课件：基因工程制药复习.pptVIP

简 答 题,（1）如何克隆微生物的纤溶酶基因？ （2）获得目的基因的途径有哪些？ （3）限制性内切酶的特点（掌握如何从给出的序列中寻找酶切位点）。 （4）PCR的类型及其应用（举例介绍）。 （5）电泳上样缓冲液的作用有哪些？,（6）如何估算引物的Tm值？ （7）基因文库的特点是什么？ （8）药物蛋白分离纯化的技术要求有哪些？ （9）包涵体及其形成的原因是什么？,名词解释,杂交； 探针； 粘粒； 同尾酶（同裂酶）; cDNA文库； 基因工程药物； 盐析； 星活性;,什么是基因工程？,基因工程（genetic engineering）：又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。,教 学 内 容,I 基因工程制药概论(2学时） II 基因工程制药原理及技术（25学时） 1) 基因工程概论（2学时） 2) 基因工程的基本技术（6学时） 3) 基因工程的工具酶和载体（6学时）,4) 目的基因的获取方法（4学时） 5) 目的基因的表达系统（3学时） 6) 基因工程菌株的发酵（2学时） 7) 药物蛋白的分离纯化与质量控制（2学时） III 基因工程药物实例介绍（3学时） IV 练习与复习（2学时）,基因工程药物（Genetic engineering drugs）指利用基因工程技术研制和生产的药物，主要包括重组蛋白(多肽)药物、反义核酸药物、DNA药物和基因工程抗体等。,一、基因工程药物及其重要性,1、定义,2、种 类： 激素类及神经递质类药物 细胞因子类药物 酶类药物与凝血因子 基因工程疫苗,c) 酶类药物与凝血因子,酶类药物 有些酶类对人体疾病有特异性治疗价值, 其中最被重视的是能预防和治疗急性心肌梗死等血栓性疾病的链激（SK）, 尿激酶(UK),及组织纤溶酶原激活剂(t-PA)。,凝血因子 甲型血友病是缺乏因子所致, 乙型血友病是缺乏因子所致, 在血友病发病率中甲型占80%。 以往治疗血友病用凝血因子是从血液中提取的, 血友病人有遭受病毒等病毒感染的危险、用重组技术来生产凝血因子将克服血源性产品的缺点。,d) 基因工程疫苗,基因缺失活疫苗（减法疫苗） 目前这类疫苗中研究最多的是病毒疫苗，如流感病毒。伪狂犬病毒、单纯孢疹病毒（HSV）等。 基因工程活载体疫苗（加法疫苗） 通过表达外源保护性抗原基因，提供免疫保护。,确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质； 获得该蛋白质对应的基因； 将该基因放入可以大量生产的受体细胞中（细菌、酵母菌、动物或动物细胞、植物或植物细胞）； 利用受体细胞大规模生产这些蛋白质，即基因疫苗或药物。,3、基因工程药物制备的基本过程,目的基因的克隆； 构建DNA重组体； 构建工程菌（或细胞）； 目的基因表达； 外源基因表达产物的分离分析； 除菌、过滤； 半成品/成品检定； 包装。,基本步骤, 传统制药存在的问题： A、材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用； B、从动物脏器中提取出来，也因造价太高，或因来 源困难而供不应求； C、由于免疫抗原等缘故，使它们在使用上受到限制。 基因工程技术的特点： 能够十分方便有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。,4、基因工程制药的重要性,治疗侏儒症的唯一方法，是向人体注射生长激素。而生长激素的获得很困难。以前，要获得生长激素，需解剖尸体，从大脑的底部摘取垂体，并从中提取生长激素。 现可利用基因工程方法，将人的生长激素基因导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。人们从 450 L大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万具尸体的全部产量。,基因工程药品生长激素,二、基因工程药物发展历程,DNA重组技术诞生1972 世界第一个基因工程药物的诞生：美国Lilly公司的重组胰岛素投放市场1982 1996年，美国已拥有1300多家专门从事生物技术产品研究开发和生产的公司，70%从事生物医药开发；,1、国外历程,Genentech 公司,1976年，27岁的风险投资人Robert Swanson与University of California的教授Herb Boyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为Genentech（Genetic Engineering Technology）。,第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！,Genentech的骄人业绩,2. 我国基因工程药物的发展历程,20世纪70年代初开始将DNA重组技术应用到医学上。 第一个批准的我国生产的基因工程药物重组人干扰素1b(Rhu IFN 1b),1989年开始申报，1993年批准试生产，也是唯一的独创的一类新药。,基因工程药物研发事例 以胰岛素为例,糖尿病： 糖尿病是个历史悠久的慢性代谢性疾病，有文字记载的历史已有上千年。但对糖尿病病因的了解和治疗上有实质上的进展还不到一百年。,胰岛素的研发史,自18世纪至今，在诸多研究者不断进取的努力下，胰岛素的研究经历了五个阶段： 发现胰岛素 得到胰岛素 了解胰岛素 合成胰岛素 改造胰岛素,1788年 Thomas Canley (英) 证实胰腺损伤可导致糖尿病 1869年 Langerhans (德) 发现胰腺内具有分泌功能的细胞团 1889-1893年 Von mering 和 Minkowski (德) 证实胰腺细胞团产生降血糖物质 1893年 Edouard Laguesse (法) 将胰腺细胞团命名为胰岛 1909年 Jean de Meyer (比利时) 将胰岛分泌的降糖物质命名为胰岛素,1. 发现胰岛素,2.得到胰岛素,1921年 从狗的胰脏提取了胰岛素并用于临床,James B Collip (化学家),Frederick G. Banting (医生) 获1923年 诺贝尔医学奖,Charies H Best (学生助理),J.J.R Macleod (生理学家) 获1923年 诺贝尔生理学奖,为纪念四位科学家为糖尿病治疗做出的杰出贡献 将班丁（Banting）医生的生日（11月14日）定为世界糖尿病日,3. 了解胰岛素,1955年 Frederick Sanger (英国) 阐明牛胰岛素的氨基酸排列顺序 获得1958年诺贝尔化学奖,1965年 王应睐，邹承鲁，龚岳亭等 (中) Katsoyannis PG (美) Meienhorer (德) 人工合成牛胰岛素 1967年 Donald F. Steiner (美) 发现胰岛素原 1969年 Dorothy Hodgkin (英) 确定胰岛素氨基酸排列的三维空间结构 1971年 Pierre Freychet (美) 确认胰岛素受体,1958年，由中科院上海生物化学所、有机化学所和北京大学联合进行人工合成胰岛素研究，1965年获得人工合成牛胰岛素。,牛胰岛素晶体结构模型,我国科学家与诺贝尔奖擦肩而过,Rosalyn Yalow (and Solomon Berson)（美国） 1959年开始用放射免疫方法测定血液中胰岛素含量 1977年，获诺贝尔生理学或医学奖,4.合成胰岛素,1979年 Ullrich 和 Itakura 阐明了胰岛素质粒的分子序列 1979 -1981年 Goeddel 和 Chance 开始用DNA技术生物合成人胰岛素 1981年 今 基因合成重组人胰岛素系列制剂,20世纪末，人胰岛素类似物研制成功！,5. 改造胰岛素,胰岛素的蛋白质空间结构对维持其生物活性有很重要的意义，人工合成的胰岛素制剂受此影响在皮下注射后需有一定的解离时间才能发挥效力，故治疗时需提前20-30分钟注射胰岛素。 糖尿病人需要更接近生理状态、使用方便的胰岛素制剂。 利用基因重组技术，修饰胰岛素的氨基酸组合：,三、基因工程制药的现状与发展前景,1.国内外研究现状,国外现状 上市药类种类多，幅面广； 研发机制成熟； 投资规模大，抗风险能力强； 利润大，投资回报率高。,国内现状 药品生产多以仿制为主 , 自主开发产品少 1989 年 ,我国科学家成功研制出具有我国自主知识产权的基因工程一类新药 1b 干扰素 ,成为我国批准生产的第一个基因工程药物 ,也是到目前为止惟一一个由我国自主研制成功的拥有自主知识产权的基因工程一类新药。,同种产品生产厂家过多 新药研发创新的体制尚未形成 医药市场混乱,我国研发和生产基因工程药物都有较大的发展潜力，基因工程药物的市场需求量巨大，以重组人干扰素为例，其治疗的主要适应症患者，目前我国乙肝病毒携带者超过1.2亿人，乙肝患者有3000万人，丙肝患者有1000万人，结核患者超过450万人，另外，居民高血压、糖尿病、恶性肿瘤和心脑血管疾病的发病率不断增加，对新生物医药的需求非常迫切;,2、我国基因工程药物市场前景广阔，主要体现：,一、从市场容量和产业利润来看,2009年末，我国重组人干扰素的生产企业仅有20多家，国产重组人生长激素生产企业也仅有5家； “十二五”863计划首批生物医药和基因工程项目的正式启动，标志着我国生物医药和基因工程行业将迎来新一轮的发展契机，我国基因工程药物市场存在较大的发展空间。,二、从市场格局来看,据估算，我国生物制药的总体产业规模仅为80亿元上下(具体为血液制品30亿元、诊断试剂5亿元、生物基因药物15亿元、生化制药30亿元)。,三、从产业规模来看,基因工程制药原理及技术,第一章 基因工程概论 第二章 基因工程的基本技术 第三章 基因工程的工具酶和载体 第四章 制药基因的获取方法 第五章 制药基因的表达系统 第六章 基因工程菌株的发酵 第七章 药物蛋白的分离纯化与质量控制,是指将重组对象的目的基因插入病毒, 质粒或其它载体系统中， 拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（或细胞）， 实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达。,一、基因工程的定义,第一章 基因工程概论,有关术语解释：,DNA嵌合体（DNA chimera）：内、外源DNA插入载体分子所形成的杂合分子（嵌合DNA)。 重组（ recombination）：构建DNA嵌合体分子的过程。,克隆(Clone) 从一个共同祖先无性繁殖下来的一群同一DNA分子, 细胞或个体所组成的特殊的生命群体。,克隆(Cloning) 指上述的过程。,基因工程的主要研究内容: 获得具有遗传信息的目的基因; 选择基因载体获得重组DNA; 将重组DNA分子导入宿主细胞; 鉴定带有目的基因的克隆; 目的基因的扩增及获得目的产物。,基因克隆的核心: DNA体外重组(Recombination) : 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。 2. DNA 的扩增(Amplification ) 。,基因克隆示意图,基因工程大事记,1973，Cohen第一例成功的克隆实验； 1978，Genetech公司，人胰岛素，世界上第一种基因工程蛋白药物； 1982，第一个基因工程药物-重组人胰岛素在英、美获准使用； 1985，第一批转基因家畜（兔、猪和羊），转基因鱼；,1993，基因工程西红柿在美国上市; 1997， 英国罗斯林研究所，多莉羊; 1999.9， 中国获准加入人类基因组计划，负责测定人类基因组全部序列的1%; 2000.6.26，科学家公布人类基因组工作草图; 2001.2.11，公布人类基因组基本信息。,基因工程 蛋白质工程 酶工程 细胞工程,生物工程包括：,自然界的基因转移和重组,基因重组(genetic recombination)整段DNA在细胞内或细胞间, 甚至不同物种间进行交换, 并能在新的位置上复制, 转录和翻译。,基 因 工 程,自然界的基因转移和重组,无目的,有目的,接合作用(conjugation) 质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌) 。,转导作用(transduction) 由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程, 其具体含义是指一个细胞的DNA或RNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。,转化作用(transformation) 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程。,二、基因的基本概念,基因： DNA分子中含有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列（通常是DNA序列）。,编码蛋白质肽链或RNA的核酸序列； 保证转录所必需的调控序列； 5非翻译序列； 内含子； 3非翻译序列等所有的核酸序列。,基因包含：,基因组：携带生物体全部遗传信息的核酸量。,基因的重叠与可变性,转录：在细胞核内，以DNA的一条链为模板，按照碱基互补配对的原则合成RNA的过程。,基因控制蛋白质的合成,细胞质,细胞核,核孔,DNA,mRNA在细胞核中合成,细胞质,细胞核,mRNA通过核孔进入细胞质,U,C,A,U,G,A,U,U,A,mRNA,密码子,密码子：mRNA上决定氨基酸的三个相邻的碱基,亮氨酸,反密码子,翻 译:,在细胞质中,以mRNA为模板,合成具有一定氨基酸顺序的蛋白质的过程。,tRNA上的反密码子与mRNA上的密码子互补配对,tRNA将氨基酸转运到mRNA上的相应位置,两个氨基酸分子缩合,缩合,亮氨酸,核糖体随着 mRNA滑动，另一个 tRNA 上的碱基与mRNA上的 密码子配对。,亮氨酸,一个个氨基酸分子缩合成链状结构,亮氨酸,天门冬酰氨,tRNA离开，再去转运新的氨基酸,亮氨酸,天门冬酰氨,异亮氨酸,以mRNA为模板形成了有一定氨基酸顺序的蛋白质,蛋白质合成过程示意图,基因工程过程示意图,从细胞中分离出DNA,限制酶截取DNA片断,分离大肠杆菌中的质粒, DNA重组,用重组质粒转化大肠杆菌,培养大肠杆菌克隆大量基因,胰岛素,转基因植物获得新的性状,基因工程的应用现状,转基因动物作为生物发生器,转基因动物和植物 转基因动物首先在小鼠获得成功。现在转基因动物技术已用于牛、羊，使得从 牛/羊 奶中可以生产蛋白质药物。称为“乳腺反应器”工程。 转基因植物亦已在大田中广为播种。,美国 GE 公司构造成功具有巨大烃类分解能力的工程菌，并获专利，用于清除石油污染。,基因工程菌在环境工程中应用,基因本身也是一个产业,Rockfeller 大学将人肥胖基因出售0.2亿美元（1995年3月） Amgen公司将FKBP神经免疫因子配体转让达3.29亿美元（1997年） Millennium公司以4.65亿美元向Bayer公司转让225种基因的开发权（1998年9月）,什么是PCR?,多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称技术，是利用热稳定 DNA 聚合酶在体外快速扩增 (复制) 某一特定 DNA 片段的方法。 PCR技术操作简便，可在短时间获得数百万个特异的目的序列的拷贝。 80年代中期PCR技术的发明，引起了生物技术发展的一次革命，目前已被广泛应用于与分子生物学相关的各个领域。,一、PCR技术简史,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,引物酶,引物酶,94变性,50-65退火,XX延伸,Taq DNA聚合酶,来自水生栖热菌 Thermusaquaticus 良好的耐热性 在7080具有最高聚合活性 在95 仍然可以有50%活性 其它特性: Mg2+依赖性 无校正功能,72,94,55,PCR循环,二、PCR的原理与操作,（一） 原 理,模板DNA,变性(denaturaion),引物1,引物2,退火(annealing),引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,延伸(extension),第1轮结束,第2轮开始,PCR 过程,1. 模板变性 (Denaturation) 双链 DNA 模板在 95C 变性为单链 DNA。 2. 引物退火 (Annealing) 引物与单链 DNA 互补并退火。 3. 延伸反应 (Extention) 耐热的 DNA 聚合酶催化子链的合成。,（二） PCR的基本操作,1、PCR反应五要素,引物（primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP, dGTP, dCTP, dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium）,1） 长度： 18 - 24 个核苷酸； 2） GC ：40 - 60；,2、引物设计的原则,Tm = 69.3 + 0.41 (G + C%),引物长度为 18 - 24 个碱基： Tm (C) 4 (GC) 2 (AT) 5 ATGGCGGGCAGGTCAGAAAG 3 GC 12；AT 8 Tm 4 X 12 2 X 8 64C,3） 四种碱基随机分布； 4）引物自身不应存在互补序列，以防形成发夹结构；,5 GTTGACTTGATA T 3 GAACTCT,5 GTTGACTTGATATTCTCAAG 3,引物的自身互补序列形成发夹结构,2、引物设计的原则,5 ACCGGTAGCCACGAATTCGT 3,3 TGCTTAAGCACCGATGGCCA 5,5 ACCGGTAGCCACGAATTCGT 3,两个引物分子形成二聚体,5）引物之间不应存在互补序列，以防形成二聚体 (dimer)；,引物设计软件：Primer 5, Oligo,2、引物设计的原则,6）引物的 5 端可添加限制性内切酶识别位点，便于PCR 产物的定向克隆。,5 CATATG,3,3,TTCGAA 5,NdeI,HindIII,2、引物设计的原则,3,5,3,5,限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记,引 物,模 板,（1）反应成分,1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100 ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,3、PCR反应条件,2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。,5）Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂，0.5 mmol/L-2.5 mmol/L反应体系； Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性； Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,（6）缓冲液（Buffer）,10 mmol/L TrisHCl 调节pH，使Taq酶活性作用环境维持在扁碱性（pH 8.3,室温） 50 mmol/L KCL 有利于引物的退火，但过高会抑制Taq酶活性 0.01% BSA， 保护酶不变性失活。,1）变性 使双链DNA解链为单链 95 oC，20-30 秒 2） 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合; 降低温度可增加反应的灵敏性。,2）循环参数,3）延伸 70-75 oC， 延伸时间由扩增片段长度决定。 4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度； 一般为25-35 次； 次数过多：扩增效率降低， 错误掺入率增加。,PCR反应曲线,抑制 PCR 反应的物质,常用的热稳定 DNA 聚合酶,（三）PCR的特点,特异性强 灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克量级的起始待测模板扩增到微克水平。 简便、快速 PCR反应一般在24 小时完成扩增反应。对标本的纯度要求低。扩增产物一般用电泳分析，无放射性污染、易推广。,待扩增片段：1000 bp 引物 Tm 55 DNA 模板变性: 94, 5分钟; PCR 循环 (30 次): 94, 30秒; 50, 30秒; 72, 1分钟; 最终延伸: 72, 7-10分钟,PCR 反应条件的设定,PCR 产物的检测- 琼脂糖凝胶电泳,PCR 产物,PCR 产物,三、PCR常见问题,1、无扩增产物（假阴性）,2、非特异性扩增,3、拖尾,4、假阳性,1、无扩增产物,模板:含有抑制物，含量低； Buffer对样品不合适； 引物设计不当或者发生降解； 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短。,原因,对 策,纯化模板或者加大模板的用量； 更换Buffer或调整浓度； 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物； 降低退火温度、延长延伸时间。,现象：正对照有条带，而样品则无。,2、非特异性扩增,现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 Mg2+浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多,原因,对 策,重新设计引物或者使用巢式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 减少循环次数,非特异性扩增,3、拖尾,现象：产物在凝胶上呈Smear状态。,M 1 2,模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多,原因,对 策,纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数,拖 尾,4、假阳性,原因：靶序列或扩增产物的交叉污染,现象：空白对照出现目的扩增产物。,对策： 1）操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 2）除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 3）各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,（一）防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 （二）设立对照 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板 试剂对照： 除模板外的所有组分,其他注意的事项,四、PCR的类型及应用,重组PCR 不对称PCR 反向PCR 多重PCR 原位PCR RTPCR 巢式PCR 递减PCR 热启动PCR 实时定量PCR,一、PCR的类型,1、巢式 PCR,用第 2 对引物来验证用第 1 对引物所扩增的 PCR 产物,PCR,环化,2、反向 PCR,3、热启动PCR （HotStart PCR）,热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度；,现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用；,热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。,逆 (反) 转录酶以 mRNA 为模板合成第 1 条 cDNA 链，然后通过 PCR 反应扩增出许多 cDNA 分子拷贝。 RT-PCR 是扩增 mRNA 的快速及灵敏的方法。 1. 检测某一基因在转录水平的表达 2. 克隆特异的 cDNA,4、RT-PCR,5,3,AAAAA,5,3,5,3,3,5,5,3,RT-PCR 原理,mRNA,1st cDNA,逆转录酶、下游引物、dNTPs,DNA 聚合酶、上游及下游引物、dNTPs,5,5,3,3,特异 PCR 产物,5,5,3,3,经 30 个循环，产生 230 个分子拷贝,5,5,3,3,5,5,3,一步法 RT-PCR RT 反应与 PCR 反应在同一个试管中进行。 两步法 RT-PCR RT 反应与 PCR 反应在不同的试管中进行。,下游引物 特异性引物 Oligo(dT),-actin GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 18S rRNA,用作内参的管家基因,5、Real Time Quantitative PCR, qRT-PCR 在 PCR 反应体系中加入荧光报告基团，利用荧光信号的积累实时监测 PCR 反应进程，对扩增的 PCR 产物进行定量分析的方法。 具有高度敏感性：用于检测微量的 DNA 或 RNA 样品； 检测每一次 PCR 循环中产物的积累； 扩增反应结束后不需要对PCR 产物进行电泳。,R = Reporter (荧光报告染料) Q = Quencher (淬灭物),TaqMan 探针,当 TaqMan 探针完整时，荧光报告染料发射的荧光被淬灭物所淬灭。,在延伸反应中， 荧光报告染料被 DNA 聚合酶切除后与淬灭物分离，其荧光信号被检测。,QuantiProbe 不与 DNA 分子结合时，荧光报告染料发射的荧光被淬灭物所淬灭。 当引物退火时， QuantiProbe 与单链 DNA 分子杂交，荧光报告染料与淬灭物分离，其信号被检测。 在延伸反应时， QuantiProbe 被置换，荧光报告染料发射的荧光又被淬灭物淬灭。,QuantiProbe,不规则结构的探针,Molecular Beacons,发夹结构的探针,研究：基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断：细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程：遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医：犯罪现场标本分析 肿瘤：各种肿瘤检测 其他,二、PCR的应用,用于克隆 PCR 产物的载体,lacZ,PCR 产物,dA,平端克隆载体: 用于克隆平端 PCR 产物,dA,dT,dT,lacZ,载体,lacZ,PCR 产物,lacZ,载体,TA 克隆载体: 用于克隆 3 端携带 A 的 PCR 产物,PCR 定向突变基因,1M 和 2M 引物含有突变的碱基,使用 Touch down PCR 便于A 和 B 的退火,梯度 (Gradient) PCR 仪,降落 PCR (Touch down PCR) 每隔一个循环降低1反应退火温度，直至达到 “Touch down” 退火温度。,正常人血红蛋白 亚基,镰刀型贫血病人血红蛋白 亚基,镰刀型贫血病人血红蛋白 亚基编码基因,正常人血红蛋白 亚基编码基因,PCR DdeI 酶切 琼脂糖凝胶电泳,变性 PCR 产物的 聚丙烯酰胺凝胶电泳,1. 一条染色体上的 DNA 发生突变 2. 正常对照,PCR-SSCP,第二章、基因工程的基本技术,第一节 核酸的提取与质量测定 第二节 PCR技术 第三节 核酸的凝胶电泳 第四节 核酸杂交技术,核酸按戊糖分为两大类： 脱氧核糖核酸（DNA）Deoxyribonucleic Acid 核糖核酸（RNA）Ribonucleic Acid * rRNA （ribosomal RNA ） 80% * tRNA （transfer RNA ） 15% * mRNA （mesenger RNA） 5%,核酸的种类,核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3，5- 磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。 DNA主要储存遗传信息。 RNA主要传递遗传信息。,核酸的分布,核酸的理化性质,RNA的纯品都呈白色粉末或结晶； DNA则为白色类似石棉样的纤维状物； DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。,裂解细胞（破细胞壁和细胞膜）内容物释放； 分离出核酸去除蛋白质和多糖及杂质； 沉淀/吸附DNA,去除RNA； 溶解DNA,并保存。,2、基因组DNA的提取,DNA提取的基本步骤：,结构完整: 保持DNA结构相对完整； 纯度高: 尽量排除其他大分子的污染（蛋白质、多糖、及RNA等），保证样品中不含有有机溶剂及高浓度的金属离子； 得率好: 选用合适的方法获得足够的样品。,DNA提取一般原则：,机械方法使组织和细胞破碎； 加入SDS、CTAB等离子型表面活性剂，溶解细胞膜和核膜蛋白，使细胞膜和核膜破裂； 加入酚和氯仿等变性剂，充分振荡，使蛋白变性; 离心去沉淀; 加入无水乙醇或异丙醇沉淀DNA； 沉淀的DNA溶于TE溶液或超纯水中保存备用。,2.1 植物基因组DNA的提取,材料: 植物各个部位都可用作总DNA抽提的材料，常用的材料一般为植物幼叶。,基本步骤：,CTAB法提取植物DNA的原理 (植物DNA提取经典方法）,CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物； 在低离子强度溶液中，CTAB能沉淀核酸与酸性多聚糖；,高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和（非酸性）多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸； 通过有机溶剂去除蛋白、多糖、酚类等杂质，加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15 。,CTAB提取缓冲液（2）的经典配方,1、Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； 2、EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；,3、NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中； 4、CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； 5、-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。,CTAB提取缓冲液（2）的改进配方,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,CTAB法流程图,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,乙醇沉淀,DNA溶液,操作步骤:,（1）组织粉碎,取少量样品（0.5-2 g)，吸干水分，加液氮冷冻后迅速研磨成细粉末。,（2）细胞裂解,取适量CTAB提取缓冲液悬浮样品, 移入离心管中，65 oC 温育1-2 h，间歇震荡。离心（10,000 rpm, 10 min)去沉淀，上清入新管。,（3）纯化DNA,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液抽提，除去蛋白质等污染。,（4）沉淀DNA,加入0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA（选择性加1/10体积的3 M醋酸钠）。 温度：室温/4 /-20 ； 时间： 10 min-过夜。 离心（10,000 rpm, 10 min) 收集DNA沉淀，室温晾干。,苯酚： 强变性 25 氯仿： 弱变性 24 异戊醇：消泡 1,（5）溶解DNA,以适当TE溶液重悬DNA，可加入适量用RNase A以去除RNA。,（6）保存DNA,4 /-20 /-80 ,2.2 细菌基因组DNA的提取,2.3 哺乳动物细胞基因组DNA的提取,基因组DNA提取常见问题分析,A) DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应 DNA中含有蛋白、多糖、多酚类物质 抽提纯化、高盐洗涤 DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 重新沉淀或进一步晾干 DNA中残留有金属离子 重新70%乙醇漂洗,B) DNA降解,材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染,C) DNA提取量少 实验材料不佳或量少 选取新鲜（幼嫩）材料 破壁或裂解不充分 充分研磨、破壁酶、延长裂解时间 沉淀不完全 低温、延长沉淀时间 洗涤使得丢失DNA 小心操作，保留上清液,重点介绍经典的提取方法：碱裂解法（三液法）。,3、质粒DNA的提取,质 粒（plasmid）,是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等 质粒的复制：严紧型复制（1-n个） 松弛型复制（20个以上）,碱裂解法提取质粒的原理,在pH 12.0 12.6碱性环境中，大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。 将pH调至中性并有高盐存在的条件下，质粒DNA迅速复性，呈可溶状态；大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀。 通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。,闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；,原 理,DNA双链,变性,DNA单链,复性,强碱,中性,染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。,变性,质粒提取碱裂解法原理,质粒提取的思路,质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA 要去除的物质：蛋白/基因组DNA/脂类/小分子杂质/RNA,三个基本步骤： 细菌的生长和质粒的扩增 菌体的收集裂解及质粒DNA的分离 质粒DNA的纯化,Solution I ：,50 mM 葡萄糖， 25 mM Tris-HCl(pH8.0)， 10 mM EDTA， （RNase A）,0.2 M NaOH，1.0% SDS,3 M 醋酸钾/2 M 醋酸（pH 4.8),Solution II ：,Solution III ：,三种溶液的配方,注：现配现用,质粒提取的步骤,取1.5 ml培养物倒入Eppendorf管中，12000 r/min，4 ，30 sec，吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥； 将细菌沉淀悬浮于100l预冷的溶液I中，剧烈振荡； 加200L溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf管，快速颠倒5次，混匀内容物，冰置3-5 min; 加入150L溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置3-5 min；,12000 r/min，离心5 min，将上清夜转至新管中 ； 向上清夜加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置10 min。12000r/min离心5 min，去上清，Eppendorf管倒扣于吸水纸上，吸干液体。 用1 ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清夜，室温干燥； 50L TE缓冲液，使DNA完全溶解，-20保存。,质粒DNA提取常见问题分析,A) RNA残留 忘记加RNase A？ I液中RNase A失效？ 酶量不够？,B) 质粒断裂 II 液裂解时间过长？ 裂解时动作过于剧烈？,质粒DNA提取常见问题分析,C) 量少 凝胶是否有问题？ 菌体量少 菌体重悬不彻底 裂解不完全 菌株老化 严谨型质粒,质粒DNA提取常见问题分析,严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下进行的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝； 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下进行的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。,离心柱型质粒DNA提取试剂盒工作原理,改进的SDS-碱裂解法裂解细胞， 离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA， 再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除， 最后用低盐、高pH值的洗脱缓冲液将DNA洗脱。,4、RNA提取的基本原理与方法,RNase是导致RNA降解的最主要物质！ RNase的来源 样品 试剂 多次使用的器具 裸露的手 说话产生的唾沫 空气,RNase非常稳定，它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。,1) RNase的特点：抗酸、抗碱,具很广pH作用范围; 抗高温严寒(0-65均具活性）；抗变性剂。 2) 解决办法： 外源RNase：高温，焦磷酸二乙酯(DEPC)处理几乎所有溶液和器皿，操作者带手套。 内源RNase：高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等。,制备RNA的关键防止内外源RNase的作用,原理： 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放； 释放出来的DNA和RNA由于低pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的有机相（DNA）和水相（RNA），从而得以分离； 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。,RNA提取的通用方法 异硫氰酸胍/苯酚法 （商品试剂：Trizol),总RNA提取完整性检测,293细胞总RNA,细胞中70-80% 的RNA为rRNA，后者又由28S（约4800 nt），18S（约1900 nt）和5.8S（约120 nt）三种组成，所以电泳后应该在UV下看见三条清晰的rRNA带。 核酸长度与结合EB的数量成正比，所以28S rRNA条带的荧光强度一般比18S rRNA条带的荧光强度强1.5-2.3倍。如果这两条rRNA带不清晰或比例小于此范围则表示RNA有降解（因为大的RNA被酶降解的可能更大）。,电泳检测,RNA提取常见问题分析,A) RNA降解 外源RNase的污染 裂解液质量 裂解液用量不足 样品本身富含RNase 环境温度过高,B) DNA残留 样本量过多 吸取到中间层及下层试剂 解决办法： DNA酶（RNase free）消化，再抽提纯化处理。,RNA提取常见问题分析,RNA提取常见问题分析,C) 电泳带型异常 上样量超过 3g 电压超过 8V/cm 电泳缓冲液陈旧 均可能导致 28S 和 18S 条带分不开,5、核酸提取过程中其他需要注意的事项,(1）质量检查 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。 (2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应戴手套。,5.1 如何使用酚,沉淀是浓缩核酸最常用的方法，其优点如下： 改变核酸的溶解缓冲液； 重新调整核酸的浓度； 去除溶液中某些盐离子与杂质。,5.2 核酸的沉淀,表1 核酸沉淀的盐类及浓度,5.2.1 盐的选择,（1）乙醇 优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。 缺点：需要量大。,（2）异丙醇 优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。 缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀异丙醇难以挥发除去（最后用70乙醇漂洗数次）。,5.2.2 有机溶剂的选择,（3）其他,5.2.2 沉淀的时间和温度,一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0 冰水（或室温），10-15 min， DNA样品足可达到实验要求。,DNA ： DNA样品溶于pH 8.0的TE，4 或-20 保存； 长期保存样品中可加入1滴氯仿。 RNA ： RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中， -70 保存; 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70，可保存数年。,5.3 核酸的保存,6、核酸含量/纯度的测定,紫外分光光度法,原理：根据核酸分子中的嘌呤环和嘧啶环在=260nm处有最大吸收值，可采用紫外分光光度法测定核酸的含量。1g/ml的DNA溶液的A260 nm吸收值为0.020，1g/ml的RNA溶液的A260 nm吸收值为0.022，以此为标准，可测得溶液中的核酸含量。,DNA 的OD260/OD280值大约为1.8。 当OD260/OD280大于1.8则可能有RNA污染。 当OD260/ OD280小于1.8时则有蛋白质污染。 在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相当于双链DNA浓度为50g/ml；单链DNA为37 g/ml；RNA为40 ug/ml。,DNA的纯度可用OD260与OD280的比值来衡量。,1. 测DNA： 纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260mOD230应大于2.0。 1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。 2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。 注：可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。,2. 测RNA 纯的RNA样品其OD260OD280约为2.0，OD260/OD230比值应大于2.0。 1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染； 3）OD260/OD230比值小于2.0时，表明有小分子及盐存在。,带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，带电分子在电场中的移动速度称为电泳迁移率。 2. 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。 3. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。,一、电泳的基本原理,4. 如果电场强度一定（电压和电极距离）且电泳介质相同（电泳液和凝胶）， 分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状，形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。,5. 因此，电泳可以： 分离不同分子质量的DNA； 分离相同分子质量但构型不同的DNA ,以及带电荷多寡的DNA； 制备纯化特定DNA片段。,不同构像的质粒,Relaxed,supercoiled,Increasing degree of supercoiling,相同分子量的质粒DNA:,闭合环状卷曲超螺旋迁移最快， 线性分子次之， 伸展开环状最慢。,二 、琼脂糖凝胶电泳,1. 琼脂糖,2. 琼脂糖凝胶,琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点(或90 )后溶解，冷却(45 后又凝固成均匀的的胶体。,是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。,琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。,浓度高,空隙小,浓度大，空隙小，分辨率高