅，呈空泡状；核仁明显，圆而大，着红色。 胞质中含许多蓝紫色块状或颗粒状的尼氏体。 树突：可观察到一个或数个树突的根部，树突从胞体发出时较粗大，逐渐变细，内含尼氏体。 轴突：只有一个（不易切到 ）。轴突自胞体发出处的胞质呈圆锥形，为轴丘。轴丘、轴突均不含尼氏体。 （二）有髓神经纤维和神经 取材：猫的坐骨神经 染色：HE 1 肉眼观察：切片上有两块标本，长条状的是神经的纵切面。圆形的是横切面。神经的纵切面： 2、低倍镜观察： 许多神经纤维平行排列，由于排列较紧密，故每条神经纤维界限不易辨认。神经纤 维之间有极薄结缔组织。 3、 高倍镜观察： 轴突：神经纤维的中央一条呈紫红色的线 。 髓鞘：位于轴突两侧，呈粉红色稀疏网状结构（因制片时，髓鞘的类脂质被溶解，仅残留蛋白质）。 神经膜：位于髓鞘两侧，为红色的细线。某些部位含长椭圆形的施万细胞核，染色较浅。 郎飞结：每条神经纤维的一定距离上，髓鞘中断，形成一缩窄，呈十字状。 神经纤维之间尚有少量结缔组织，此即神经内膜，内含成纤维细胞，核小且染色较深，可与神经膜细胞相区别。 神经的横切面：2、低倍镜观察 神经为神经纤维与结缔组织组成的器官。神经外包裹的致密结缔组织为神经外膜；神经内有多个圆形的神经束，神经束周围的致密结缔组织形成神经束膜； 神经束膜的结缔组织伸入神经束内，分布在每条神经纤维周围即是神经内膜（低倍镜下不易辨认）。3、高倍镜观察 着重观察有髓神经纤维的横切面。神经纤维呈圆形，粗细不 一；中央紫红色小点为轴突；轴突的周围是髓鞘，呈红色网状结构；髓鞘外面是神经膜，很薄，染成红色，有的尚有施万细胞的胞核，呈弯月形。 （三）、运动终板 取材：蛇肋间肌 染色： 氯化金浸染压片镜下观察：骨骼肌纤维呈淡紫色，其上面可见染成黑色的神经纤维。神经纤维末端呈扣状或爪状紧 贴肌膜，形成运动终板。（四）、环层小体取材：猫趾枕皮染色： H-E镜下观察：在皮下组织内，圆形或椭圆形的结构。环层小体中央有一条均质状的圆柱体，圆柱体周围有许多扁平细胞同心圆排列。实验三、血管、呼吸、泌尿器官的观察（一）实验目的和要求1掌握大、中、小动脉的管壁组织结构，熟悉动脉与静脉的组织结构区别，掌握毛细血管管壁的组织结构。2掌握肺、鳃的组织结构。3.掌握肾的组织结构（二）教学仪器多媒体教学互动设备，显微镜、切片，以及相关的挂图、相关的教学课件等。（三）实验内容一、动脉、静脉、毛细血管（一）大动脉 取材：猪的主动脉染色：HE1肉眼观察：管壁厚，凹面为腔面，凸面为外膜面。2低倍镜观察：可分为三层，但分界不明显。（1）内膜：最薄，由内皮和内皮下层构成。内皮下层较厚，内弹性膜与中膜的弹性膜相连，故与中膜分界不明显。（2）中膜：最厚，主要由数十层环行排列的弹性膜组成，在标本上为红色发亮呈波纹状走行，在弹性膜之间夹有平滑肌纤维。（3）外膜：较厚，主要由结缔组织构成，其中有小血管和神经，外弹性膜不明显。3高倍镜观察（1）内膜：分为三层。内皮：仅见核突向管腔。内皮下层：较中动脉厚，含胶原纤维、弹性纤维及平滑肌纤维。内弹性膜：有数层，与中膜的弹性膜相连，故与中膜无明显的界限。（2）中膜：可见4070层平行排列的弹性膜，呈波浪形，着粉红色，折光性强。其间夹有梭行的平滑肌纤维，其核呈杆状。（3）外膜：外弹性膜与中膜分界不明显，结缔组织中含营养血管和神经的断面。（二）中动脉和中静脉取材：人中动脉和中静脉染色：HE1、肉眼观察标本中有两个较大的血管横切面。管壁较厚，管腔较小而圆是中动脉。管壁较薄，管腔较大而不规则的是中静脉。中动脉2、低倍镜观察：管壁分三层，界限清楚。由腔面向外观察。（1）内膜：很薄，以一层亮红色波浪状的内弹性膜与中膜分界。（2）中膜：最厚，主要由环行平滑肌组成。（3）外膜：厚度近似中膜，着色较浅，主要由结缔组织组成。外膜与中膜交界处有外弹性膜。3高倍镜观察：（1）内膜：由内皮、内皮下层和内弹性膜构成。内皮：一层内皮细胞核排列在腔面，并突向管腔，胞质不清楚。内皮下层：位于内皮下方，由于内皮下层的结缔组织很薄，看似内皮与波浪状的内弹性膜直接相帖。内弹性膜：呈波浪状（血管收缩所致），红色、折光性强。（2）中膜：最厚。主要由几十层环行排列的平滑肌纤维构成，核呈杆状或椭圆形。肌纤维之间有少量弹性纤维和胶原纤维。（3）外膜：与中膜一样厚，由结缔组织构成。在肌组织与结缔组织交界处有许多纵行的弹性纤维，在标本上多为横切，染色较淡，为外弹性膜。外膜的结缔组织中所含纤维多为纵行，还有营养小血管的断面和神经。中静脉低倍镜观察：注意与中动脉相区别。（1）内膜：很薄，由于内弹性膜不明显，故与中膜分界不清。内皮细胞核突向管腔。（2）中膜：较薄，主要由稀疏的环行平滑肌束组成，肌束间有结缔组织。（3）外膜：较中膜厚，由结缔组织组成，无外弹性膜，有时含成束纵行平滑肌的横切面，还有营养小血管的横断面。（三）小动、静脉取材：动物血管的外膜染色：HE镜下观察：寻找伴行的小动脉和小静脉的横切面观察。小动脉管壁厚，管腔小而圆；小静脉管壁薄，管腔大而不规则，常有许多血细胞。小动脉 （1）内膜：内皮的核突入腔内，呈圆形核，平滑肌收缩所致。内弹性膜明显（较小的小动脉，内弹性膜薄而不明显。）（2）中膜：主要由数层环行排列的平滑肌组成。（3）外膜：由结缔组织构成，与器官内的结缔组织相连续，无外弹性膜。小静脉（1）内膜：很薄，仅见一层内皮，内皮下层不明显。（2）中膜：少量平滑肌纤维或无平滑肌纤维。（3）外膜：薄，与周围结缔组织不易区别。（五）毛细血管 取材：大白鼠肠系膜铺片染色：HE1、肉眼观察盖玻片下，为一淡红色不规则的薄膜，其上可见着色较深、粗细不等的分枝交叉而成的细网，这就是存在于肠系膜内的小或微动静脉。2、低倍镜观察：有粗细不等的微血管及毛细血管网。小动脉：管径较细，结构与中动脉相似，在较粗的小动脉可见内弹性膜紧贴内皮；中膜有数层环行平滑肌纤维；外膜与周围结缔组织无明显界限。小静脉：与同行小动脉相比，腔大壁薄；内皮外可见12层散在的平滑肌纤维。微动脉：管径比小动脉小，内膜无内弹性膜，中膜由12层平滑肌纤维组成。微静脉：与同行微动脉相比，管壁较薄，管腔不规则，内皮外侧的平滑肌纤维或有或无。毛细血管：分支吻合成网，管径很细，只能通过一个红细胞，只见一层与管径平行排列的内皮细胞核。二、肺 取材：猫肺染色：HE1、肉眼观察切片呈海绵状，可见大小不等的管腔断面，是肺内支气管各级分支和肺动、静脉的断面；许多小泡状结构是肺呼吸部。2低倍镜观察：分辨导气部和呼吸部，注意支气管各级分支与血管的区别。导气部：包括小支气管、细支气管和终末细支气管。小支气管：管径粗，管壁厚，三层分界不明显。粘膜：上皮为假复层纤毛柱状上皮，有杯状细胞，但当管腔由粗变细时，上皮内杯状细胞逐渐变少。固有层薄。粘膜下层：为疏松结缔组织，含混合性腺。外膜：由片状的透明软骨片和结缔组织构成，内含小血管（支气管动、静脉）。在小支气管的一侧，有伴行的肺动脉分支断面，其管壁薄，管腔大。细支气管：管径较小，管壁较薄。上皮为假复层或单层纤毛柱状，环形平滑肌纤维增多，杯状细胞、混合性腺及软骨片很少或消失。 终末细支气管： 管径细，粘膜形成明显皱襞，表面为单层柱状上皮，无杯状细胞、混合性腺及软骨片，平滑肌形成完整的环行。3高倍镜观察：重点观察呼吸部。呼吸性细支气管：管壁甚薄，部分由肺泡围成，上皮为单层立方状，上皮下仅有少量的结缔组织和平滑肌。管壁上有肺泡的开口，开口处单层立方上皮移行为单层扁平上皮。肺泡管：管壁有许多肺泡开口，相邻肺泡间的肺泡管处呈结节状膨大，其表面有单层立方上皮覆盖，内部有平滑肌。肺泡囊：为许多肺泡共同围成的囊腔，在相邻肺泡开口处无平滑肌，只有少量结缔组织，切片中看不到结节状膨大。 肺泡：为形态不规则的空泡状结构。肺泡上皮：为单层扁平上皮和少量的立方上皮构成。相邻肺泡之间的薄层结缔组织为肺泡隔，内有丰富的毛细血管。肺泡隔和肺泡腔内常有胞质嗜酸性的肺巨噬细胞，吞噬灰尘后称尘细胞，其胞质内含较多的黑色颗粒。三、鳃取材：鲤鱼鳃切片染色：HE1、肉眼观察鳃由鳃丝和鳃弓两部分组成，鳃弓的一侧为鳃耙，另一侧为鳃丝。2低倍镜观察： 找到鳃弓部位，横切为半椭圆形，外覆复层扁平上皮。3高倍镜下观察：鳃弓软骨呈圆弧形，其下有两条较大的血管（含大量红细胞），即出、入鳃动脉。两片鳃丝一端固着于鳃弓，另一端游离。鳃小片由上、下两层单层扁平(上皮呼吸上皮)以及支撑两层上皮的支持细胞组成，扁平上皮切面呈梭形，染色较深，核长椭圆形。支持细胞低柱状，核圆，位于细胞中部，染色较浅。在鳃小片的末端血窦内可明显见到许多红细胞。四、肾 取材：兔的肾染色：HE1、 肉眼观察标本呈扇形，周边深红色是皮质，有圆球形的肾小体和条纹状的髓放线，中央染色较浅部分是髓质。有的锥体旁有染色深的肾柱，为深入锥体之间的皮质部分。2、低倍镜观察 被膜：居器官最表面，由薄层致密结缔组织构成。皮质：由皮质迷路及髓放线两部分相间排列而成。髓质：主要由大小不等的泌尿小管（肾小管直行部分、集合管）组成，其中有血管断面。3高倍镜观察 皮质：肾小体：由血管球及肾小囊组成。肾小囊壁层为单层扁平上皮，脏层紧贴血管表面与毛细血管的内皮分不开，两层之间的空腔为肾小囊腔。近端小管曲部（近曲小管）：管壁厚，管腔小而不规则，上皮细胞为单层立方或锥体形，细胞游离面有刷状缘，细胞界限不清；核圆位于近基底部，胞质呈强嗜酸性染成深红色。远端小管曲部（远曲小管）：断面较近曲小管少，管径较小，管壁较薄，管腔较大而规则，上皮细胞呈立方形，界限较清楚，胞质嗜酸性弱，着色浅，细胞游离面无刷状缘，胞核位于细胞中央、核间距离较小。髓质：细段：在髓放线及髓质中的细管，由单层扁平上皮构成，管腔小，管壁比毛细血管内皮稍厚，腔内无血细胞。注意与毛细血管相区别。集合小管：由立方上皮构成，胞质染色明亮，核圆着色深，细胞界限清楚。乳头管：由高柱状上皮构成，细胞界限清楚。实验四、消化、免疫、内分泌器官的观察（一）实验目的和要求1掌握消化腺的一般结构。2掌握胃底、小肠的组织结构特点。3.掌握淋巴结、脾脏的组织结构。4、掌握甲状腺、肾上腺的结构。（二）教学仪器多媒体教学互动设备，显微镜、切片，以及相关的挂图、相关的教学课件等。（三）实验内容一、胃底腺 取材：狗的胃底染色：HE1肉眼观察标本为长条形组织，染色较深的一面为粘膜。2低倍镜观察：分清胃壁的四层结构。粘膜：表面为单层柱状上皮，有许多较浅的上皮凹陷形成胃小凹。上皮下为固有层，内含大量的胃底腺。腺体之间的结缔组织少。固有层下面是粘膜肌层，由内环、外纵两层平滑肌组成。粘膜下层：位于粘膜肌深面，由疏松结缔组织组成，内含血管等。肌层：较厚，平滑肌组成，大致分为内斜、中环、外纵三层，在肌层之间可见肌间神经丛。浆膜：由疏松结缔组织和间皮构成。 （在制片过程中，有的间皮可能脱掉。）3.高倍镜观察：重点观察粘膜的结构。上皮：为单层柱状上皮，主要由表面粘液细胞组成，细胞核位于基部，顶部胞质充满粘原颗粒不易着色。呈现透明区。胃底腺：固有层内可见许多不同断面的胃底腺，选择开口于胃小凹的胃底腺的纵切面观察。主要观察三种细胞。主细胞（胃酶细胞）：数量最多，主要分布于胃底腺的下半部。细胞呈矮柱状，核圆，位于基部。基部胞质呈嗜碱性，染成蓝色，顶部胞质呈现空泡状结构（由于酶原颗粒被溶解所致）。壁细胞（泌酸细胞）：分布于上半部。胞体较大，多呈圆锥形，核圆而深染，居中，可有双核，胞质嗜酸性，着深红色。（请结合壁细胞的超微结构特征解释为什么壁细胞胞质呈嗜酸性？）颈粘液细胞：数量少，分布于胃底腺的颈部，胞核较扁，呈半月状，不必分辨。 二、小肠 取材：鱼肠染色：HE1肉眼观察：纵断面上，可见有数个较高的突起，是小肠环行皱襞，在皱襞表面可见有许多细小的突起，为肠绒毛。2低倍镜观察先分辨管壁四层（注意与十二指肠及回肠相区别）。然后重点观察肠绒毛和小肠腺。它们是判断小肠的重要依据。粘膜：粘膜表面有许多伸向肠腔的突起，为小肠绒毛，绒毛的纵切面呈指状，横切面为卵圆形。固有层有不同断面的小肠腺（思考：肠绒毛和小肠腺的组成？在切片中如何区分它们？）。粘膜肌由内环、外纵两层平滑肌组成，染成粉色。粘膜下层：由疏松结缔组织组成，内含小血管、淋巴管等。肌层：内环、外纵两层平滑肌。其间可见肌间神经丛。浆膜：结缔组织和间皮组成。3高倍镜观察肠绒毛：为指状突向管腔。表面为单层柱状上皮， 上皮的游离面染色较红的薄层结构为纹状缘（思考：纹状缘电镜下是什么结构？有何功能意义？），在柱状的吸收细胞之间有杯状细胞。绒毛中轴是固有层的结缔组织，其中央有1-2条纵行的中央乳糜管，还可看到丰富的毛细血管、散在的纵行平滑肌纤维和较多的淋巴细胞。小肠腺：位于固有层内，是粘膜上皮下陷形成的单管腺，小肠腺开口于相邻绒毛之间，以吸收细胞为主，还夹有杯状细胞。在肠腺的底部有三五成群的锥体形细胞，胞质顶部含有许多粗大的嗜酸性颗粒，即潘氏细胞（猫无潘氏细胞，看示教），是小肠腺专有细胞。嗜银细胞（内分泌细胞）需特殊染色显示。三、胰腺 取材：猪胰腺染色：HE1肉眼观察：标本可见形态不规则、大小不等的区域为小叶。2低倍镜观察：表面有结缔组织被膜，实质的许多小叶界限不明显。外分泌部：有许多紫红色的腺泡及导管的各种断面。内分泌部：散在外分泌部之间，着色较浅大小不等的细胞团为胰岛。小叶间的结缔组织中有小叶间导管。3高倍镜观察 腺泡：为浆液性。腺细胞呈锥形，细胞顶部含嗜酸性的酶原颗粒，基部嗜碱性强。核圆，位于细胞基部，腺腔内常见泡心细胞，细胞呈扁平或立方形，胞质不明显。核染色淡，呈圆形或椭圆形。（思考泡心细胞是什么细胞？）闰管：管径小，由单层扁平上皮构成。有时纵断面上可见闰管与泡心细胞相连续。由于闰管长，故闰管的断面较多。胰岛：周围有少量结缔组织。细胞数目不定，染色浅，腺细胞呈不规则排列，相互连接成索或团，细胞间毛细血管丰富。腺细胞的类型不易区分。小叶间导管：由单层立方上皮或矮柱状上皮构成。四、肝脏 取材：猪肝染色：HE1肉眼观察：可见标本被分成许多小的区域，即肝小叶。2低倍镜观察观察猪肝，可见肝表面有浆膜，肝实质被结缔组织分隔成许多分界明显的多边形区域，即肝小叶。肝小叶中央的管腔为中央静脉，其周围放射状排列的条索状结构为肝索。肝索之间的间隙为肝血窦，与中央静脉相通。在相邻的几个肝小叶之间结缔组织较多，内含三种管道，即门管区。3高倍镜观察肝小叶：肝细胞索（肝板）：由肝细胞单行排列成凹凸不平的板状结构，围绕中央静脉呈放射状排列，并互相连接成网。肝细胞体积较大，多边形，内含12个核，位于中央，核仁明显，胞质染嗜酸性。可见小空泡（制片时脂肪、糖原被溶解所致）。肝血窦：为肝细胞索之间的间隙。窦壁由内皮细胞组成。内皮细胞核扁圆，染色较深，胞不易辨认。窦腔不规则，可见体积较大，具有突起的星形细胞，即肝巨噬细胞或称库普弗细胞（Kupffer cell）。常以突起与窦壁相连，核染色较浅，胞质丰富。中央静脉：位于肝小叶中央，壁薄而不完整，由内皮和少量结缔组织构成；有孔与血窦相连。肝门管区：结缔组织中有三种伴行的管道，但每种管道断面往往不止一个。小叶间动脉：腔小而圆，管壁厚，中膜有环形平滑肌。小叶间静脉：腔大壁薄，管腔不规则。小叶间胆管：由单层立方上皮构成（胞质清亮，核圆着色较深）。五、淋巴结取材：猪淋巴结染色：HE1低倍镜观察观察淋巴结，淋巴结表面有结缔组织被膜，被膜中有输入淋巴管穿入。淋巴结一侧凹陷，称为淋巴结门，有血管和输出淋巴管。被膜和门部的结缔组织伸入淋巴结实质形成小梁，小梁互相连接，构成淋巴结的支架。淋巴结实质分为周边染色较深的皮质和和中央染色较浅的髓质两部分，二者无明显分界。3高倍镜观察 皮质部：淋巴小结：含大量B淋巴细胞 *生发中心 弥散淋巴组织：(副皮质区或胸腺依赖区），T淋巴细胞 。 皮窦：内有巨噬细胞，分被膜下窦、小梁周窦。 髓质部：髓索：主要为B淋巴细胞, 浆细胞和巨噬细胞。 髓窦：腔内有较多的巨噬细胞。六、脾脏1低倍镜观察分为被膜、实质。3高倍镜观察 (1)被膜：致密结缔组织,含弹性纤维和少量平滑肌,可形成小梁。 (2)间质：实质中的小梁连同神经、血管构成了脾的间质。 (3)实质：由白髓,红髓和边缘区组成。脾实质的结构 (1) 白髓：由动脉周围淋巴鞘、脾小结构成。1) 动脉周围淋巴鞘：为弥散淋巴组织，分布在中央动脉周围，主要是T细胞。2) 脾小结：即淋巴小结，位于动脉周围淋巴鞘和边缘区之间。主要是B细胞。(2) 红髓：分布广，约占脾实质的三分之二，由脾索和脾窦构成。 1) 脾索: 富含血液的条索状淋巴组织，有B细胞、T细胞、浆细胞和巨噬细胞。 2) 脾窦: 是互相联通的长管状静脉窦，位于脾索之间，腔大而不规则，通透性大，窦壁有巨噬细胞。(3) 边缘区：位于白髓和红髓交界处的狭窄区域，主要是B细胞，并有较多的巨噬细胞，是脾首先接触抗原并引起免疫应答的重要部位。七、甲状腺 取材：狗的甲状腺染色：HE1肉眼观察：标本包括两个腺体甲状腺占大部分，染成粉红色。位于甲状腺的边缘，染成蓝紫色的卵圆形小块为甲状旁腺。2低倍镜观察被膜：薄层粉红色结缔组织，包在腺体的表面。实质：有许多大小不同的滤泡。滤泡壁为单层上皮细胞，腔内充满红色均质状胶质。滤泡之间有少量结缔组织和丰富的毛细血管。3高倍镜观察：滤泡：由单层立方或低柱状上皮围成，细胞的高低随功能状况不同而异。核圆，胞质着色较浅。滤泡腔内充满红色的胶质，是一种碘化的甲状腺球蛋白。其周边可见圆形或半圆形空泡。滤泡旁细胞（C细胞）：位于滤泡壁上皮之间或滤泡之间。体积较大，呈圆形，胞质染色浅。八、肾上腺 取材：动物肾上腺染色：HE1 肉眼观察肾上腺切面呈三角形或半月形，周围着色深的部分为皮质，中央着色浅的部分为髓质。2低倍镜观察：辨认皮质的三个带。被膜：位于表面，由结缔组织组成。染浅红色。皮质：由于细胞排列不同，由外向内分为三带。髓质：位于中央，较薄。 3高倍镜观察皮质：球状带：细胞较小，呈锥形，胞质染色较深，核小，染色深。细胞团间有血窦。束状带：细胞较大，为多边形，胞质内含较多脂滴，脂滴在制片时溶解，故呈泡沫状，核染色较浅。细胞索间有血窦。网状带：细胞小，呈不规则形，染色较深，细胞索吻合成网，网孔内有血窦。有些细胞核固缩，染色深。髓质：嗜铬细胞：较大，呈多边形，内含黄褐色的嗜铬颗粒，核圆，染色浅，细胞索或团之间有血窦。交感神经节细胞：有的切片可见胞体大，核圆，核仁明显的多极神经元，数量少，单个或2-3个成群散在于髓质（大多数切片中无交感神经节细胞）。中央静脉：管腔大，不规则，管壁厚薄不匀（由于纵行平滑肌多成束排列所致）。实验五、生殖器官、鱼类早期发育的观察（一）实验目的和要求1、 认识雄性生殖器官精巢的结构和生精细胞的形态特点。2、 认识雌性生殖器官卵巢的结构和各时期卵子的特点。3、.通过观察白鲢(花鲢或草鱼)受精卵的早期发育卵裂期的切片或整装片，了解盘状卵裂的分裂方法，进而明确鱼类胚胎发育中受精卵早期的变化。4、了解囊胚至原肠胚的发育过程，及原肠形成类型，从而认识囊胚和原肠胚在发育上的意义。（二）教学仪器多媒体教学互动设备，显微镜、切片，以及相关的挂图、相关的教学课件等。（三）实验内容一、睾丸和卵巢、鱼类的精巢和卵巢1、睾丸：兔睾丸切片曲细精管：精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞、精子、支持细胞；间质细胞。2、卵巢：兔卵巢切片卵泡细胞和卵细胞的观察。鱼类精巢：鲢鱼精巢切片精小叶，精小囊，精子细胞。鱼类卵巢：鲢鱼卵巢切片各发育阶段的卵细胞。二、早期发育切片来源：鲢鱼各发育阶段胚胎1、胚盘隆起整装片/切片观察：原生质集中于卵子的动物极而形成隆起的胚盘。2、二细胞期整装片/切片观察：胚盘经裂为2个大小相等的分裂球。3、四细胞期整装片/切片观察：分裂球再次经裂，分裂沟与第一次相垂直，形成4个大小相等的分裂球。4、八细胞期整装片/切片观察：有两个经裂面，且与第一次分裂面平行，形成8个分裂球，排成两排，中间4个较大，两侧4个较小。 5、十六细胞期整装片/切片观察：也有两个经裂面，但与第二次分裂面平行，形成16个分裂球，中央4个较大，外周12个较小。6、三十二细胞期整装片/切片观察：有四个经裂面，且与第三次分裂面平行，32个分裂球排成4行，且在同一平面上 。7、分裂后期整装片/切片观察：分裂球越分越小，形成多细胞的胚体。8、囊胚早期整装片/切片观察：分裂球很小，细胞界线不清楚，由很多分裂球组成的囊胚层高举在卵黄上。 9、囊胚中期整装片/切片观察：囊胚层较囊胚早期为低，已看不清细胞界线，解剖观察可见到囊胚腔。10、囊胚晚期整装片/切片观察：囊胚表面细胞向卵黄部分下包，约占整个胚胎的1/3，囊胚层变扁 。11、原肠早期整装片/切片观察：胚盘下包1/2，胚环出现，背唇呈新月状。12、原肠中期整装片/切片观察：胚盘下包2/3，胚盾出现 。 13、原肠晚期整装片/切片观察：胚盘下包3/4。14、神经胚期整装片/切片观察：胚盘下包4/5，神经板形成。胚体转为侧卧 。15、胚孔封闭期整装片/切片观察：胚孔关闭，神经板中线略下凹。脊索呈柱状 。教学实习目的要求：了解组织切片技术的基本原理和制作一般组织学切片标本的程序。试剂与器材福尔马林、苦味酸饱和水溶液、冰醋酸、酒精(30% 50% 70% 80% 90% 100%)、二甲苯、石蜡、蛋白甘油、苏木精、伊红、中性树脂、蒸馏水、盐酸酒精、甲醇、8%的Giemsa染色液、。量筒1个（25m） 、烧杯 、切片机 、酒精灯、恒温箱 、温度计、恒温水箱、盖玻片、载玻片、光学显微镜、解剖盘