大学生研究性学习和创新性实验计划项目.doc

大学生研究性学习和创新性实验计划项目结题报告书项目名称复合菌群的固定化及其降酚特性项目主持人陈泽新所在学校及院系湘潭大学化工学院项目级别国家级 省级 校级立项年份2011年4月指导老师曾虹燕（教授）填表日期2012年3月4日湘 潭 大 学 教 务 处 制一、基本情况项目名称复合菌群的固定化及其降酚特性立项时间2011年完成时间2013年 项目主要研究人员序号姓 名学号专业班级所在院（系）项目中的分 工1陈泽新2009651110生物工程2班化工学院确定研究方向及其目标、后期总结及操作实验2陈婉2009651106生物工程2班化工学院过程探讨及操作实验3单建军2009651115生物工程2班化工学院搜集整理资料及操作实验4杨硕2009651133生物工程2班化工学院仪器研究使用及操作实验5伍春辉2009651118生物工程2班化工学院数据记录及操作实验二、研究成果简介项目成果类型产品 系统软件 论文 专利 其它（注：请在相应成果复选框内打“”，其它请具体说明）项目成果名称已发表论文：双金属Hg2+和Cu2+对木瓜蛋白酶活性与构象的影响，中南大学学报自然科学版（EI核心）1、 项目研究的目的及意义本项目旨在提供一种用生物法处理含酚废水的方法，从活性污泥中驯化筛选出高效降酚菌种，构建高效复合菌群，深入研究其降酚特性，以提高复合菌群的环境适应性，并对其固定化做初步研究。在此过程中，针对废水中常见重金属离子污染物Hg2+和Cu2+，我们利用单一、低特异性的木瓜蛋白酶代替复杂的菌体蛋白酶，研究了Hg2+和Cu2+离子对蛋白酶活性与构象的影响。我们的目的就是在进行创新实验的过程中，锻炼我们的综合思维能力、动手能力和自主学习能力，扎实专业基础知识，培养合作精神，使我们更能适应社会，成为具有创新思维和自主学习能力的复合型人才，真正达到开展大学生创新基金研究项目的。 含酚工业废水毒性大，对环境污染严重，且大部分废水中有不同程度的重金属离子污染，降解率低，一直困扰着煤气废水、焦化废水等的工业废水处理，是世界各国重点解决的有害废水之一。本项目驯化、筛选出了高效降酚菌群，揭示了其最佳生长条件，并采用水滑石固定高效复合菌群，固定化后苯酚的降解率得到提高；利用木瓜蛋白酶进行废水中常见重金属离子Hg2+和Cu2+对蛋白酶活性与构象影响的研究，初步揭示了这两种重金属离子对菌体内相似半胱氨酸蛋白水解酶的影响。这些工作对用生物法去除废水中的酚类物质、改善水资源环境以及理解废水中重金属离子的毒性机理具有重要的理论意义和实践意义。2、 研究和实验的主要内容1. 从获得活性污泥中，经驯化、筛选，获得复合降酚菌群，并分离鉴定主要菌种菌属。2. 针对复合菌群的降酚特性，确定其最佳生长条件。3. 以镁铁水滑石为载体，研究最佳镁铁比、水滑石投加量和固定时间，以及外界条件对固定化复合菌群降酚特性的影响。4. 在蛋白酶最佳反应条件下研究Hg2+、Cu2+和Hg2+Cu2+离子对其活性以及构象的影响。3、 项目的研究成果及结论1. 根据伯杰细菌鉴定手册和一般常用细菌鉴定手册，结合生理生化实验，鉴定复合菌群中最主要两种菌种分别为黄杆菌属(Flavobacterium sp.)和醋酸杆菌属（Acetobacter sp.）。2. 确定了复合菌群降酚的最佳实验条件是温度33，pH 6.06和接种量13%，此时苯酚的降解率和生物量分别是96.97% 和410.78 mg/L。3. 以镁铁水滑石为载体，经过固定化实验研究发现，镁铁比为3:1，水滑石投加量为4g/L,固定化12 h时，制备的水滑石固定化载体的降酚活性最高；同时研究了外界条件对固定化复合菌群降解苯酚的影响，发现在30-37和pH 5.0-7.0时，其降酚率维持在高水平，相比未固定的复合菌群固定化后更易于回收，简化了工业废水的下一步处理。4. 研究Hg2+、Cu2+对酶活性的影响，确定了Hg2+和Cu2+浓度分别为10-6mol/L和10-9mol/L时，对酶的激活作用最强；Hg2+和Cu2+浓度均为10-4mol/L时，对酶的抑制作用最强。5. 双金属离子对酶活性影响的实验结论表明，金属离子与木瓜蛋白酶活性之间存在剂量-效应关系，表现出低剂量促进，高剂量抑制的Hormesis现象。低浓度下，双金属Hg2+和Cu2+表现出协同激活效应；高浓度下，Cu2+的添加屏蔽了Hg2+的抑制作用。双金属离子浓度为106 mol/L Hg2+和108 mol/L Cu2+时，对酶的激活效应最大，其处理的木瓜蛋白酶的有序结构(-螺旋+-折叠)含量最高，二级结构最稳定，酶与底物亲和力最强，活性最高。当双金属离子浓度为104 mol/L Hg2+和104 mol/L Cu2+时，其抑制力最强，处理的木瓜蛋白酶有序结构含量最低，二级结构破坏，活性最低。木瓜蛋白酶分子构象的有序度与其活性呈正相关。4、 特色与创新之处1. 本项目中采用水滑石固定高效复合菌群，固定化后苯酚的降解率得到提高，且水滑石便于分离进行二次回收利用，既节省实验成本又不会对环境造成二次污染。2. 由于木瓜蛋白酶是半胱氨酸内肽酶家族中最具代表性、研究最为广泛深入的一种蛋白酶，它和动植物体内的其他半胱氨酸蛋白水解酶具有类似的结构和功能，本项目中利用单一、低特异性的木瓜蛋白酶为探针代替复合菌群中提取出的复杂的蛋白酶液来研究废水中重金属离子对酶的毒性机理，简化了实验过程，具有一定的参考价值。3. 由于有关重金属离子与酶的作用机理的研究多集中在单一金属离子对酶活力的影响，有些欠缺详细和系统的研究，关于双金属离子对酶活力的影响，特别是对酶催化特性及其构象的影响还鲜有报道，而且在工业废水中重金属离子往往多种同时存在，故本实验选取了工业中常见的、具有代表性、且对木瓜蛋白酶活性影响较大的Hg2+、Cu2+进行研究，系统考察了单一金属离子(Hg2+、Cu2+)以及双金属离子(Hg2+Cu2+)对木瓜蛋白酶的作用，探究双金属离子(Hg2+Cu2+)对木瓜蛋白酶构象的影响，探讨Hg2+、Cu2+及Hg2+Cu2+与木瓜蛋白酶之间的相互作用，从分子水平上研究双金属离子与酶间相互作用机理。三、项目研究总结报告一、预定计划执行情况1. 完成高效复合降酚菌群的驯化、筛选、分离以及鉴定。2. 完成复合菌群降酚特性的研究，确定了最佳实验条件。3. 完成以水滑石为载体固定复合菌群的研究，确定了固定化载体的适宜反应条件。4. 完成重金属离子Hg2+、Cu2+以及双金属离子对酶活性和构象影响的研究。二、项目研究和实践情况1. 菌体鉴定从湖南湘潭市某造纸厂综合废水处理站曝气池中获得活性污泥，对活性污泥进行多次驯化、筛选，得到复合降酚菌群，对该菌群分离菌种进行生理生化实验，并查阅伯杰细菌鉴定手册和一般常用细菌鉴定手册，鉴定其为黄杆菌属(Flavobacterium sp.)和醋酸杆菌属（Acetobacter sp.）。在后续的实验中我们主要是以这两种细菌组成的复合菌群进行降解苯酚的研究。2. 最佳反应条件确定在实验室中对复合菌群的降酚特性进行了研究，研究了单因素：温度、pH值和接种量对苯酚降解率的影响，并以温度，pH和接种量为随机因子，以苯酚降解率和生物量为响应值，进行了三因素三水平的响应面分析。最终得到了最佳的实验条件是温度33，pH6.06和接种量13%，此时苯酚的降解率和生物量分别是96.97% 和410.78 mg/L。3. 固定化研究以镁铁水滑石为载体，对复合菌群进行了固定化研究。经过实验研究发现，在最佳实验条件下，镁铁比为3：1，水滑石投加量为4g/L,固定化12 h时，制备的水滑石固定化载体的降酚活性最高；同时研究了外界条件对固定化复合菌群降解苯酚的影响，发现在30-37和pH5.0-7.0时，降酚率都维持在高水平。4. 双金属离子毒性机理研究由于废水中不仅含有酚类污染物，还含有重金属离子污染物，以Hg2+、Cu2+离子为代表，针对重金属离子对菌体内酶的影响做了进一步研究，并且由于菌体内酶成分复杂，故以半胱氨酸内肽酶家族中最具代表性、研究最为广泛深入的木瓜蛋白酶为替代物研究双金属离子对酶的影响机理。研究Hg2+、Cu2+离子分别对酶活性的影响，确定了Hg2+和Cu2+浓度分别为10-6mol/L和10-9mol/L时，对酶的激活作用最强；Hg2+和Cu2+浓度均为10-4mol/L时，对酶的抑制作用最强。研究双金属离子对木瓜蛋白酶活性的影响，发现了两者之间存在的剂量-效应关系，表现出低剂量促进，高剂量抑制的Hormesis现象。低浓度下，双金属Hg2+和Cu2+表现出协同激活效应；高浓度下，Cu2+的添加屏蔽了Hg2+的抑制作用。双金属离子浓度为106 mol/L Hg2+和108 mol/L Cu2+时，对酶的激活效应最大，酶与底物亲和力最强，活性最高。当双金属离子浓度为104 mol/L Hg2+和104 mol/L Cu2+时，其抑制力最强，酶与底物亲和力最弱，活性最低。采用Hg2+Cu2+浓度分别为(104+104)和(106+108) mol/L的混合液处理木瓜蛋白酶，以纯酶为对照，将样品进行FT-IR、荧光光谱以及紫外吸收光谱表征分析，探求Hg2+Cu2+对木瓜蛋白酶二级结构影响。三、研究成果 已发表论文： 双金属Hg2+和Cu2+对木瓜蛋白酶活性与构象的影响，中南大学学报自然科学版（EI核心）4、 尚需深入研究方面1. 在对黄杆菌属和醋酸杆菌属组成的复合菌群降酚特性的研究中得到的最佳实验条件，即温度33，pH6.06和接种量13%，此时苯酚的降解率和生物量分别是96.97% 和410.78 mg/L，但是两种菌属在各自的最适条件下对苯酚的降解率还需要深入研究。2. 在木瓜蛋白酶的最佳反应条件下，即反应温度为45，PH为7.0，底物浓度为2.0mg/ml时，初步研究了Hg2+、Cu2+两种金属离子对木瓜蛋白二级结构的联合影响，但是Hg2+和Cu2+分别与各自激活位点结合改变酶的构象还需要进行深入研究。3. 在废水中存在Hg2+、Cu2+两种金属离子对以水滑石为载体的固定化复合菌群的降酚特性的影响还需要深入研究，以期该复合菌群能适应更复杂的废水环境，为生物法处理废水工艺的进步做出贡献。四、经费使用情况经费合计 1200 元，其中，学校配套资助 0 元，学院（所）配套资助 0 元，其他经费 0 元。经费支出情况： 经费来源 湘潭大学大学生