生化仪器分析指导书-最终版.doc

生化仪器分析实验指导书辽宁石油化工大学化学化工与环境学部实验教学中心9目 录实验一 紫外分光光度法测定维生素C含量1实验二 气相色谱法测定醇的同系物4实验三 原子吸收测定金属含量7实验一 紫外分光光度法测定维生素C含量实验项目性质：验证性所属课程名称：生化仪器分析实验计划学时：6学时一、目的要求：1、理解紫外分光光度法的原理2、掌握紫外可见分光光度计的结构、性能及使用方法3、掌握应用标准曲线进行定量分析的方法二、实验原理 紫外分光光度法(Ultraviolet Spectrophtometry)，又称紫外吸收光谱法( Ultraviolet Moleculor Absorption Spectrophtometry)，它是研究分子吸收190.0-1100.0nm波长范围内的吸收光谱。紫外吸收光谱主要产生于分子价电子在电子能级间的跃迁，是研究物质电子光谱的分析方法。通过测定分子对紫外光的吸收，可以对大量的无机物和有机物进行定性和定量测定。维生素C在紫外光区的最大吸收波长max=243nm。对Vc溶液进行扫描时，在243nm处有较强的吸收峰。 定性分析时，可在相同的条件下，对标准样品和未知样品进行波长扫描，通过比较未知样品和标准样品的光谱图对未知样进行鉴定。在没有标准样品的情况下，可根据标准谱图或有关的电子光谱数据表进行比较。光的吸收定律即郎伯-比尔定律，定量的说明物质对光选择性吸收的程度与物质浓度及液体厚度之间的关系，是可见-紫外分光光度计定量分析的基础。郎伯-比尔定律： 式中：A吸光度；K比例系数；C吸光物质的浓度；b溶液的液层厚度，即光线通过溶液的光程长度，它取决于吸收池的厚度。定量分析是在243nm处测定不同浓度苯酚的标准样品的吸光值，并自动绘制标准曲线。再在相同的条件下测定未知样品的吸光度值，根据标准曲线可得出未知样中Vc的含量。三 、实验仪器和药品UV1100紫外可见分光光度计（带比色皿）、离心机、分析天平、容量瓶（100ml、25ml）；比色管（25ml）12个；吸量管（1ml、2ml、5ml）；研钵、吸耳球、玻璃棒、洗瓶。10%HCl：133mL浓HCl，加水稀释至500mL。1%HCl：取浓HCl 2.66ml，加水稀释至100ml。1mol/L NaOH溶液：称取40gNaOH，加蒸馏水，不断搅拌至溶解，然后定容至1000ml。 四、实验步骤（一）吸收曲线的绘制1、抗坏血酸标准溶液的配制：用分析天平准确称取抗坏血酸10mg，加2ml 10%盐酸，加蒸馏水定容至100ml，混匀。此抗坏血酸溶液的浓度为100g/ml。 2、吸收曲线的绘制：用移液管取Vc标准溶液5ml于25ml的比色管中，稀释至刻度，摇匀，选用1cm石英比色皿，以蒸馏水为参比，在200300nm波长范围内用紫外分光光度计自动扫描。绘出A吸收曲线（每5nm记录对应吸光值），该曲线确定的最大吸收波长即为测定波长。（二）标准曲线的制作1、取样： 取带塞刻度试管8支并编号，分别按表内所规定的量加入抗坏血酸标准溶液和蒸馏水。 12345678标准抗坏血酸溶液体积ml0.250.50.7511.251.522.5蒸馏水ml24.7524.524.252423.7523.52322.5总体积ml2525252525252525抗坏血酸溶液浓度g/ml1.02.03.04.05.06.08.010.02、吸光值的测定以蒸馏水为空白，在上面实验测定最大波长处测定标准系列抗坏血酸溶液的吸光值，以抗坏血酸的含量（g）为横坐标，以相应吸光值为纵坐标作标准曲线。（三）样品的测定 1、样品的提取（1）青椒待测液：将青椒洗净、擦干、切碎、混匀。称取5.00g于研钵中，加入25ml 1%HCl，匀浆，转移到25ml容量瓶中，稀释至刻度、混匀。转移至离心管中3500r/min离心10min，取上清液测定含量。 （2）橙子待测液：取橙肉5.00g于研钵中，重复上述操作。2、待测样品（1）待测青椒：取0.5ml青椒提取液，放入盛有1ml 10% HCl的25ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为空白，在最大波长处分别测定其吸光值。（2）待测橙子：取0.5ml橙子提取液，其他操作同上。测定吸光值。3、待测碱处理液的制备（1）碱处理青椒提取液：吸取0.5ml青椒提取液，5ml蒸馏水和2ml 1M NaOH溶液依次放入25ml容量瓶中，摇匀；20min后加入2ml 10% HCl，混匀，并定容至刻度。以蒸馏水为空白。在最大波长处分别测定其吸光值。 （2）碱处理橙子提取液：吸取0.5ml橙子提取液，其他操作同上。测定吸光值。4、由待测样品与待测碱处理样品的吸光值之差代入标准曲线，即可分别计算出青椒和橙子中Vc的含量。 五、数据处理要求：1、以为横坐标，以A为纵坐标，绘制出维生素C在200-300nm间的吸收曲线。2、以配制的系列标准液的质量为横坐标，以相应的吸光度为纵坐标，用Excel回归出相应的标准曲线，并给出标准曲线方程和相关系数。打印出图贴于报告上。3、利用标准曲线计算出Vc的及其在蔬菜水果中的含量式中： 根据标准曲线计算得到Vc的含量（g） V1测吸光值时吸取样品溶液的体积（ml） V总样品定容体积（ml） W总称样重量（g）4、比较蔬菜水果中Vc含量多少。六、思考题1、紫外可见分光光度法的定性、定量分析的依据是什么？2、紫外可见分光光度计的主要组成部件有哪些？3、说明紫外可见分光光度法的特点及适用范围。实验二 气相色谱法测定醇的同系物实验项目性质：演示性所属课程名称：生化仪器分析实验计划学时：4学时一、目的要求：1掌握气相色谱分析方法的原理以及气相色谱仪的主要构成和各部分的作用2了解气相色谱分析仪的简单操作方法以及注意事项3掌握实际气相色谱分析方法中物质定性和定量的方法二、实验原理：气相色谱法是根据不同的物质在两相-固定相和流动相构成的体系中，具有不同的分配系数，当两相做相对运动时，这些物质也随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，这样就使的那些分配系数只有微小差别的物质，在移动速度上产生很大的差别，从而使各组份达到了完全分离。具体来说是当汽化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组分就在其中的两相间进行反复多次的分配（吸附脱附放出）由于固定相对各种组分的吸附能力不同（即保存作用不同），因此各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流信号经放大后，在记录器上描绘出各组分的色谱峰。CD叫基线，CHEJDBC为组分波峰总面积，BE为峰高，HJ为峰半高宽度，简称半宽，0B为保留时间（分），0A为空气峰时间（分）基于不同物质在相同条件下对同一色谱柱的保留时间Rt可能不同进行定性；物质的量与色谱峰面积呈线性的关系进行定量，归一化公式如下： 100%三 、实验仪器和药品主要仪器：气相色谱仪（G-3900）一台，氮气瓶、氢气瓶各一钢，毛细管柱一个，微量注射器一个，容量瓶若干。药品：甲醇 、乙醇、丙醇、丁醇、异戊醇（分析纯）四、实验内容及主要步骤1）气相色谱分析条件的确定本实验采用毛细管分离柱，FID检测器，载气为氮气，流速为1.5mLmin恒流，进样口温度200，检测器温度250，程序升温：从45以5/min升至50，然后以20/min升至230，分流比20：1。2）将填充好的长2m内径2mm的色谱柱的进口端接入色谱仪，出口端放空，在0.3Mpa的载气和200 oC的柱温下老化8h。老化好的色谱柱出口端接通FID。3）打开气相色谱仪电源，调节柱温、进样器温度、载气压力、氢气压力等条件，使仪器稳定后，以含有甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异戊醇的混合物为测定试剂， 用1L的进样器进样0.2L，采集谱图。 4）定性：根据谱图中的保留时间进行定性。5）定量方法： 采用归一化方法，由于本实验所测定的醇类相对校正因子很近似，采用直接面积归一化的方法：其中Pi为某组分的百分含量，Ai为相应组分的峰面积。五、数据处理：1）根据实验得到的保留值定性：2）定量分析：根据实验中计算机给出的峰高和峰面积数据，用面积归一化方法计算出各个组分的含量，填写在下表中，并举一例写出具体的计算步骤。表1 实验数据表序号名称保留时间（min）峰高（uv）峰面积（uv*s）含量（%）1甲醇2乙醇3丙醇4丁醇5异戊醇 六、思考题1）常见的气相色谱仪一般有哪几部分组成？2）本实验所用的FID检测器具体是指什么？还有那些类型的检测器？3）在气相色谱分析中定量的方法还有什么方法？4）应用气相色谱分析方法应注意那些事项？ 实验三、原子吸收测定金属含量实验项目性质：综合性所属课程名称：生化仪器分析实验计划学时：6学时一、目的要求：1.掌握原子吸收分光光度法的基本原理2.了解原子吸收分光光度计的主要结构及操作方法3.掌握定量分析的方法二、实验原理：溶液中的铜离子在火焰温度下变成铜原子，由光源铜空心阴极灯辐射出的原子光谱锐线（铜特征共振线波长为324.7 nm，）在通过原子蒸汽时被强烈吸收，吸收的程度与火焰中原子蒸汽浓度的关系是符合比耳定律的，即：A=-log(T)=KNL（其中：A吸光度，T透光度，L原子蒸汽的厚度，K吸光系数，N单位体积原子蒸汽中吸收辐射共振线的基态原子数），原子蒸汽浓度N是与溶液中离子的浓度成正比的，当测定条件一定时A=KC（C溶液中离子的浓度，K与测定条件有关的比例系数。）在即定条件下，测一系列不同铜离子含量的标准溶液的A值，得AC的标准曲线，再根据未知溶液的吸光度值即可求出未知液中铜的浓度。三 、实验仪器和药品3510原子吸收分光光度计，铜空心阴极灯，乙炔钢瓶，空气压缩机，容量瓶（1000ml），具塞比色管试管（25ml），移液管（1ml、2ml、5ml)，洗瓶。硫酸铜（CuSO4.5H2O）、盐酸（分析纯）。铜标准溶液：取纯CuSO45H2O 3.9289g，用适量稀盐酸溶解后，再用体积分数为 1的盐酸稀释至 1L，此溶液浓度为 1.00g/L，取上述铜溶液再稀释成0.10mg/mL 。四、实验内容及主要步骤1、样品处理分别称取茄子和菠菜各10g，切碎，放于150mL烧杯中，加入25mL混合酸（硝酸：高氯酸 = 20：5），盖上表面皿浸泡过夜，在电炉上加热消解，当有大量棕色气体产生时，减小火力，并保持微沸状态，待溶液变清并冒白烟为止。冷却加少量蒸馏水，用漏斗过滤，滤入25mL容量瓶中，用纯水少量多次洗涤烧杯，洗液合并过滤于容量瓶中并用水定容至刻度，混匀备用。2、配制系列标准溶液：在7只25ml的比色管中分别加入标准铜溶液（铜：0.1 g.L-1）0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0ml，用去离子水稀释至25ml，混合均匀。3.仪器主要的操作步骤和条件设定1）装灯：将铜空心阴极灯和仪器线路接好。2）打开主机电源，待仪器自检结束后，设定积分时间为2秒（按【2】和【时间】键），灯电流为2mA（按【2】和【灯2】键），波长设定为324.7 nm（按数字键键入312.7nm和【波长】键），按【增益】键，调吸光度为0.000，并使能量显示在76-89之间。3）检查排废液管（燃烧头下部）水封圈情况，保证水封气路。4）点火：打开空气压缩机，调整压力为0.3Mpa左右；打开乙炔气钢瓶（逆时针），打开减压阀（拧紧），使乙炔气减压阀输出为0.1Ma；旋转助燃气旋钮，使空气流量指示在6L/min；按【点火】键，是乙炔气流量在2 L/min，并用点火器在燃烧头位置点火，使火焰高度在5cm左右。4标准曲线的绘制和未知样的测定：1）按【连续/保持】键，使连续灯亮，吸喷空白溶液（去离子水，待能量稳定后，按【增益】键，调零，使主显示为0.000。2）吸喷待测样，分别测定系列标准溶液，待能量稳定后，按【连续/保持】键，使保持灯亮，待过积分时间后，按【读数】键，记录显示的吸光度值。3）用滤纸擦洗液吸管，重复2），连续测定。记录不同浓度Cu对应吸光值及茄子、菠菜吸光值。（茄子和菠菜吸光值测三次求均值。）5. 测量结束后，吸喷10ml去离子水清洗燃烧系统。6.关气熄火：先关乙炔气钢瓶总阀，使表显示为零；按【检查】键放气，使流量显示为零，关闭减压阀（拧松）；重