基础生技实验二-四.doc

实验二：细胞计数、大小测量及膜通透性实验一、实验目的1、了解普通光学显微镜的基本构造，能规范和较熟练地使用。2、了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，学习并掌握显微镜测微技术测量细胞大小的基本方法。3、学习使用血球计数板。4、观察细胞膜的通透性。5、了解膜通透性的一般规律。二、实验原理1、目镜测微尺和镜台测微尺。目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把10 mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长l0m（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。2、血球计数测定细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。血球计数板是由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面个刻有一个方格网，即计数槽。方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室，供计数用。计数室通常有两种规格。一种是大方格内分为16中格（大方格用三线隔开），每一中格又分为25小格；另一种是大方格内分为25中格（大方格之间用双线分开），每一中格又分为16小格。但是不管计数室是哪一种构造；它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由1625=2516=400个小方格组成，见图。计数区边长各为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。3、细胞膜通透性。细胞膜是一种半透膜，对物质的通透具有选择性。将红细胞放在低渗溶液中，水分子会大量渗到细胞内，使细胞涨破，血红蛋白释放到介质中，这种现象称为溶血。将红细胞放在高渗溶液中，水分子会从细胞中深处，使细胞皱缩。三、实验器材 光学显微镜、镜台测微尺、目镜测微尺、血球计数板、盖玻片、经脱脂洗净的载玻片、擦镜纸、吸水纸、计数器、滴管、镊子、手术剪、医用一次性采血针，脱脂棉、香柏油。四、实验材料1、活兔。2、瑞氏(wright)染液：瑞氏粉 0.1g，甲醇60ml。瑞氏粉0.1g置于洁净研钵中，加入10-20ml甲醇，充分研磨，将已溶部分移入试剂瓶中，未溶部分继续加入适量甲醇研磨，直至全部溶解。24h后即可使用。3、0.17mol/L氯化钠溶液（0.9%氯化钠溶液）。4、1mol/L氯化钠溶液。5、3.8%柠檬酸钠。6、二甲苯。7、乙醚。8、95%乙醇。五、实验操作1、用显微测微尺测量真核细胞的大小。1）目镜测微尺的校正。把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0m，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。目镜尺每格所代表的实际长度=（两重合线间镜台测微尺的格数/两重合线间目镜测微尺的格数）10m。例如目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小格重叠，已知镜台测微尺每小格为l0m，则目镜测微尺上每小格长度为=510m/510m分别记录低倍镜和高倍镜下目镜测微尺每格长度的标定结果。要求测3次，以3次的平均值为标定结果。用同法分别校正在高倍镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。2）细胞大小的测定血涂片的制备。A、采血：将兔耳部毛剪掉，酒精消毒，刺破动物耳部皮肤，挤去第一滴血不要（因含单核白细胞较多）。B、涂片：挤出第二滴血置于载玻片的一端，再取另一张边缘光滑的载玻片，斜置于血滴的前缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状，两玻片的角度以30-45为宜（角度过大血膜较厚，角度过小则血膜较薄），轻轻将载玻片向前推进，即涂成血液薄膜。推进时速度要一致，否则血膜成波浪状，厚薄不均。C、将制好的涂片晾干之后，滴加数滴瑞氏染液盖满血膜为止，染色1-3min。然后滴加等量pH6.4-6.8的磷酸盐缓冲液或者蒸馏水，使其与染液均匀混合，静置2-5min。用蒸馏水冲去染液，吸水纸吸干，镜检。注意：冲洗血膜时应将玻璃片持平，冲洗后斜置血涂片于空气中干燥，或先用滤纸吸取水分迅速干燥。 D、封片：经染色的涂片完全干燥后，用中性树胶封片保存。染色后：红细胞呈桔红色；中性粒细胞核为蓝紫色，颗粒呈蓝紫至紫红色；嗜酸性粒细胞颗粒呈鲜红至桔红色；嗜碱性粒细胞颗粒呈深蓝紫色；淋巴细胞核呈深蓝紫色，胞质呈天蓝色；单核细胞核呈浅紫色，胞质呈灰蓝色。移去镜台测微尺，换上兔血涂片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量红细胞直径占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该红细胞直径。记录红细胞直径的测量结果，要求均测3个细胞的直径，以3个细胞直径的平均值作为测量结果。计算红细胞的体积。2、用血球计数板计数。1）制备兔红细胞悬液。2）取干净的血球计数板，将盖片盖在计数槽（光洁透亮的区域）上，用吸管将制备好的兔红细胞悬液吹匀，吸管头从计数板中间平台两侧的沟槽内紧挨盖片边缘，滴一小滴悬液（不宜过多）于血球计数板的斜坡和盖片之间的缝隙中，使之自然渗入到计数槽内；让悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余悬液。3）静置片刻，使细胞全部沉降到血球计数室内。将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，调暗视野，观察计数槽上的格纹并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。4）计数时若计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。如果是25个大方格组成的计数区，除数上述四个大方格外，还需数中央l个大方格的细胞数（即80个小格）。如细胞位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。5）按以下公式计算每毫升悬液中的细胞数：、16格25格的血球计数板计算公式：血红细胞数ml=100小格内血红细胞个数100400104稀释倍数、25格x16格的血球计数板计算公式：血红细胞数ml=80小格内血红细胞个数80400104稀释倍数注：有稀释时才乘稀释倍数。6）血球计数板使用后，用自来水冲洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹风机吹干，或用95的乙醇、无水乙醇、丙酮等有机溶剂脱水使其干燥。通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复清洗直到干净为止。 制血涂片的注意事项1）使用载玻片时，不要用手触及玻片表面，保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。新载玻片常带有游离碱质，须用浓度为lmol/L 的HCl浸泡24h，再用清水彻底冲洗，干燥后备用。旧载玻片要用含洗涤剂的清水中煮沸20min，洗掉血膜，再用清水反复冲洗，最后用0.95L/L乙醇浸泡1h，干燥备用。 2）如染色太浅，可按照原来步骤重染；染色太深或有沉淀物则可用甲醇脱色后重染。 3）如白细胞核为天蓝色则染色时间过短。如红细胞呈紫红色，表示染色时间过长。 4）染色时切勿使染液干涸，否则发生不易去掉的沉淀。 5）冲洗时不可先倾倒染色，应先轻轻摇动玻片，缓慢加水使沉渣泛起，然后再用水冲洗。 6）水冲洗时间不宜过长，否则会脱色。3、制备兔红细胞悬液取兔静脉血液20ml（加抗凝剂3.8%柠檬酸钠），以1份兔血加10份0.17mol/L氯化钠溶液配制兔红细胞悬液，并镜检。4、低渗溶血的观察 取试管1支，加入5ml蒸馏水，再加入0.5ml红细胞悬液，观察溶液颜色的变化，由不透明逐渐变成红色澄清，说明红细胞发生破裂造成100%红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液，并镜检。5、兔红细胞的渗透性取试管1支，加入0.17mol/L氯化钠溶液溶液5ml，再加入0.5ml红细胞悬液，轻轻摇动，观察颜色有无变化？有无溶血现象？分析原因。6、高渗溶液观察试管1支，加入5ml 1mol/L氯化钠溶液，再加入0.5ml红细胞悬液，观察溶液颜色的变化，并镜检。7、溶血结果判断：1）不溶血：液体分两层，上层浅黄色透明，下层红色不透明，镜检细胞完好。2）不完全溶血：液体混浊，上层变红色，镜检有部分细胞破裂。3）完全溶血：液体变红而透明，镜检发现细胞全部呈碎片。实验三：生化组分的鉴定（以糖和蛋白质为例）一、实验目的1、了解常见生化组分鉴定的方法与意义。2、掌握鉴定糖和蛋白质的原理与方法。3、了解有关酶的特性。二、实验原理淀粉广布于植物界，谷、果实、种子、块茎中含量丰富，工业用淀粉主要来源于玉米、山芋、马铃薯。淀粉遇碘呈蓝色，是由于碘被吸附在淀粉上，形成一复合物，此复合物不稳定，极易被醇、氢氧化钠和加热等使颜色褪去。-淀粉酶是工业上使用最广泛的酶制剂之一。-淀粉酶能将淀粉分子链中的-1，4-葡萄糖苷键切断，使淀粉成为长短不一的短链糊精以及少量麦芽糖和葡萄糖，因此酶反应过程中淀粉对碘呈蓝色的特异反应逐渐消失，同时出现单糖的还原性。(C6H10O5)x (C6H10O5)y C12H22O11 C6H10O6淀粉 各种糊精 麦芽糖 葡萄糖费林试剂（Fehling）试剂和本尼迪特（Benedict）是极为含Cu2+的碱性溶液，能使具有自由醛基或者酮基的糖氧化，其本身还原成红色或者黄色Cu2O。此法常用作还原糖的定性或定量测定。蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可一产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白质亦是可产生相同的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质，颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。双缩脲反应：将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故能呈此反应。茚三酮反应：蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及-氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应。三、实验器材白色滴板（或白瓷板）、量筒、试管、烧杯、恒温水浴锅、试管夹、容量瓶、天平、电炉、移液管等四、实验试剂1、稀碘液：配制2%碘化钾溶液（KI），加入适量碘，使溶液呈棕黄色即可，储存于棕色瓶内。2、2%可溶性淀粉：称取4.00g可溶性淀粉，与少量冷蒸馏水混合成薄浆状，然后加入费沸蒸馏水，边加边搅拌，最后定容至200ml，此溶液当天配当天使用。3、0.02mol/L pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）45.23g，柠檬酸（C6H 8O 7H 2O）8.07g。用900ml蒸馏水溶解，调pH至6.0，然后定容至1000ml。4、本尼迪特试剂：称取85g柠檬酸钠（Na3C6H3O711H2O）及50g无水碳酸钠，溶于400ml蒸馏水中。另溶解8.5g硫酸铜于50ml热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如有沉淀可过滤。此混合液可长期使用。5、1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖3g，溶于蒸馏水并定容至300ml。6、-淀粉酶酶粉。7、牛血清白蛋白（BSA）。8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100ml。9、10%NaOH溶液：10gNaOH溶于蒸馏水。稀释至100ml。10、1%硫酸铜溶液：硫酸铜1g溶于蒸馏水，稀释至100ml。五、实验操作1、酶液的配制：称取酶粉10-15mg，用0.02mol/L pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解，然后定容至50ml备用。2、蛋白溶液的配置：称取牛血清白蛋白100mg，用0.02mol/L pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解，然后定容到50ml备用。3、酶促反应：（1）在白色滴板的空穴内各加3-4滴稀碘液。先用滴管取数滴2%可溶性淀粉溶液于1盛有稀碘液的滴板孔内，观察其颜色变化，（2）在试管内，加入5ml 2%可溶性淀粉溶液和2ml 0.02mol/L pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在60恒温水浴中预热5min。加入上述配制好的酶液0.5ml，不断搅拌，每隔1分钟用滴管取数滴于盛有稀碘液的滴板孔内，观察其颜色变化。4、本尼迪特试验：（1）取上述反应液3滴于1支试管中，然后加入本尼迪特试剂2ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察结果。（2）另取1支试管，加入1%葡萄糖溶液1ml，然后加入本尼迪特试剂2ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察结果。5、蛋白质双缩脲试验：取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10%NaOH溶液10滴及1%硫酸铜溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。6、蛋白质茚三酮反应：取1ml蛋白质溶液置于试管中，加2滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现。（此反须在pH5-7进行）。实验四：维生素C含量测定一、实验目的1、了解生化组分含量定量测定的意义。2、掌握维生素C定量测定的方法。3、了解定量试验统计学数据分析方法。二、实验原理滴定法是一些生理生化指标测定中比较常用的一种方法，一般可以分为两类：目前一般实验室滴定分析采用的是人工滴定法，它是根据指示剂的颜色变化指示滴定终点，然后目测标准溶液消耗体积，计算分析结果。自动电位滴定法是通过电位的变化，由仪器自动判断终点。维生素又名维他命，是维持人体生命活动必需的一类有机物质，也是保持人体健康的重要活性物质。维生素在体内的含量很少，但在人体生长、代谢、发育过程中却发挥着重要的作用。维生素不是构成机体组织和细胞的组成成分，它也不会产生能量，它的作用主要是参与机体代谢的调节。大多数的维生素，机体不能合成或合成量不足，不能满足机体的需要，必须经常通过食物中获得。人体对维生素的需要量很小，日需要量常以毫克(mg)或微克(g)计算，但一旦缺乏就会引发相应的维生素缺乏症，对人体健康造成损害。维生素C又叫L-抗坏血酸，是一种水溶性维生素。分子式：C6H8O6，分子量：176.12，酸性，具有较强的还原性，加热或在溶液中易氧化分解，在碱性条件下更易被氧化。其功能主要有：1、促进骨胶原的生物合成。利于组织创伤口的更快愈合；2、促进氨基酸中酪氨酸和色氨酸的代谢，延长肌体寿命。3、改善铁、钙和叶酸的利用。4、改善脂肪和类脂特别是胆固醇的代谢，预防心血管病。5、促进牙齿和骨骼的生长，防止牙床出血。6、增强肌体对外界环境的抗应激能力和免疫力。维生素C在自然界分布广泛，在柠檬汁、绿色植物及番茄中含量很高。维生素C是最不稳定的一种维生素,由于它容易被氧化，在食物贮藏或烹调过程中，甚至切碎新鲜蔬菜时维生素 C都能被破坏。微量的铜、铁离子可加快破坏的速度。因此，只有新鲜的蔬菜、水果或生拌菜才是维生素C的丰富来源。它是无色晶体，熔点190192，易溶于水，水溶液呈酸性，化学性质较活泼，遇热、碱和重金属离子容易分解，所以炒菜不可用铜锅和加热过久。维生素C的含量测定方法有很多，有碘滴定法，2,6-二氯靛酚滴定法，2,4-二硝基苯肼法，紫外吸收法等。本实验采用2,6-二氯靛酚滴定法，以新鲜的水果、树叶等为分析材料，进行抗坏血酸含量测定。染料2,6-二氯靛酚的颜色反应表现两种特性，一是取决于其氧化还原状态，氧化态为深蓝色，还原态变为无色；二是受其介质的酸度影响，在碱性溶液中呈深蓝色，在酸性介质中呈浅红色。用蓝色的碱性染料标准溶液，对含维生素 C的酸性浸出液进行氧化