六神丸血浆药物化学的研究.docx

六神丸血浆药物化学的研究 六神丸是一种拥有100多年历史，享誉国内外的著名中成药。六神丸由六味药材配置而成，包括牛黄、珍珠、蟾酥、明雄黄、麝香、冰片。其具有清热解毒、消肿止痛的作用1，2，应用于咽喉肿痛、痈疡疔疮等。现代中药开发中，将六神丸应用于更多疾病，如消炎、镇痛、抗肝癌、抗肿瘤等36。对于六神丸成分的分析，曹阳等有相关报道79。本文基于对六神丸HPLC图谱的分析，旨在建立六神丸血浆药物化学的研究方法，从而为探究六神丸有效成分及其作用机制奠定基础。 目前对于中药复方六神丸的有效成分研究过于分散而缺乏系统性，仍不能明确有效的物质基础。中药血浆药物化学以中药口服后含药血浆为对象，综合应用多种现代技术，分析鉴定含药血浆中的移行成分，包括中药原型成分及其代谢产物，以研究中药在体内发挥作用物质 。药物无论经过何种代谢必须由给药部位进入血液循环，以血液为介质输出到靶点，从而产生作用，中药亦是如此。药物进入血液可能是其原形化合物，也可能是其代谢产物，还有可能是机体应激产生的活性物质发挥药效1215。本实验通过对比分析空白血漿、体内六神丸血浆、体外六神丸血浆、体内标准品血浆以及体外标准品血浆的HPLC-UV图谱，研究六神丸进入血液后的原形药物及其代谢成分的变化状况。以此逆向追溯六神丸药效活性物质群，有助于建立六神丸基于生物效应的品质评价指标。 2材料与试剂 2.1仪器 仪器选用分析型高效液相色谱仪（Ultimate 3000 Pump、Ultimate 3000 Auto sampler、Ultimate 3000 Column Compartment、Ultimate 3000 Diode Array Detector） 2.2试剂 试剂包括：六神丸（上海雷允上药业有限公司，批号：140701），5-羟色胺盐酸（中国食品药品鉴定研究院，批号：111656），华蟾毒它灵（上海源叶生物科技有限公司，批号：p24N7F25514），蟾毒它灵（上海源叶生物科技有限公司，批号：p12O7F22619），蟾毒灵（上海源叶生物科技有限公司，批号：W05D6Z7090），华蟾酥毒基（上海源叶生物科技有限公司，批号：W10O7Z22424），酯蟾毒配基（上海源叶生物科技有限公司，批号：PJ0727RB13）。乙腈为色谱纯，乙酸乙酯（国药 AR），其他试剂均为分析纯。 2.3动物 健康雄性SD大鼠，体重220 g左右湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK（鄂）2015-0018。动物实验员操作证号：TY20160044。 3方法 3.1六神丸灌胃药液及标准品灌胃药液的制备 将六神丸研磨成粉，称取一定量六神丸粉末，配制成8.0 mg/mL的水溶药液，超声30 min，使其充分溶解，于4 冰箱保存，备用。 将华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾毒灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵配制成1 mg/mL的水溶液，超声30 min，使其充分溶解，于4 冰箱保存，备用。 3.2体内六神丸血浆样品和空白血浆样品的制备 空白血浆的制备：健康SD大鼠4只，禁食12 h，灌胃生理盐水，在1 h后，将每只大鼠摘眼球取血，各5 mL以上，置于含肝素钠抗凝剂的离心管内，备用。 体内六神丸血浆样品制备：健康SD大鼠3只，禁食12 h，灌胃六神丸水溶液（36.0 mg/kg）约1 mL，给药1 h后，每只大鼠摘眼球取血5 mL以上，置于含肝素钠抗凝剂的离心管内，制备3份样品备用。 取以上制备的样品各5 mL，加入25 mL乙酸乙酯，漩涡混悬30 s，3000 r/min离心5 min，取上清液；将沉淀再加25 mL乙酸乙酯，旋窝混悬30 s，3000 r/min离心5 min，取上清液。合并两次上清，挥干溶剂，在进样前加入300 μL甲醇，使充分溶解后，用0.45 μm 的滤头过滤备用。 3.3体外六神丸血浆样品的处理 为减小药物与血液样品处理方法不同所带来的误差，取3.1节条件下制备的六神丸灌胃液1 mL和5 mL空白血浆混合，漩涡混悬30 s，静置1 h，按照血浆样品处理方法进行预处理，平行制备3份样品备用。 3.4不同时间点含药血浆样品的处理 健康SD大鼠15只，禁食12 h，分成0.5、1、3、6、24 h五组，每组三只大鼠，每组大鼠灌胃六神丸水溶液（36 mg/kg）一次，约1 mL，在给药后0.5、1、3、6、24 h的时间点，每组大鼠摘眼球取血5 mL以上，本文由收集整理置于含肝素钠抗凝剂的离心管内。每份样品取血浆5 mL，加25 mL乙酸乙酯，漩涡混悬30 s，3000 r/min离心5 min，取上清液；将沉淀再加25 mL乙酸乙酯，旋窝混悬30 s，3000 r/min离心5 min，取上清液。合并两次上清，挥干溶剂，在进样前加入300 μL甲醇，使充分溶解后，用0.45 μm的滤头过滤，制备得到15份样品，备用。 3.5体内标准品血浆样品的处理 健康SD大鼠15只，禁食12 h，分成华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾毒灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵五组，每组3只，将3.1节条件下制备的标准品溶液给每组大鼠灌胃（5.0 mg/kg）约1 mL，每组给药1 h后，每只大鼠摘眼球取血5 mL以上，置于含肝素钠抗凝剂的离心管内。每份样品取血浆5 mL，加25 mL乙酸乙酯，漩涡混悬30 s，3000 r/min，离心5 min取上清液；将沉淀再加25 mL乙酸乙酯，旋窝混悬30 s，3000 r/min，离心5 min取上清液。合并两次上清，挥干溶剂，进样前加入300 μL甲醇，使其充分溶解，0.45 μm滤头过滤，制备15份样品以备用。 3.6体外标准品血浆样品的处理 为减小药物与血液样品处理方法不同所带来的误差，取3.1节条件下制备的5种标准品样品各1 mL，分别与5 mL空白血浆混合，漩涡混悬30 s，静置1 h，按照血浆样品处理方法进行预处理。每种标准品平行制备3组备用。 3.7高效液相色谱条件 DIONEX ultimate 3000 高效液相色谱仪；DIONEX C18色谱柱（250 4.6 mm， 5 μm），流动相为乙腈（A）和0.1%三氟乙酸水溶液（B）。梯度洗脱，03 min，5%（A）；313 min，5%12%（A）；1315 min，12%20%（A）；1525 min，20%30%（A）；2530 min，30%51%（A）；3050 min，51%（A）；5060 min，5%（A）。体积流量1.0 mL/min，进样量10 μL，检测波长296 nm，柱温30 。 张妹砣，等：六神丸血浆药物化学的研究 生物与化工 4结果与分析 4.1六神丸入血后移行成分的分析 将空白血浆样品、体内六神丸血浆样品和体外六神丸样品在2.7色谱条件下进样，进样量为10 μL。相对空白血浆样品的HPLC图，体内六神丸血浆样品的HPLC图中出现了14个移行成分，如图1。与体外六神丸样品比较，其中10、11、12、13、14号等五个成分保留时间与原型成分相同，可能为六神丸中所含的原型成分直接吸收入血。其中11号和12号移行成分相对其他成分含量显著较高，而体外六神丸血浆样品中所含的大部分原型成分在体内已明显下降甚至消失。其它9个成分为新产生的代谢产物，可能是六神丸中其他物质转化生产，也可能是体内应激反应产生的代謝产物。六神丸灌胃后入血的14种成分为六神丸在体内直接作用物质，研究其变化规律将有利于进一步探究其活性成分和作用机理。 4.2六神丸入血后成分含量变化的检测 在3.4节条件下，制备不同时间点的体内六神丸血浆样品，在3.7节条件下进样，进样量为10 μL。如图2-A所示，有部分代谢产物如10、11、12、14号移行成分含量逐渐增加，其中11号和12号移行成分随着时间延长，浓度显著增加，呈现浓度-时间依赖关系。以峰面积为纵坐标，时间为横坐标，建立关系曲线，如图2-B所示，可发现12号移行成分的浓度在6 h累计达到最大值，之后随着时间延长呈缓慢降低趋势。11号移行成分的浓度随着时间延长不断增加。另一方面，随着时间延长，有的代谢产物逐渐减少如13号移行成分，有些甚至消失如5、6、9号三个移行成分。在24 h时，还产生新的代谢产物15号成分。值得注意的是，增加的10、11、12、14号移行成分与六神丸中主要原型成分的保留时间十分相近，可能为原型产成分。而减少的5、6、9号物质应为新产生的代谢产物。由此可知，六神丸灌胃后，有的以原型入血，且不断通过其他成分转化或体内应激反应生成，使得含量不断增加。部分转化为新的代谢产物，由于缺少来源，逐渐减少甚至消失。而15号峰可能为体内应激反应产生的代谢产物。由此可见，六神丸的药效关系是复杂多变的，不是单成分代谢反应的叠加，而是受机体吸收、代谢及成分间相互作用的综合影响，使得中药复方六神丸比单味药、单体用药效果更显著。 4.3标准品入血后移行成分的分析 在3.5节条件下制备的体内标准品血浆样品，在3.6节条件下制备的体外标准品血浆样品，在3.7节的条件下进样分析，进样量为10 μL。如图3所示，对比标准品在体外、体内的成分变化，发现六神丸中华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾毒灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵在 体内代谢后进入血浆的成分，主要为10、11、12、13号移行成分，主要转化为12号移行成分。将12号移行成分的峰面积与体外标准品的峰面积相比，推测华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾毒灵、蟾毒它灵转化成12号移行成分的转化率为：7.48%、2.93%、0.55%、0.94%。由此可见，华蟾酥毒基转化率相对最高，酯蟾毒配基的转化率次之，蟾毒灵的转化率最低，同时，华蟾酥毒基在体内转化为10、11号物质对应的峰面积也是最高的。这与六神丸体内代谢的移行成分的分析相契合，说明六神丸中的大部分成分在体内主要转化为12号类物质，发挥有效或制毒作用。在本实验室之前的工作中，发现六神丸醇提物对抗肝癌活性较六神丸水提物强，对六神丸的各成分含量分析发现，在其他成分含量相当的前提下，六神丸醇提物中的华蟾酥毒基与酯蟾毒配基的含量是六神丸水提物的四倍，这与血浆中华蟾酥毒基与酯蟾毒配基的代谢分析相契合。推测华蟾酥毒基、酯蟾毒配基以及代谢生成的12号移行成分，可能是六神丸发挥作用的有效物质。 2017年6月绿色科技第12期 5结语 六神丸是传统中药名方，对其药物代谢研究得较少，对体内血浆药物化学鲜有报道。在血浆样品的制备中，对比了甲醇、乙腈、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷提取血浆中六神丸成分的效果，发现乙酸乙酯的提取效果最佳且稳定，对样品也不造成的干扰。每组制备的三份平行样品，相同条件下进样分析所得HPLC图谱相似，以其中最大峰为指标，测定峰面积的RSD值均小于5.32，说明本系统的方法稳定，具有重现性。 本文首次建立了体内六神丸血浆成分的HPLC图，并实现所有成分的有效分离，与体外六神丸的HPLC图进行对比分析，探索六神丸进入体内的成分代谢变化，利用标准品体内、体外的HPLC图对比，发现其都向12号物质移行，这体内六神丸血浆样品的主要成分分析相契合。这一现象的发现，部分揭示了六神丸入血后移行成分变化规律，为之后六神丸有效成分研究奠定基础，也为六神丸的再开发提供参考与借鉴