WNT信号通路.ppt

Wnt/-catenin信号 转导途径,Wnt信号通路,人类Wnt基因家族由19个成员组成，编码具有22或24个半胱氨酸残基的保守糖蛋白。 Wnt信号转导途径可以分为决定细胞命运的经典途径和控制细胞运动及组织极性的非经典途径。,Wnt途径的发现,Wnt基因于1982年发现，最初是作为小鼠乳腺肿瘤病毒优先整合的位点而被鉴定的，该基因能在细胞间传递增殖和分化信息，是一种癌基因，当时被命名为Int基因(小鼠Int-1和Int-3)。随后发现它与果蝇的无翅基因(wingless)属直相同源基因(orthologous gene)，从而将二者结合命名为Wnt基因。随着研究的不断深入人们发现Wnt基因家族非常庞大，为多基因家族，其基因结构从低等的无脊椎动物到脊椎动物乃至人类具有高度保守性，其同源序列达27-83%，对动物的生长发育起着至关重要的作用。Wnt基因编码的WNT蛋白，可启动细胞内信号传导途径，传导生长刺激信号，参与不同的发育机制，如细胞分化，移行，以及决定细胞命运的增殖等。因其启动蛋白为WNT蛋白，故命名为Wnt信号途径。,1996年，Wnt途径的主要成员被相继确定和克隆。研究发现，这一信号途径主要包括三个环节，即由Wnt配体与胞膜受体的特异性结合，引发胞内一系列级联反应，进而调节核内的基因表达。传统的信号途径系统观点认为，信号是从细胞表面到细胞核的线性传递。Wnt信号途径的起点为胞膜，由分泌性信号蛋白Wnt，通过跨膜的受体蛋白，经由多种细胞内蛋白将信号传至细胞核内。这点上看，它是一种与传统观点相一致的信号途径系统。然而许多研究发现，Wnt途径和其他细胞功能、信号传递过程相互交叉，不是直线型的结构，而是一个网络调节模式，具有几个关键调控点。,Wnt途径总的框架,1.Wnt/-cantenin途径，即典型的Wnt/-cantenin信号途径(canonical Wnt/-cantenin pathway)。该途径通过-cantenin的核易位，激活靶基因的转录活性。 2.平面的细胞极性途径(planar cell polarity pathway)， 涉及RhoA和Jun N端激酶以及细胞骨架的重排。目前还没有实验资料证明该途径参与肿瘤的发展。 3.Wnt/ca2+途径，由Wnt5a和Wnt11激活，增加胞内Ca2+含量，激活蛋白酶C、磷脂酶C和转录因子NF-AT。Wnt/Ca2+途径可以和典型的Wnt/-cantenin信号途径相互作用，但是该途径在肿瘤发生中是否起作用尚不清楚。,Wnt信号途径,Wnt途径的组成和实现,研究Wnt途径的组成，主要运用基因和分子生物学相结合的手段加以分析与认定，Wnt途径候选分子的确定标准为：该分子失去功能显性，则Wnt信号途径的功能即消失，而该分子获得功能时，Wnt信号途径也同时具有功能。经过十多年的研究，目前认为Wnt途径的主要组成为：Wnt信号蛋白，胞膜受体FZD家族，胞浆内-catenin、Dsh、APC、GSK3等蛋白分子,细胞核内LEF/TCF转录因子家族等。,胞内信号传递,Wnt信号进入胞内后，将信号传递给Dishevelled(Dsh)，活化的Dsh抑制由Axin、APC (adenomatous polyposis coli)和GSK-3(serin/threonine glycogen synthasekinase 3)组成的复合物的活性,使-catenin不能被GSK-3磷酸化。磷酸化的-catenin才可通过遍在蛋白化(ubiquitination)而被胞浆内的蛋白酶体所降解，由于非磷酸化的-catenin不能被蛋白酶体降解，从而导致-catenin在胞浆内积聚，并移向核内。当游离的-catenin进入细胞核内，即可与转录因子TCF/LEF(T-cellfactor/Lymphoid enhancer factor)结合，激活TCF转录活性，调节靶基因的表达。因此,-catenin是否磷酸化是该信号传递的关键因素。,靶基因,目前已经研究鉴定出多种Wnt途径的靶基因，它们在细胞增殖、分化以及肿瘤形成中起重要作用。主要包括：细胞周期和凋亡相关基因c-myc和cyclinD1,生长因子如VEGF(vascular endothelial growth factor),胃泌素(gastrin)、HGF(hepatocyte growth factor)、c-met等。参与肿瘤进展的基因MMP7(matrilysin)、MMP26、CD44和Nr-CAM,转录因子ITF-2(immunoglobulin transcription factor-2)和Id2,其他靶基因如COX-2等.由于这些因子在细胞增殖、分化以及肿瘤发生发展中分别体现不同的特点，因此Wnt信号传递是一种由多因子组成、涉及多个环节、多种调控的复杂过程。,在正常生长的成熟机体中，细胞的生长、增殖和分化等具有一定的规律性和有序性。有限生长的细胞在没有Wnt信号时，Wnt通路呈关闭状态。但当Wnt途径激活时，就可能导致许多细胞出现灾难性的变化，使细胞发生异常的增生和分化，导致肿瘤形成。,Wnt途径异常激活主要见于： 1）组成Wnt途径的蛋白、转录因子或基因被破坏或变异，导致该途径关闭或局部途径异常活跃； 2）过多Wnt信号使整个途径异常活跃，细胞进行不必要的增殖； 3）细胞内其他因素通过Wnt途径来刺激或诱发细胞产生异常反应。,在Wnt途径中,-catenin-TCF/LEF复合体无疑是Wnt途径的枢纽。如前所述，Wnt途径激活是以-catenin定位变化-易位为基础，一旦-catenin易位于细胞核内，与TCF/LEF结合，即可启动Wnt途径。因此，Wnt途径的调控可分为两部分：上游各组分结构和功能变化导致-catenin降解障碍，引起-catenin胞浆内积聚；核内-catenin激活TCF/LEF引起下游靶基因转录，通过推动细胞周期发展或产生异常蛋白，使细胞发生癌变。,-catenin是第一个被确定为Wnt途径的成员。在细胞内,-catenin具有二个定位池：一个是位于细胞膜,与E-cadherin和-catenin形成粘附复合体，参与细胞黏附；另一个则在胞浆。-catenin基因定位于3p21，由16个外显子组成，其中外显子3的第37，33，41，45位密码子编码区域构成-catenin蛋白的NH2末端，是GSK3的结合部位，也是致癌活化的位点，该区域的定向突变或缺失可导致-catenin活性过高，致使GSK3对-catenin降解受阻，-catenin在胞浆内积聚。Clements对311例胃癌标本进行-catenin的检测，发现29%病例存在-catenin核内易位，19%存在3号外显子突变。,研究发现，许多肿瘤中存在着不同程度的-catenin基因突变。如结直肠癌、肝细胞癌、甲状腺癌、卵巢癌和皮肤癌,-catenin突变率可达50以上，前列腺癌、子宫内膜癌和Wilms瘤等为15左右，胃癌为26。突变位点多集中在外显子3区域，特别是GSK3的结合部位。-catenin的定位改变，除了受其本身基因突变的影响外，Wnt途径上游各组分形态和功能的变化也可影响-catenin的状态。主要包括Wnt,APC,GSK-3和Axin。,APC(adenomatous polyposis coli)是一种与结肠癌发生有关的抑癌基因。定位于5q21，长度10.4kb，编码一组较大的多结构域蛋白，属于胞浆蛋白，具有支架蛋白的作用。APC蛋白、Axin和GSK3,可与-catenin形成复合物，而促进-catenin发生磷酸化，使-catenin得以被蛋白酶降解。在固有的和散在的大多数结直肠肿瘤中，均已发现有APC基因的突变或缺失。APC基因突变可发生于任何外显子，其中以第15外显子（654-2843密码子）最为常见2000，1020-1169密码子和1323-2075密码子编码区域被认为是-catenin与APC的结合位点，该区域突变即导致-catenin不能与APC结合，进而不能被GSK3磷酸化，以致-catenin降解受阻而积聚于胞浆。因而APC是Wnt途径的负调控因子。在其他癌症如髓母细胞瘤，侵袭性纤维瘤病，乳腺癌等也可见APC异常。,Axin具有多个蛋白-蛋白作用域，与APC一样起支架蛋白的作用，是支架蛋白复合体的构建基础。Axin的RGS功能域(regulators of G protein signaling domain)，能与全长的APC结合，但不能与截短的无活性APC结合。APC-Axin-GSK-catenin形成复合物时，GSK靠近-catenin而促使其磷酸化，因此也是Wnt途径的负调控因子。在肝癌、结直肠癌、乳腺癌等肿瘤中检测到Axin基因突变，目前Axin被认为是抑癌分子，其基因突变可促进肿瘤的发生。,GSK(serin/threonine glycogen synthase kinase 3)可使-catenin磷酸化，磷酸化位点为-catenin的4个N端位点（s33,s37,T4,s45），这些磷酸氨基作为-catenin磷酸化的一种标志，表明它将被蛋白酶体通过水解而降解。GSK3是Wnt途径的负调控因子，同时也是候选抑癌分子。在Wnt信号通路发生异常时是否存在GSK3的突变问题尚少探讨，但已有在结肠癌中没有检测到GSK3突变的报道，GSK3是否具有其他功能，以及可能在其他途径中发挥重要的作用还有待研究。,DSH(Dishevelled)是Wnt途径正调控因子，其N端的DIX域，可结合Axin，中央区的PDZ域，为蛋白-蛋白相互作用的位点，可结合多种蛋白质，如CKI-,CBP/Frat,酪蛋白激酶等，而其C端DEP域则具有调节细胞的极性及移动的作用。,Wnt分泌蛋白及其受体FZD在肿瘤中也可出现异常表达。在结肠癌、胃癌中，可见Wnt2、Wnt5A、FZD1/2表达明显高于正常粘膜组织。但Wnt基因的突变和错义表达与人类肿瘤的直接联系迄今尚待阐明。To等对12例胃癌标本（7例为肠型，4例弥散型，1例混合型）检测Wnt受体FzE3及其相关蛋白hsFRP的变化情况，研究发现，75病例存在FzE3表达上调，同时也观察到-catenin，hsFRP和cyclinD异常表达。在胃癌细胞株的研究中发现，FZD2，FZD5，FZD7，FZD8，FZD9在不同的细胞株异常表达；Wnt家族的多个成员在另外一些细胞株也检测出有的情况高表达。,TCF是Wnt途径下游组分，属于DNA结合蛋白，包括1个HMG盒子(highmobility group)和-catenin作用域。HMG盒子具有与DNA结合的活性，通过与其它因子发生作用，而激活转录活性。有趣的是，TCF转录因子家族的不同成员具有不同的特性。尽管它们都可结合DNA，但在大部分情况下并不能激活转录，只有与-catenin发生作用后，才可激活转录过程。有报道在结直肠癌中，检测出Tcf-4突变，且同时存在APC或-catenin的突变，推测Tcf-4突变可能是附加突变。,Wnt途径激活与肿瘤细胞的侵袭和转移,癌细胞最为重要的生物学特征是具有侵袭和转移的能力，这是造成恶性肿瘤患者预后不佳和导致死亡的主要原因。癌细胞的侵袭和转移包括以下几个过程：癌细胞粘附性改变，从原发灶脱落，突破基底膜，与细胞外基质作用，侵入周围基质和邻近组织，然后侵入淋巴管或血管，随血流或淋巴，在远部器官或组织建立新的癌细胞集落。在此过程中，涉及到细胞粘附性的改变，细胞外基质的降解，细胞增殖的改变及肿瘤血管形成等。随着对Wnt途径研究的深入，发现Wnt途径异常激活后，其靶基因中有些是与癌细胞的侵袭转移相关的基因，因而推测Wnt途径也可参与肿瘤的侵袭和转移。,细胞间粘附的破坏可促进癌细胞的迁移和浸润，导致侵袭和转移。-catenin在细胞中起着双重作用：除了参与Wnt信号转导外，还与E-cadherin形成复合物定位于细胞膜，维持细胞间的粘附。在结肠癌研究中发现，在肿瘤侵袭前缘，癌细胞膜上E-cadherin表达基本消失，然而胞核内可观察到-catenin表达。因而Wnt途径可能影响E-cadherin的表达，利于癌细胞的侵袭。APC的突变也可通过激活Asef，降低E-cadherin介导的细胞间的粘附。靶基因Nr-CAM为免疫球蛋白类粘附分子，参与细胞间的连接，可转化成纤维细胞，肿瘤的侵袭和转移与该靶基因活动性增加亦密切相关。,CD44基因编码合成的CD44属于细胞粘附分子，主要参与细胞-细胞、细胞-基质之间的特异性粘连过程，影响细胞的生长、浸润和迁移，在癌症的生长、淋巴结转移和远距离器官种植方面起着重要的作用。其拼接变异体CD44在正常粘膜上皮不表达，在转移性结肠癌中表达明显增强，且与不良预后有关，在胃癌等肿瘤中也观察到类似情况。有研究表明CD44可明显促进肿瘤细胞的分裂增殖和循环肿瘤细胞在继发器官的定位，并能通过促进ras基因的表达增加迁移蛋白的产生，是肿瘤转移的促进基因。另外，CD44表达阳性的癌细胞可产生免疫逃避，因而容易经淋巴道引起肿瘤细胞的侵袭和转移。虽然CD44在肿瘤转移过程中起作用。,在肿瘤侵袭和转移过程中，细胞外基质的降解是重要的步骤，癌细胞只有破坏细胞外基质才可侵入血管，随血流转移到其它器官。蛋白水解酶可使细胞外基质降解，其中最为重要的是基质金属蛋白酶。MMP-7是蛋白溶解酶家族成员，通过降解基底膜和细胞外基质，促使肿瘤细胞的侵袭和转移。在转移性结肠癌的研究中，应用细胞系、动物模型或人癌标本，均观察到MMP-7的高表达。作为Wnt途径的靶基因，MMP-7不仅在结肠癌中与-catenin共表达，而且在侵袭前缘，可观察到MMP-7与胞核内-catenin共存。Wnt途径的靶基因COX-2可增强MMPs的表达，促进肿瘤的侵袭转移。,肿瘤的生长和扩散与血管生成密切相关，启动血管生成是肿瘤增殖的先决条件。目前已发现有十数种促进肿瘤血管生成的生长因子，如VEGF,EGF,TGF,FGF,Angiopoietin等。而Wnt途径对血管的生成具有调节作用，其靶基因VEGF参与血管的生成。COX-2也可增强一些生长因子如PDGF等的表达，APC的突变可提高COX-2的活性。Holnthoner等研究表明Wnt途径可部分介导成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）促进肿瘤的血管生成能力。,虽然没有确切的资料证明Wnt的非典型途径Wnt/Ca2+和平面的细胞极性途径参与肿瘤的发生发展，但它们的激活可间接影响典型Wnt途径中的成分，如Wnt/Ca2+途径可激活PKC,PKC的活化可使GSK3失活，进而抑制-catenin的磷酸化，使胞浆内-catenin含量升高，有研究发现PKC活化也可激活JNK。因为PKC是多基因家族，每个成员具有不同的组织表达特异性，因此与典型Wnt途径间的相互关系和影响错综复杂，许多的机制还有待研究。平面的细胞极性途径也可涉及Jun的活化。,应用多种分子生物学方法，通过研究Wnt途径主要组分的基因表达情况，观察有无突变、缺失等改变，例如基因芯片，DNA测序分析，SSCP分析等。通过RT-PCR技术，检测Wnt途径相关基因的mRNA水平，特别是实时PCR技术的出现和发展，使研究的精确性大大提高。传统的Northern杂交因其高敏感性也常用于Wnt途径的研究。,在Wnt途径中最终发挥生物效应的是蛋白分子，因而检测其蛋白表达水平和分布具有重要意义。免疫组化染色即可定量分析，又可定位观察各因子的表达情况，是最常用的方法之一。已经克隆的抗体主要有：-catenin抗体，APC抗体，TCF4和TCF3/4抗体，Wnt1、Wnt2和Wnt10抗体等，结合western印迹杂交，可以为更加深入研究Wnt途径的作用机制提供条件。,胞外分泌蛋白和受体,Wnt基因编码长度为350400氨基酸的分泌型糖蛋白，含有2224个半胱氨酸残基。在哺乳动物有16个Wnt家族成员，通过与细胞表面、细胞外基质 的联系而体现信使的作用。Wnt的受体分为两种： 一是FZD(Frizzled)受体家族成员，是具有7个跨膜片段的受体，其N端富含半胱氨酸，是Wnt蛋白的高亲和力结合位点，目前已发现11种； 另一种是低密度脂蛋白受体相关蛋白LRP5和LRP6，为Wnt配体的共受体成员。,经典WNT信号转导通路,经典信号转导通路是Wnt蛋白通过Frizzled(FZD)家族特异受体和LRP5LRP6辅助受体结合，触发细胞内的信号转导，使-连环蛋白(-catenin)聚集的级联反应过程。在经典Wnt信号转导缺乏时，-catenin与Axin-APC-GSK-31等形成降解复合物，结合后的-catenin发生磷酸化，进而与泛素化蛋白结合被泛素化降解。在经典Wnt信号存在时,-catenin将不再被CKI和GSK3 磷酸化，而是在胞浆中聚积并进入细胞核 。核内的-catenin与T细胞因子淋巴增强因子(TCFLEF)等转录因子和Legless蛋白(BCL9和BCL9L)及PYGO剖结合形成复合物。TCFLEF-catenin-Legless-PYGO复合物启动靶基因FGF20，DKK1，WISP1，MYC，and CCND1 等的转录。,非经典wnt信号转导通路,非经典wnt信号是通过fzd家族受体和辅受体ROR2和RYK转导的。在该通路中，小G蛋白(RHOA，RHOU，RAC，和CDC42)和c-jun N端激酶是DVL依赖的效应分子，而Nemo样激酶(NLK)和活化T细胞核因子(NFAT)则是钙依赖效应分子 。NLK磷酸化TCFLEF转录因子去抑制经典的wnt信号通路。NFAT转录因子早期胚胎发生和致癌作用转移过程中起作用。非经典Wnt信号被转导到DVL-或者Ca2+依赖的级联反应，并与细胞极性信号通路重叠 。,Wnt基因家族成员的wnt-1，wnt-3和wnt-10b都是由MMTV诱发小鼠乳腺癌的过程中活化的痛基因小鼠wnt-1，wnt-2，Wnt-3a，wnt-5a，wnt-7基因在体外均具有转化细胞的能力目前研究表明，wnt基因及其受体异常与人类肿瘤的发生可能相关例如，wnt-2和wnt-5a可能与大肠癌发生、发展有关DKK-1失活在大肠癌进展中也可能起重要作用,Wnt信号转导通路中与肿瘤发生相关的靶基因,一旦经典Wnt信号转导通路被激活，将会使靶基因过度表达，从而影响细胞的增殖、分化，促进肿瘤的发生。第一个被确定Wnt信号转导通路的靶基因是原癌基因c-myc。人们在结直肠癌细胞中发现，因APC突变而形成的p连环蛋白-Tcf4复合体，通过与c-myc基因启动子上Tcf4的结合位点作用，使之活化表达，从而解释了为什么c-myc在结直肠癌许多阶段都处于过表达状态。,cyclinD1是调节细胞进入增殖期的主要因子，目前已被证实为原癌基因。1999年，Osamu等 发现，p连环蛋白Tcf4复合体可与cyclinD1启动子作用，引起其高表达；他们还发现活化的Ras也能通过上述的cyclinD1启动子上不同于TcfLef结合位点的区域来加强cyclinD1转录。此后，在实验性毒物诱发的大鼠结直肠癌中发现cyclinD1过度表达，并与B连环蛋白基因突变有关；反义cyclinD1 cDNA的表达，可使结直肠癌细胞生长明显抑制，并能阻止裸鼠中SW480结直肠癌细胞生长，结果表明cyclinD1在肿瘤发生中起着关键作用 。,抗凋亡基因survivin在正常结肠上皮隐窝的基部表达，并激活Wnt信号。此外，在结直肠肿瘤中survivin表达增加，表明survivin是Wnt信号转导通路的靶基因 。与肠道肿瘤发生密切相关的基因即环氧酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)，可能也是p连环蛋白Tcf复合物的转录靶基因。Dolmetsch等 发现，Wnt-1在小鼠乳腺上皮细胞中的表达，能上调COX-2基因的转录，其mRNA和蛋白水平均升高，前列腺素 E2(PGE2 )生成增多。,研究表明-catenin是一个多功能蛋白，它存在于内皮细胞的细胞连接处。当有血管内皮生长因子存在的情况下,-catenin会发生酪氨酸磷酸化，之后细胞连接松散，细胞活动能力增强。因此，在抑制肿瘤新血管生成方面，血管内皮生长因子则被认为是最主要的抗肿瘤治疗靶点。内皮抑素(endostatin)是X型胶原的羧基末端片段，是一种特异的血管生成抑制因子。,它能直接作用于内皮细胞，通过抑制血管内皮生长因子阻断细胞连接处-catenin的作用，来抑制内皮细胞的迁移；另一方面，通过使细胞质中-catenin降解，来干扰它对基因表达的调节作用，从而达到抑制肿瘤血管的生成。,Wnt信号转导通路的组成,Wnt基因属于原癌基因，其编码的Wnt蛋白是分泌性蛋白。在脊椎动物中已发现至少20种，其中人类有l6种。长度大约为350 380个氨基酸。起始为疏水信号序列，其后包含着几个糖基化位点，并且富含半胱氨酸。wnt受体蛋白佛力子(FZ)位于细胞膜上，由FZD基因家族编码，是一族反复7次穿越细胞膜的跨膜蛋白。,-连环蛋白（-catenin )是Wnt信号通路中有调控转录活性的关键成员，能在细胞核内与Wnt通路另一成员TCF结合从而激活靶基因的转录。糖原合成激酶3 (GSK3)是一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，起到破坏APC复合体的关键作用。在无Wnt信号时有活性，将磷酸根加到-catenin的四个N端位点使这些磷酸氨基酸作为-catenin上的一种标志。在wnt信号存在时，磷酸化-catenin促使-catenin降解。APC是一种与结直肠癌发生有关的抑癌基因，能结合wnt途径中的多种成分，如AxinGSK3、-catenin。APC能刺激-catenin被GSK3磷酸化。,在调节-catenin的稳定性中起负性作用，促进-catenin的降解。轴蛋白(Axin)起支架蛋白的作用，可使GSK3靠拢-catenin而促进-catenin被GSK3磷酸化，并促进-catenin的降解。Dsh使Wnt信号的正调节物，是Wnt途径最上游的细胞内成分。有Wnt信号时被激活起支架蛋白作用。有三个高度保守的结构域在其功能中起重要作用。,Dix域通过与Axin的相互作用在拮抗破坏APC复合体中起直接作用。DEP域通过在细胞中的定位与微管细胞骨架的关系而调控Wnt途径的活性中起重要作用 。,酪氨酸激酶(cKk)是一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，对Wnt途径起正调节作用。CKIs的表达使-catenin稳定。T细胞因子淋巴样增强因子1(TCFLEF1)是序列特异的DNA结合蛋白，能将-catenin定位于靶基因的启动子的部位。MYC基因位于wnt途径的末端，属于即刻早期反应基因，是调控细胞周期的主要基因。在正常情况下MYC不仅与细胞增殖有关，与最终阻止细胞增殖的细胞程序化死亡也有很大关系。,Wnt途径的实现,Wnt通路是通过调节TCFLEF1家族的DNA结合蛋白转录性质来调节细胞的行为的。其核心是胞质内-catenin的稳定性。 -catenin水平低下时，wnt通路关闭。当其水平较高时，wnt通路开放。 -catenin在细胞内水平受两组蛋白质的功能竞争调节。一组为降解蛋白类：APC蛋白复合体，由GSK3、Axin及APC蛋白组成。,另一组为拮抗蛋白类，包括：Dsh、CKIs、GSK3结合蛋白(GBP)。在正常未受刺激的细胞中无wnt信号，胞质内-catenin大部分与细胞膜上钙黏着蛋白结合使之附着于细胞骨架蛋白肌动蛋白上，介导同型胞间黏附。对于少部分的-catenin ，APC复合体中Axin使GSK3向-catenin靠拢并与APC一同促使-catenin氨基末端serthr位点被磷酸化进而泛素化。最终被蛋白水解酶所降解。,同时TCFLEF与多种转录抑制蛋白，如GRO家族成员c末端结合蛋白(ctBP)等结合而阻止Wnt靶基因的表达。当Wnt通路活化时，Wnt与受体FZ结合激活细胞内的CKIs。CKIs使Dsh磷酸化，释放GBP，结合与Axin联系的GSK3，从而抑制GSK3对-catenin的磷酸化降解的作用使未磷酸化-catenin在胞质中积累并转运到核中，破坏LEFTCF家族与GRO、GBP抑制蛋白形成的复合蛋白。从而激活转录因子，进一步激活MYC基因开始进行转录，刺激细胞增殖。,Wnt通路的信号活性,各种组织器官的发育过程中，都存在Wnt信号的传递在造血系统中Wnt信号对于造血干细胞的自我更新起着重要了的调节作用。将编码-catenin ,IRES-GFP的逆转录病毒以及不含-catenin的空病毒载体分别感染造血干细胞。发现转有空载体的造血干细胞34处于细胞周期的S、G2M期，而表达-catenin的造血干细胞有58处于同一期。,1.Wnt通路对造血干细胞及造血微环境的调节,转染-catenin的造血干细胞在体外无血清培养条件下，添加一定量的SLE，经过89代的培养，细胞可扩增为原来的100倍，而对照组却无明显增加。完全去除SLE后，转染空载体的细胞75 80出现定向分化标志。而转染-catenin的细胞中仅5 10出现分化标志。,这表明有活性的-catenin可维持造血细胞处于非成熟状态，同时促进造血干细胞的扩增。转染-catenin的造血干细胞在体外培养1周后，植入非致死剂量照射的小鼠体内，8周后发现，植入125个造血干细胞，就可以完全达到重建造血，而且每只小鼠均达到粒系、T系及B系的重建造血。而植入125个转染空载体的造血干细胞却不能重建小鼠的造血功能。,另外， -catenin的抑制子Axin的表达可抑制造血干细胞的增殖，降低非致死量射线照射小鼠造血系统的重建能力。此外，在造血干细胞及其微环境中发现了Wnt受体的表达。人类造血干细胞表达，基质细胞也表达FZ-6家族的一些成员。在体外Wnt5a可促进造血干细胞扩增，撤除Wnt5a则造血祖细胞扩增明显减少，原始细胞形成减少。转染 wnt1、Wnt5或Wntl的293细胞条件培养基联合一些细胞因子，如KL、IL-3等可刺激造血干细胞扩增7倍、8倍或11倍 。,这些证据表明，造血干细胞及其造血微环境可以接受wnt信号并对其作出反应。而且 wnt信号对造血干细胞微环境中各细胞成分的维持有调节作用，以维持造血微环境的稳定。,2.Wnt通路对神经前体细胞的调节,在CNS， -catenin信号能控制神经前体细胞的生长以及细胞增殖与分化的平衡。研究者利用两个条件性的-catenin突变型等位基因来改变CNS组织中的-catenin信号：一个剔除-catenin ，另一个过表达有活性的-catenin ；在剔除-catenin以后，小鼠大脑和脊髓的神经组织成分减少，神经前体细胞群也不能维持，而过表达-catenin小鼠的大脑和脊髓组织成分则大量增加，神经前体细胞群体增大。,说明-catenin信号对神经前体细胞池的维持，神经前体细胞的增殖与分化至关重要。神经嵴是脊椎动物神经系统发育过程中一个由多潜能细胞群体构成的迁移性结构。Wnt蛋白参与神经嵴发生，Saint-Jeannet等发现正常情况下表达于神经管背侧域的Wnt-1和Wnt-3a，在爪蟾外植体中通过与noggin和chordin的协同，能诱导神经嵴的形成，表现为神经嵴标志物Krox-20，AP-2及slug的表达；,Wnt-1和wnt-3a的过表达将导致神经嵴细胞增多；而GSK-3的过表达由于抑制了Wnt -catenin途径，能导致上述神经嵴标志物分子表达的明显下调。Ikeya等通过抑制Wnt-1和 wnt3a的表达，也发现会导致小鼠神经嵴衍生物明显不足，同时背外侧神经管中的神经前体细胞显著减少。,3.Wnt通路对其他细胞增殖分化的调节,Wnt信号除了对造血干细胞增殖分化有调控作用时，对其他干细胞也有作用。在对胚胎干细胞的研究中发现，如果APC基因突变则可抑制胚胎干细胞向三胚层组织分化而维持其增殖状态，这一效应主要是通过胞内-catenin浓度的升高来实现的 。间充质干细胞是来源于骨髓的多潜能干细胞，在体外可分化为骨、软骨、脂肪细胞。小剂量的Wnt可以扩增未分化的间充质干细胞，而大剂量的Wnt则抑制间充质干细胞向脂肪细胞分化，增加碱性磷酸酶的表达。表明其有促进成骨形成起始的作用。,Hussain等通过实验证明，Wnt/-catenin信号通路对胚肝细胞的增殖分化起作用。将取自小鼠胚胎的肝组织在含有Wnt3无血清的条件培养基中培养。对照组中培养的肝细胞出现结构及增殖能力的丢失，细胞凋亡增加。而在含Wnt3的胚胎肝细胞条件下则表现出细胞数量的增加合类管组织的重排 。此外，wnt信号对表皮干细胞、毛囊干细胞等均有不同程度的影响。,4.wnt信号通路与肿瘤的发生,癌基因或抑癌基因的突变均可导致正常调控细胞增生的调节途径不恰当的活化，使细胞增生失控而致肿瘤生成。在Wnt通路中任何一步发生障碍都可致癌。其异常情况大致可分为3类： 一是组成wnt信号途径的蛋白、转录因子或基因被破坏或变异导致该途径关闭或局部途径异常活跃。 二是过多的Wnt信号使整个途径都异常活化，细胞进行不必要的增殖。 三是没有wnt信号时，细胞内其它的活动也会通过Wnt途径来刺激或诱发细胞乃至机体不正常反应。已发现wnt信号途径的成分在多种人类癌症中发生突变。,如APC、 -catenin等，这些突变使细胞无能力-catenin至恰当水平。突变-catenin会产生功能增加的-catenin蛋白也可逃避破坏复合体的调节。这些突变的最终结果是Wnt靶基因的组成性激及细胞增生的失控 。当-catenin氨基末端的磷酸化位点被除去后,-catenin对GSK3的负调控就不敏感了。人类多种肿瘤的产生与这些磷酸化位点的突变有关。其可能的原因丝磷酸化位点的突变导致-catenin不能被有效降解。在胞质内过量积聚后进入胞核。无限制地激活下有基因，产生肿瘤。而过度的Wnt信号将破坏抑癌基因，激活重要的原癌基因，并通过wnt途径导致癌症。,Wnt信号途径,Wnt信号转导途径是目前已知的胚胎发育所必须的信号转导途径，同时在肿瘤的发生、发展中该途径也占据着重要的位现已经证实，该通路的过度激活与多种人类肿瘤的发生有密切的联系，尤其在大肠癌的发生、发展上，目前研究表明，约90的大肠癌发生与该通路过度激活有关。,大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病呈上升趋势，严重威胁人民生命健康，目前主要采取以手术和放化疗为主的综合治疗，传统的化疗药物对患者的预后也只能起到有限的作用，因此新的分子靶向治疗迫在眉睫。Wnt/-catenin信号途径在胚胎发育过程以及多种肿瘤的发生、发展中起重要作用由于其在人类不同肿瘤中的广泛激活，调节细胞的生长、迁移和分化，已被公认为肿瘤发生过程中关键的信号通路之一，尤其在大肠癌的发生、发展上，目前研究表明，约90的大肠癌发生与该通路过度激活有关近年研究发现，一些非甾体抗炎药、植物类化合物、酪氨酸激酶抑制剂和血管生成抑制剂等能抑制。Wnt/-catenin信号途径过度激活，以及针对该途径重要信号分子的小分子抑制剂和基因治疗等分子靶向治疗均显示了很好的抗癌前景。,Wnt/-catenin通路是高等动物胚胎组织发育分化所必需的关键信号通路，主要参与细胞的增殖、分化、极化、凋亡与抗凋亡等 。研究表明， Wnt/-catenin通路在卵巢发育过程中起到了关键性的作用 ，同时，对正常卵泡的发育以及卵巢的功能产生影响 。Wnt信号途径的异常激活也与肿瘤的发生密切相关，有十几种目前已知的高发性癌变源于Wnt信号转导途径的失调。,-catenin,-catenin在wnt通路中处于一个中心位置。-catenin基因位于人染色体3p21其蛋白质一级结构包括3个重要的功能性区域，含150个氨基酸的N端，550个氨基酸的中间重复区域，和含100个氨基酸的e末端。-catenin的突变主要位于外显子3的33、37、4l、45位密码子。区域末端正是是GSK-3B的结合位点而这些密码子编码的-catenin蛋白NH2其突变或缺失会导致-catenin不能与GSK3结合，而不被降解中间重复区域是-catenin与多种配体如TcffLEF、Axin、E-钙粘蛋白等结合的重要部位，C末端则和中间重复区域共同参与Tcf/LEF的活化，-catenin基因结构见图。,-catenin是一种多功能蛋白，通过形成catenin(,)-E-cadherin复合物，参节细胞-细胞黏附以及细胞-ECM间的相互作用。胞浆内游离的-catenin可被遍在蛋白化，进入蛋白酶系统而降解。胃癌时，常由于E-cadherin的下调而使cadherin-catenin复合体减少，使癌细胞更易于呈现侵袭性。,经典Wnt信号转导途径致癌的关键是该途径任何一个信号分子异常致-catenin在胞质中累积，继而进入核内激活Tcf-4转录因子，启动靶基因转录，因此经典wnt信号转导途径又称为wnt -catenin信号转导途径我们对wnt -catenin信号转导途径与大肠癌发生、发展的关系，以及针对该信号途径的治疗策略做一概述,经典WntBcafenin信号途径,经典Wnt -catenin信号包括胞膜、胞质、胞核信号3部分，可概括为：wnt蛋白与胞膜上的卷曲蛋白(frizzled，Frz)受体及低密度脂蛋白受体相关蛋白(10w dens时lipoprotein receptor relatedprotein)LRP5，LRP6辅助受体结合；同时wnt和Frz受体的结合被wIF1，cerberus和FrzB竞争性抑制，而Dickkof家族(DKK1，DKK2)通过间接减少可利用的辅助受体LRP的数量来间接抑制Wnt与膜受体的结合【3圳胞膜上的Wnt信号活化后使胞质内散乱蛋白(dishevelled，Dsh)激活，Dsh被磷酸化，抑制-catenin降解复合体降解Bcatenin； -catenin降解复合体包括大肠腺瘤息肉蛋白(adenomatous polyposis coli，APc)，轴蛋白(axin)，糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase3B，GSK_3B)和酪蛋白激酶18(caseinkinase，cKlCc)等， -catenin降解复合体异常(如APC或axin突变等)和-catenin基因本身突变均可致-catenin降解障碍，在胞质内积累继而进入细胞核；激活转录因子Tc“LEF，启动靶基因转录(如cmyc，cyclinD l，MMP-7，FGF-1 8，EGFR等。,Wnt/-catenin信号途径在大肠癌发生、发展 中的作用,wnt基因及其受体异常 wnt基因家族至少包含19个富含半胱氨酸的糖化蛋白wnt蛋白在胞膜上和Frz的7次跨膜受体相结合，同时结合LRP-5和LRP-6。这是Wnt信号通路活化的重要起始信号wnt途径抑制剂wIF-1，Cerberus，FrzB等竞争性抑制wnt与Frz结合，而Dickko镓族通通过过问问接接减减少少叨可利利用用的的辅辅助助受体LRP的数量来间接抑制wnt与膜受体的结合,-catenin基因异常,-catenin基因(CTNNBl)定位于人染色体3P21P22，该区域是人类基因组经常发生恶性改变的区域，基因全长232 kb，共有16个外显子，其mRNA长度为3362个核苷酸残基 -catenin基因外显子3的第33，37，41，45位密码子编码区域构成的-catenin蛋白的NH2末端，他是与复合体结合后发生磷酸化的位点，其缺失或突变会导致-catenin不与复合体结合而免于降解，导致-catenin在胞质的积聚，游离的-catenin进入核内与Tcf_4结合，促进相应的靶基因转录，则可促使肿瘤的发生在大肠腺瘤和大肠癌中有相当比例的肿瘤有-catenin基因突变，且以外显子3最为常见在APC基因完整的大肠癌中-catenin基因外显子3的突变率高达50在实验性毒物诱导的动物大肠癌中也可频繁检测到-catenin基因突变,-catenin降解复合体异常,-catenin降解复合体的功能在于使-catenin磷酸化，而后被泛素蛋白酶体系统降解APc基因最初是从家族性多发性息肉腺瘤综合征(FAP)患者中发现并克隆的，现在公认为是一个典型的抑癌基因APC基因与结肠癌发生的关系极为密切，其突变后可导致结肠上皮细胞过度增生，形成息肉，最终导致肿瘤的形成大约80散发性结肠癌中可检测到APc基因缺失突变或失活，而APC基因的缺失或失活被公认为是结肠癌发生的早期axin基因也和APC基因一样起抑癌基因作用研究发现，一些没有APC和-catenin基因突变的大肠癌中出现了axin的突变，导致-catenin的核累积，并与错配修复缺陷密切相关 -catenin降解复合体任何一个信号分子突变、缺失或功能异常等均可致-catenin降解受阻从而在胞质内累积，随即游离的-catenin进入核内，激活靶基因的表达,Tcf-4及其靶基因异常,Tcf家族包含4个不同的蛋白Tcf-l，Tcf-2，Tcf-3，Tcf-4Lef在大肠正常上皮及肿瘤细胞中表达的主要是Tcf-4人Tcf_4(hTcf-4)是人结肠上皮主要的家族成分，其基因编码定位于染色体10q25，包括17个外显子和许多选择性结合位点Duval在24株大肠癌细胞中发现有12株细胞Tcf-4发生突变，其中有半数发生在基因的3末端，这些突变基因产物可能减少C-末端结合蛋白的结合从而增强基因的转录活性，说明Tcf_4基因在结肠癌的发生中起重要作用。 且各种原因过渡激活Wnt信号途径后均可致-catenin在胞质内累积，游离的-catenin进入核内与Tcf_4结合形成复合物，启动下游靶基因的异常转录从而促进肿瘤发生及细胞周期进程,这些靶基因多与细胞凋亡、细胞生长、血管生成及肿瘤侵袭转移有关，如cmyc，cyclinDl，MMP-7等我们通过对-catenin与cmyc，cyclinDl蛋白在大肠癌的表达情况进行相关分析，结果显示， -catenin与cmyc，cyclinDl表达均呈明显正相关，提示-catenin异位表达可能是原癌基因cmyc和cylinDl激活的原因之一，并在大肠癌发生、发展中起重要作用,Wnt/-catenin信号途径,Wnt/-catenin信号途径目前是公认的与大肠癌等多种肿瘤发生、发展密切相关的信号途径，因此近年国内外学者从多方面研究了针对该信号途径的干预策略，包括多种非细胞毒性药物(如非甾体类抗炎药物，植物类化合物等)对该途径的调控作用，以及针对该途径重要信号分子的小分子抑制剂、分子靶向治疗和基因治疗等,Wnt/-catenin信号转导通路(图1)在生物进化中极为保守，从低等生物果蝇至高等哺乳动物，其成员都具有高度的同源性，它调节转录辅助因子-catenin的稳定性并依赖-catenin基因的表达。Wnt/-catenin信号转导通路异常与人类疾病有关，包括肿瘤、骨质疏松、衰老和退化障碍等。 因此，对wnt/-catenin信号转导通路的研究不仅有助于理解人类疾病的发生机制，而且可以为疾病的治疗提供一系列新的靶点。目前研究证实，至少有6种Wnt蛋白(Wntl、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt8和Wnt8b)可以激活wnt/-catenin信号转导通路。 Wnt/-catenin信号转导通路的活化由细胞质中-catenin蛋白水平决定。,正常情况下，细胞质中-catenin由泛素蛋白酶体介导呈降解状态而维持低水平表达，泛素蛋白酶体是由轴蛋白(axin)、大肠腺瘤息肉(adenomatous polyposis coli，APC)蛋白、糖原合成激酶3(glycogen synthesis kinase-3 ，GSK-3 )和酪蛋白激酶l (casein kinaselct，CK1)等组成的多蛋白复合物，包括泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)。 GSK-3 通过磷酸化Ser33、Ser37 和Thr41 标记蛋白，CK1 通过磷酸化Ser45 标记蛋白，使其被E3亚基6 -转导素重复蛋白(-transducin repeatcontaining protein， -TrCP)识别，介导-catenin分子的降解，26S的蛋白酶体也随之被降解 。,Wnt蛋白通过与细胞表面受体复合物跨膜蛋白共同受体低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)结合启动细胞内-catenin的聚集。但是，目前对于Wnt蛋白结合FzLRP受体后引起细胞信号转导的机制还不十分清楚。多数学者认为，2者结合后，受体复合物下游蛋白即细胞质散乱蛋白(disheveled，Dv1)被磷酸化，抑制GSK-3和CK1的活性，并通过固定axin蛋白，破坏多蛋白复合物的形成，最终导致非磷酸化-catenin在细胞质中聚集，并逃脱-TrCP的识别，避免了被降解的过程，进而转位到细胞核。在细胞核内， -catenin与TCF形成复合物。当没有-catenin存在时，TCF与Groucho相互作用形成复合物抑制转录活性；当-catenin存在时，则干扰TCF与Groucho的相互作用，与TCF和其他转录辅助因子如CREB结合蛋白(CREB binding protein，CBP) 共同启动下游靶基因的转录。,非甾体类抗炎药物NSAIDs,NSAIDs在大量的流行病学和临床研究资料表明，现有的许多非细胞毒性药物显示良好的抗癌前景，研究最多的是非甾体类抗炎药物，其中包括选择性COx-2抑制剂许多肿瘤均高表达C0x-2大量研究表明，NsAIDs抗癌作用机制主要与其抑制肿瘤细胞COx-2表达有关，但同时也有较多研究表明，NsAIDs对不表达COx-2的肿瘤细胞也有较强的抑制作用，因此认为NSAID s可能通过C0x-2依赖和非依赖机制同时发挥抗癌作用目前研究表明， Wnt/-catenin信号途径是多种NSAIDs作用的分子靶点Dihlmann研究表明，消炎痛(indomethacin)和阿司匹林(aspirin)均可抑制大肠癌细胞-catenin Tc蹒录活性和靶基因cyclinDl表达，对-catenin Tc复合物形成无影响,Dihlmann研究也表明，阿司匹林可增加大肠癌细胞-catenin蛋白磷酸化，从而促进-catenin降解在人体试验研究也发现，舒林酸(sulindac)的抗癌活性与其抑制FAP患者腺瘤组织-catenin核表达有关多种NSAIDs在预防致癌剂诱发的动物大肠肿瘤发生上也起了重要作用，其机制多与其抑制-cateni