课件：分子克隆工具酶.ppt

第2章 分子克隆工具酶,在基因工程的实际操作中，工具酶的使用是一项基本技术。 在体外对DNA进行分离纯化、连接重组或者修饰合成等，都会涉及一系列酶促反应。 用于基因工程的工具酶种类繁多(表2.1)、根据其功能可粗略分为限制酶、连接酶、聚合酶和修饰酶4类。,表2.1 常用工具酶与基因克隆技术,2.1 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能；限制酶的分类与命名；型限制酶的特性与DNA切割；影响限制性核酸内切酶活性的因素； 2.2 DNA连接酶 基本性质；连接作用；影响连接反应的因素； 2.3 DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶；Klenow fragment；T7 DNA聚合酶；T4 DNA聚合酶；修饰过的T7 DNA聚合酶；逆转录酶； 2.4 核酸修饰酶 核酸酶；碱性磷酸单酯酶；T4多核苷酸激酶；末端转移酶。 2.5 甲基化酶,主要教学内容,掌握限制酶和连接酶的性质与功能；了解聚合酶和修饰酶在基因操作中的用途。,重点与难点,限制酶的分类；常用限制酶的性质；影响连接反应的因素；聚合酶的分类与性质。,教学目标与要求,教学要求,需掌握专业词汇,限制与修饰；星号活性；偏爱现象；Klenow 片段；Reverse transcriptase，同裂酶与同尾酶。,核酸酶是通过切割相邻的两个核苷酸残基间的磷酸二酯键，导致多核苷酸链共价键断裂的一类水解酶，可分为核糖核酸酶(RNase)和脱氧核糖核酸酶(DNase)。 按其水解断裂核酸分子的不同方式： 核酸外切酶(exonuclease):从核酸末端顺次水解磷酸二酯键 核酸内切酶(endonuclease)：内部磷酸二酯键,2.1 限制性核酸内切酶,寄主控制的限制(restriction)与修饰 (modification)现象： 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其他宿主时会受到限制。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解。,2.1.1 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能,限制与修饰现象图解,Arber限制修饰酶,1968年，Meselson and Yuan 从E. coli菌株和中发现了型限制酶； 1970年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出Hind和Hind ,限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。,限制（Restriction）,细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。, Dam甲基化酶,GATC腺嘌呤N6位置引入甲基。, Dcm甲基化酶,CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基。,修饰（Modification）,2.1.2 限制酶的分类与命名,限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。 根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNA的特点，可以将限制性内切酶分为三类：型酶、型酶、型酶。,三种类型限制酶的主要特性差异比较,I型酶属复合功能酶，兼具限制、修饰两种功能。核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶4种活性。 显著特点：识别位点与切割位点不一致。 酶分子首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。 代表：EcoB和 EcoK。,I型限制性内切酶,识别位点序列,EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC,未甲基化修饰的特异序列。,需ATP、Mg2+和SAM(S-腺苷甲硫氨酸)。,作用机理,在距离特异性识别位点约10001500 bp处随机切开一条单链。,Recognize site,cut,1-1.5kb,切割位点,有核酸内切酶和甲基化酶作用。酶分子由两个亚基组成。M亚基负责位点识别与修饰，R亚基具有核酸酶活性。 在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸 ）。,在基因工程操作中用途不大。,EcoP1: AGACC,EcoP15: CAGCAG,类限制性内切酶,1970年，由H.O. Smith和K.W. Wilcox从流感嗜血菌中分离出来。分离的第一个酶是Hind 。 限制-修饰系统分别由限制酶与修饰酶两种不同酶分子组成，分子量小，能识别DNA的特殊序列，种类多，在基因工程中起重要作用。,型限制性内切酶,能识别双链DNA的特殊序列，并在这个序列内进行切割，产生特异的DNA片段。其种类繁多。 通常所指的DNA限制性核酸内切酶。 在基因工程技术中，I型不能用，型酶基本不用， 型酶最有用。,限制酶的命名,1973年Smith和Nathams提出限制酶的命名原则，1980年Roberts对其系统化，如今简化成： H i n d ，来源菌株 Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株,H i n d ,微生物属名,种名,株名(品系),发现序数,识别双链DNA分子中48对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构,EcoRI的识别序列,EcoR I的切割位点,2.1.3 型限制酶的特性与DNA切割 (1) 基本特性,大多为回文序列,EcoRI 37 ,退火 4-7 ,EcoRI等产生的5粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,PstI 37 ,退火 4-7 ,PstI等产生的3粘性末端,连接便利,不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。 同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。,粘性末端的意义, 补平成平齐末端,凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。, 5末端标记,凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。,粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。,Pvu 37 ,Pvu 等产生的平头末端,常用的限制酶及其识别序列和切割位点,同裂酶（Isoschizomers) 识别位点的序列相同的限制性内切酶。,完全同裂酶,识别位点和切点完全相同。 如Hind 和Hsu I。,Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5,(2) 同裂酶与同尾酶,识别位点相同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。,不完全同裂酶,识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等。,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,BamH I,Bcl I,5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5,5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5,Bgl ,5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5,Xho ,U代表嘌呤； Y代表嘧啶。,同尾酶(Isocaudamers）,5-GATC-3 3-CTAG-5,Sau 3A,同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。,？,5-G 3-CCTAG,GATCT-3 A-5,BamH I,Bgl ,5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5,BamH I,Bgl ,Sau 3A,限制酶识别序列与DNA的来源无关，不具有种的特异性，对不同的DNA普遍适用。 识别序列的长短涉及对DNA分子切割的频率，可从理论上推导酶切DNA片段的大小。,(3) 型限制酶的识别序列与DNA的切割,限制酶识别序列的相邻序列（长度要求）效应。大多数限制酶对只含识别序列的寡核苷酸也不具催化活性的。 限制酶的偏爱现象。限制酶对识别序列两侧的核苷酸的组成有关。（对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率） 限制酶的星星活性。指某些限制酶在不适的环境中其识别序列发生改变（切割与识别序列相似的序列）的现象。,(1) 底物DNA样品的纯度： 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、NaCl等。 加大酶的用量 （1个酶单位指在建议使用的缓冲液及温度下，在20l反应液中反应1h，使1 gDNA完全消化所需的酶量。） 加大反应总体积（稀释）， 延长反应时间,2.1.4 影响限制性核酸内切酶活性的因素 （酶切反应条件）,当DNA样品确定后，为完全切割此DNA，酶的用量视酶的催化活性而定。 酶活力单位：在最佳反应条件下反应 1 h，完全水解 1 mg 标 准DNA所需的酶量定为1U。 容积活性：1 ul酶溶液中具有的酶活力单位。 DNA所需酶量来换算。,酶用量,修饰体系组成部分，强烈影响酶的活性。 大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基。 受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I、 Bgl II、Sau3A I。 不受影响E.coli的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基。 受其影响的酶有EcoR II等哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基。,(2) DNA样品的甲基化程度,不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37，少数要求4065。,(3) 酶切消化反应的温度,缓冲液组分包括：氯化镁、氯化钠或氯化钾、-巯基乙醇或DTT、BSA、Tris-HCl等。 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些限制酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Star activity现象。 每种酶只有在最适的反应缓冲液中才具有最强的催化活性。,(4) 核酸内切酶的缓冲液性质,大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件,II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,050 mM 低盐酶；100 mM 中盐酶；150 mM 高盐酶 MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；,对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法： 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解；低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切；一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。, 型核酸内切酶的多酶联合酶解,修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键。,2.2 DNA连接酶,大肠杆菌DNA连接酶 只能催化双链DNA的互补黏性末端，以NAD+为能量。 T4噬菌体连接酶 黏性、平末端均可连接，以ATP为能量。,2.2.1 基本性质,2.2.2 DNA连接酶的连接作用,1）必须是两条双链DNA。 2）DNA3端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（P）。 3）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+,(1)连接条件,1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15反应 1 h，完全连接 1 mg l-DNA（Hind 片段）所需的酶量。,(2)DNA连接酶反应条件,ATP（NAD+)提供激活的AMP。 ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。 AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。,OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+,+H3N,AMP,ATP,PPi,(3)连接反应过程,“连接酶-AMP”复合物,AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。,-OH,HO-P-,AMP,-OH,O-P-,AMP,DNA-腺苷酸”复合物,3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。,连接多个平头双链DNA分子：,T4 DNA连接酶,1020倍。增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。,(1)插入片段与载体的浓度比例,(2)反应温度,12.5，一般1416。,3.酶用量,2.2.3 影响连接反应的因素,2.3 DNA聚合酶,催化以DNA为模板合成DNA的一类酶。,常用DNA聚合酶的特性比较,共同特点,把dNTPs连续地加到引物的3-OH端。,主要区别,持续合成能力和外切酶活性不同。 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。 其它几种聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。,常用的DNA聚合酶的特点,基本性质：53的DNA聚合酶活性 53的核酸外切酶活性 35的核酸外切酶活性,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-OH,5ppp dNTP Mg2+,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH,DNA pol,2.3.1 E. coli DNA聚合酶 (DNA pol),缺口前移标记法,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Nick translation,制备32P标记的探针,DNase,Mg2+ 5dNTP 5ppp dA（a-32P-dATP,DNA pol ,基本用途,基本性质 大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶； Klenow酶仍拥有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性。,2.3.2 E. coli DNA聚合酶 I 大片段(Klenow),基本用途,补平由核酸内切酶产生的5粘性末端 DNA片段的同位素末端标记 cDNA第二链的合成 双脱氧末端终止法测定DNA序列,补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,DNA片段的同位素末端标记,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,Klenow,a-32P-pppdA dTTP,3隐蔽末端的DNA片断,Klenow fragment补平,根据末端的顺序选择一种 -32P-dNTPs,末端标记的DNA,限制性内切酶切,5-G3 3-CTTAA5,5-GAA3 3-CTTAA5,5-GAATT3 3-CTTAA5,5-G3 3-CCTAG5,5-GG3 3-CCTAG5,5-GGATC3 3-CCTAG5,EcoR I,BamH I,-32P-dATP,-32P-dGTP,25 1h,mRNA,cDNA第一链,逆转录,cDNA第二链,klenow,5,3,3,5,5,3,引物,cDNA第二链的合成,2.3.3 T4-DNA聚合酶,基本特性 53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性； 在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切； 在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止； 在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。,切平由核酸内切酶产生的3粘性末端,注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多。,基本用途,DNA片段的同位素末端标记,从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成： T7基因5编码的大亚基： 有53聚合酶和35外切酶活性。 大肠杆菌编码的小亚基： 增加大亚基对模板的亲和性。,2.3.4 T7-DNA聚合酶, 持续合成能力强,一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。, 35外切酶活性高,单链和双链都能降解。, 不受DNA二级结构的影响,其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍。,T7 DNA聚合酶的特点, 进行末端标记, 以大分子量DNA为模板的合成,如M13, 补平隐蔽末端,取代合成法标记3末端。,与T4 DNA聚合酶相同。,合成补平3隐蔽末端； 水解修平3突出末端。,用 途,T7DNA聚合酶的化学修饰,去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。,修饰后的T7 DNA聚合酶的用途, DNA测序 双脱氧法。 标记DNA 3隐蔽末端 更有效地补平末端,修饰后的T7 DNA聚合酶,基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链,2.3.5 反转录酶,双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链,3 RNA,5,基本特性,2.4 修饰酶类,在基因克隆技术中，除了限制酶、连接酶、聚合酶这些主要的工具酶外，还经常使用某些酶的相关功能对DNA或RNA进行分子修饰，以使操作更加巧妙、简便和高效。,单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）,大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+,2.4.1 核酸酶,ExoV,Mg2+,大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从3端外切,双链核酸外切酶：核酸外切酶 （Exo）,lExo,Mg2+,核酸外切酶特异性地从5端外切,双链核酸外切酶：核酸外切酶(Exo),S1核酸酶的基本特性,单链核酸内切酶：S1核酸酶,来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzae） 降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍 Zn2+必需 最适pH范围为4.04.3 需要NaCl浓度10300 mM 降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍,内切单链DNA或RNA,5 G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,S1,Zn2+,5 G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,5 G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T 3,5dNMPs 或 5NMPs,基本反应,内切带切口或缺口的双链DNA或RNA,5 G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A 5,nick,gap,S1,Zn2+,5 G-C-T-C-A-G,3 C-G-A-G-T-C,T-G-G-A-G-T 3,A-C-C-T-C-A 5,基本反应,在DNA上定位RNA（S1 mapping）,DNA,mRNA,杂交,S1,EcoRI,重要用途,基本特性：来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana）,Ca2+,5dNMPs 或 5NMPs,ssDNA or RNA,Ca2+,Ca2+,单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶,诱发DNA突变,EcoRI,A,B,C,EcoRI,EcoRI,B,C,A,Bal31,B,C,A,环化,A,C,Bal31核酸酶的基本用途,来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP） 来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）,5p,OH 3,DNA or RNA,5ppp dN,5pppN,BAP / CIP,OH 3,5 HO,5HO dN,5HO N,2.4.2 碱性磷酸单酯酶,功能：催化核酸脱5-磷酸基团，使DNA或RNA片段5-P末端转换成5-OH末端。,碱性磷酸酶的活性,CIP的比活性比BAP的高出1020倍 CIP在SDS中68就可完全失活 而BAP却是热抗性酶。,注意,来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞。 T4-PNP的基本特性：催化-磷酸从ATP分子转移给DNA、RNA、dNR、NR的5-OH末端。 用于探针的末端同位素标记：,2.4.3 T4