Ni-NTAsuperflowcartridge中文手册.doc

Ni-NTA Superflow Cartridge 手册用于手动或FPLC纯化His-tag蛋白目录：包装内容物（4）储存和稳定性（4）安全措施（4）介绍（7）Ni-NTA Superflow Cartridge说明书（7）QIA表达系统（7）Ni-NTA Cartirdge 接头（14）天然或变性条件下纯化蛋白（15）说明书n 天然条件下清澈的E.coli菌液的制备（16）n 变性条件下清澈的E.coli菌液的制备（18）n 从E.coli细胞制备6XHis-tag的胞质蛋白（19）n 天然条件下从昆虫细胞中制备细胞菌液（20）n 使用注射器手动纯化6XHis-tag蛋白（21）n 使用自动层析系统纯化6XHis-tag蛋白（22）问题的解决（23）附录A：Buffer成分（25）附录B; Ni-NTA Superflow Cartridge的清洁与再生（27）包装包含物Cat no. Ni-NTA Superflow Cartridge（1） Ni-NTA Superflow Cartridge（5） 说明书30721 5 130725 100 130760 1 130761 5 130765 100 1技术支持在QIAGEN，我们为我们的技术支持的质量和有效性而感到骄傲我们的技术部门是由有广泛实验经验的技术人员和专家组成的，他们都从事分子生物学而且熟练使用QIAGEN的产品。如果您有任何问题或实验中遇到困难关于Ni-NTA SuperflowCartridge或QIAGEN的产品，请尽快联系我们。QIAGEN用户是我们改进和专业化产品的主要信息来源。这些信息对于我们的科研人员与其他的科学家一样重要。因此您如果有什么关于产品的建议或新的需要和技术等等请尽快联系我们。对于技术支持和更多的信息请联系QIAGEN的技术服务部或者当地经销商储存和稳定性Ni-NTA Superflow Cartridge应该储存在2-8度。不要冷冻。Cartridges在这样的条件下可以储存一年而性能不会发生任何改变。产品局限性Ni-NTA Superflow Cartridge仅供科研使用。没有声明或表述是用来为诊断，预防或治疗疾病而提供信息。所有预料到的麻烦和注意事项东应该使用中注意。对于重组DNA实验，我们推荐所有用户参照NIH指导方法，或者其他的可用性指导方针。产品授权和满意的保证QIAGEN保证产品的效果在我们的产品文献中都有描述。顾客对于产品的特殊用途必须决定它的适用性。如果不是由于使用造成的产品性能问题，QIAGEN将会免费更换或退货。我们有权更换、更改或是调整任何产品以增强性能和设计。如果QIAGEN产品没有达到您的要求，联系我们的当地技术部门或是销售商。我们将相信您的理由或者交换产品-只要您愿意。分离条件应用于QIAGEN科学仪器，服务产品，干冰用于产品运输。请询问更多的信息你还可以要求得到QIAGEN的条款和条件的副本，他会在我们的发票后提供给您。如果您有什么关于产品说明和性能的问题，请联系QIAGEN技术服务和当地经销商。安全措施当工作时使用化学药品时，通常要穿实验服装，带一次性手套和护目镜。更多的信息请咨询MSDSs。您可以在网站下载PDF或打印QANGE kit 和kit 组成以下危险和安全性用语适用于Ni-NTA Superflow Cartridge。包含乙醇和镍铵酸。伤害性的，感光的，易燃的。危险和安全用语：R10-22-40-42/43。S13-26-36-4624小时紧急情况紧急医疗信息24小时内可以从Poison Information Center Mainz, Germany得到，有英语、法语和德语三种。电话：+49-6131-19240介绍QIAGEN Ni-NTA Superflow Cartridge是预先装好Ni-NTA Superflow的1ml和5ml柱子，用来纯化6XHis-tagged蛋白，可以使用注射器、蠕动泵，或者液相层析系统（例如AKTA或FPLC）Ni-NTA Superflow Cartridge1ml Cartridge5ml Cartridge介质Superflow(6%高胶连琼脂糖)珠子直径60-169微米柱子体积6.7mmX28mm14.7mmX29.8mm最大承受压5bar，0.5MPa5bar，0.5MPa典型背景压力（BufferNP-10,10%甘油）1.0Bar，0.1MPa（1ml/min）2.0Bar，0.2MPa（5ml/min）推荐流速1ml/min（155cm/h）5ml/min（170cm/h）最大流速10ml/min（1560cm/h）40ml/min（1360cm/h）柱连接表3，14页表3，14页短期储存PH稳定值(2H)2-142-14长期储存PH稳定值(2H)3-123-12吸附能力至少20mg(1膜20KDa)至少100mg(5膜20KDa)系统兼容性自动层析系统（例如AKTA，FLPC，BioLogic，BioCAD，Vision workstation）Cartridge材料聚丙烯连接器1/16”(入口)；M6(出口)Superflow自身最大可以使用的压力是10Bar。但是，Cartridges的稳定性仅在小于5Bar保证高流速可能导致恢复6XHis-tagged蛋白减少蛋白不同吸附能力不同QIA表达系统QIA表达系统以6Xhis tag为基础，这是一个亲和标签由6个连续的His残基组成。这个亲和标能够被QIAGEN独特的专利产品Ni-NTA金属吸附层析柱显著的选择吸附。QIA表达系统这个独特的特性提供了大量的显著优势（表一）而并不适合其他亲和标签和层析方法表一：QIA表达系统的特点和优势特点优势在6XHis和Ni-NTA间高亲和性和选择性吸附在一步法标准纯化过程中的祷告纯度蛋白6XHis tag与Ni-NTA作用不受基质结构约束一步纯化能够在天然和变性条件下使用温和的洗脱条件吸附、冲洗、洗脱失高度的可再生，对蛋白结构没有影响纯化蛋白可以直接应用于下游软件6XHis tag比其他常用标签小的多标签不会影响重组蛋白的结构和功能6XHis tag在生理PH不带电荷6XHis tag不会干扰分泌6XHis tag不会产生抗原性重组蛋白不用事先切除标签Ni-NTA SuperflowNi-NTA Superflow由连接Superflow树脂的Ni-NTA组成。它将出众的机械稳定性和显著的流动特性及高效的动力吸附能力相结合。吸附6XHis-tagged蛋白的能力是5-20mg/ml。这种树脂对于效率生产登记和FPLC的要求允许使用一步法纯化6XHis-tag蛋白。Ni-NTA能力出众，适应试剂范围广泛，例如2M NaCl，10mM DTT，8M尿素，及许多去污剂（表二）局限性Ni-NTA基质不要暴露在高浓度的还原剂中，例如DTT，DTE；高浓度下，这些试剂还原Ni离子还可能阻止吸附6XHIS-Tag蛋白。Ni-NTA基质在还原剂中会变成棕色。很多情况下，-巯基乙醇能够在浓度不高于20mM时使用，DTT兼容性证明浓度可以到10mM。EDTA，EGTA或其他任何强螯合剂吸附Ni离子并将他们从NTA上夺走。NTA基质缺乏NI时变白。使用任何还原剂或螯合剂都要当心，如果不确定，就在小量的Ni-NTA基质上作检测。高浓度的Buffer包含强的给电子集团或者氨基酸例如Arg、Glu、Gly、His，菌液中应该尽量避免。细胞应该被溶解。不要用强的螯合剂如EDTA，强的还原剂如DTT，或者离子去垢剂如SDS。虽然有些例子表明这些试剂小剂量的应用没有问题，但是我们还是不推荐使用。更多的详细信息，见表二Ni-NTA Superflow试剂的兼容性试剂作用建议缓冲液试剂Tris，HEPES，MOPS二级胺或三级胺会还原Ni离子可以用低于100mM。推荐使用磷酸盐螯合剂EDTA，EGTA从基质螯和Ni离子低于1mM有成功的先例，但是应该小心使用硫化试剂-巯基乙醇DTT，DTE阻止二硫键形成。高浓度还原Ni离子高浓度（大于1mM）基质可逆的变棕，取决于Ni的还原。低于10mM证明没有影响纯化和增加Ni的脱落低于20mM可以使用。还原条件下不要储存基质低于10mM DTT可以使用。还原条件下不要储存基质去垢剂非离子去垢剂（Triton，Tween，NP40）阳离子去污剂CHAPS阴离子去污剂（SDS、sarkosyl）TritonX-114去除背景蛋白和核酸去除内毒素低于2%可用低于1%低于1%不推荐，但是低于0.3%有成功地先例低于2%变性剂盐酸胍尿素增溶蛋白低于6M低于8M氨基酸GlyGluArgHis与Ni-NTA吸附，并与6XHis tag 竞争不推荐不推荐不推荐低浓度可用（20mM）于阻止非特异性吸附，高浓度（大于100mM）从Ni-NTA基质洗脱6XHis-tagged蛋白其他添加剂NaClMgCl2CaCl2甘油乙醇BugBuster蛋白提取试剂咪唑碳酸氢钠血红蛋白铵柠檬酸酸盐阻止离子间互作阻止蛋白的疏水作用阻止蛋白的疏水作用与Ni-NTA吸附，并与6XHis tag 竞争300mM至2M都可以用小于4M小于5mM小于50%小于20%按推荐使用低浓度可用（20mM）于阻止非特异性吸附，高浓度（大于100mM）从Ni-NTA基质洗脱6XHis-tagged蛋白不推荐不推荐不推荐低于60mMCartridge连接器Ni-NTA Superflow Cartridge可以手动纯化蛋白（用注射器），也可以自动纯化（使用层析系统，例如AKAT或FPLC系统）。Cartridge进样口和出样口的尺寸和要求的连接器及手动和自动纯化所需适配器详细情况如下表表三 Ni-NTA Superflow Cartridge所需连接器如样口出样口Ni-NTA Cartridge1/16” female(AKTA)M6 male(FPLC) 使用注射器手动纯化1/16”male/luer female(Amersham,code18-1112-51)自动纯化连接器（AKTA1/16”连接器）不需要Union M6 female/1/16” female(Amersham,code18-1123-94)自动纯化连接器(M6装置，FPLC) Union M6 male/1/16” female(Amersham,code18-3858-01)SRTC-2，M6 female(0.5mm i.d.)(Amersham,code18-3856-01)天然或变性条件下的纯化在变性还是天然条件下纯化6XHis-tagged蛋白取决于蛋白的位置和可溶性，6XHis-tag的特性，下游技术的要求以及生物活性都必须要保持，因此如果复性过程是可用的，变性纯化和随后的蛋白折叠复性就要考虑周全天然条件下纯化如果纯化首选而且必须在天然条件下，那么6XHis-tagged蛋白必须要溶解。尽管如此，虽然有许多蛋白出现在包涵体，一般还是有一些可溶物质能够在天然条件下纯化。潜在的无关的影响Ni-NTA基质的无标签蛋白一般在天然条件下要高于变性条件，这个反映在首次的洗液中会出现大量的蛋白。可以用含有低浓度咪唑的裂解液（Lysis Buffer）和清洗液（Wash Buffer）冲洗减少非特异性吸附无特异。有时6XHIs-tag会被天然蛋白的三级结构包埋，因此可溶蛋白要求在能够被 Ni-NTA纯化之前要求变性。作为对照，在变性条件下的平行试验应该要实行：如果只能在变性条件下纯化，Tag能够容易的移到蛋白相反的另一端。变性条件下纯化许多表达系统表达出的高水平的重组蛋白都能够形成不溶的集合体；Ecoli中形成众所周知的包涵体。变性Buffer包含6M尿素或6M盐酸胍，通常用来完全溶解包涵体和6XHis-tag蛋白。变性条件下，蛋白中的6XHis tag会完全暴露因此Ni-NTA基质吸附效率会提高，而且基质减少了非特异性吸附，纯化效率也会升高。变性条件下纯化的6XHis-tagged蛋白可以直接用来试验，或者复性再折叠。蛋白复性和重折叠能够在Ni-NTA cartridge洗脱之前完成，或在溶液中也可以；建议参考QIAexpressionist说明书：天然条件下Ecoli菌液的制备材料和试剂细胞颗粒，Buffer NPI-10，溶菌酶，Benzonase核酸酶（一级纯度，25U/ml，Merck，catno.1.0169.0001）,2XSDS-PAGE样品Buffer，可选择仪器：超声仪Buffer组成参见Appendix A步骤：1、冰上解冻细胞颗粒，用Buffer NPI-10重悬细胞，每克湿重用2-5ml需要多少细胞取决于6XHis-tagged蛋白的表达水平和使用的表达系统。Ni-NTA基质的吸附能力是蛋白依赖性的，一般为20mg/ml。Buffer NPI-10包含10mM咪唑用来降低无标签蛋白和污染蛋白的吸附，并用少量Wash步骤后增加纯度。如果标签蛋白在这些条件下没有被吸附，咪唑的量因该减少到1-5mM。如果6XHis蛋白显示出高吸附亲和力，那咪唑的浓度可以增至20mM。2、加入溶菌酶终浓度1mg/ml（50000units/ml）和Benzonase核酸酶（3U/ml）冰上孵化30Min选择性的，可以加入RNase A（10/ml）和DNase I（5/ml），冰上10-15分，或用小容量的钝的注射器的针头吸吹数次溶解。2a、(可选)冰上超声波破碎 用200-300W的six 10s的脉冲，每个脉冲间隔10S的冷却期。3、4度10000Xg离心菌液20-30分，沉淀细胞残基，收集上清可能会有一定比例的细胞蛋白，包括6XHis-tagged蛋白，仍然未溶而存在于细胞沉淀。为了得到更多的标签蛋白，材料在变性条件下纯化之前必须在变性条件下溶解。4、加入5 2X SDS-PAGE样品Buffer于5上清中，-20度储存以备SDS-PAGE5、纯化过程见说明书说明书：变性条件下Ecoli菌液的制备材料和试剂细胞颗粒；2X SDS-PAGE样品Buffer；Buffer B；可选择：BufferB/7M尿素和Benzonase核酸酶（7M尿素不变性，8M尿素变性）Buffer组成参见Appendix A步骤：1、冰上15分溶解细胞颗粒，Buffer B重悬，每克湿重5ml1a、（可选）冰上15分钟溶解细胞颗粒，BufferB/7M尿素中重悬，每克湿重5ml，加入Benzonase核酸酶，室温（20-25度）孵育30分钟需要多少细胞取决于6XHis-tagged蛋白的表达水平和使用的表达系统。Ni-NTA基质的吸附能力是蛋白依赖性的，一般为20mg/ml。2、室温下窑洞细胞15-60分钟或者用漩涡振荡器轻轻震荡，注意避免泡沫当溶液为半透明时表明溶解完全。3、室温10000Xg离心菌液20-30分钟沉淀菌碎片收集上清（清澈的菌液）4、加入5 2X SDS-PAGE样品Buffer于5上清中，-20度储存以备SDS-PAGE5、纯化过程见说明书说明书：从Ecoli菌液中制备6XHis-tagged胞质蛋白胞质蛋白是蛋白分泌到了Ecoli内膜和外膜之间的胞质中的蛋白。适当的分泌物是可能的，当目的蛋白具有N端信号肽时，他可能在转移时被切掉。为了使用Ni-NTA纯化胞质空间的分泌蛋白，6XHis tag必须被加到目标蛋白的C末端。N末端的6XHis tag将会与转移信号一起处理掉。材料和试剂30mM Tris.Cl；20%蔗糖，PH8.0；500mM EDTA；5mM MgSO4；Buffer NPI-10Buffer成分参见附录A步骤：1、孵育诱导1升的Ecoli产物2、4000Xg离心20分收集细胞产物。重悬沉淀于30mM Tris.Cl；20%蔗糖，PH8.0；每克湿重80ml。保持冰上操作，逐滴加入500mM EDTA至1mM。冰上孵育细胞5-10分钟，轻轻震荡。3、细胞悬浮液在4度8000Xg离心20分钟，弃去上清，用同样体积的冰的5mM MgSO4重悬沉淀。冰盒中震荡或摇动10分钟。4、4度8000Xg离心20分钟上清此时为浓的渗出性液体，其中包含有胞质蛋白5、继续纯化之前需要对上清进行透析除去裂解液。说明书：天然条件下从昆虫细胞制备细胞溶液以下步骤对于昆虫细胞内的6XHis tag蛋白表达的纯化可以作为一个起始的步骤。尽管如此，进一步的优化可能是必须的。肃然在昆虫中的表达效率一般高于哺乳动物的，但是用杆状病毒感染昆虫细胞进行表达还是有一定的困难。表达蛋白水平比在细菌表达系统中得到的要显著的低，一般的少量的细胞材料就可以了。昆虫细胞中总的蛋白含量约为20mg/107个细胞。重组蛋白的表达范围为0.05%-50%，理论上的蛋白最大产量为10g/107个细胞.对于昆虫细胞的裂解，Buffer NPI-10中应该补充1%的LgepalCA-630（NonidetP40）材料和试剂细胞颗粒；PBS，Buffer NPI-10（含有1%的LgepalCA-630（NonidetP40）Buffer组成参见附录A步骤：1、用PBS清洗感染的细胞，1000Xg离心5分钟收集细胞2、用Buffer NPI-10（含有1%的LgepalCA-630（NonidetP40）溶解细胞，没1-2X107用4ml。冰上孵育10分钟。 裂解Buffer应该包含有咪唑。对于6XHis-tagged蛋白，小于20mM咪唑不会影响吸附材料。尽管如此，如果标签蛋白在这些条件下没有被吸附，咪唑浓度就应该 降低到5-10mM3、4度10000Xg离心菌液10分钟沉淀细胞碎片和DNA，收集上清 上清中包含6XHis-tagged蛋白4、加入5 2X SDS-PAGE样品Buffer于5上清中，-20度储存以备SDS-PAGE5、纯化过程见说明书说明书：使用注射器人工纯化6XHis-tagged蛋白预先准备：使用柱子之前，滤膜过滤（0.2或0345m）或离心菌液(大于10000Xg)保证无杂质材料和设备包含6XHis-tagged蛋白的清澈的细胞液。Buffer NPI-10，NPI-20，NPI-250（天然条件）或BufferB、C、E（变性条件）。所有的Buffe字使用前都因该过滤（0.2或0345m）。 10ml注射器。连接适配器。步骤：1、用BufferNPI-10（天然条件）或Buffer B（变性条件）吸满注射器，连接合适的适配器，推注射器排除气体直至液体从适配器底部流出。2、连接注射器与cartridge的入口，把出口的塞子拿掉3、10倍体积Buffer平衡cartridge 不要用高压强行使Buffer流出。理想流速是1ml/min（1ml cartridge）和5ml/min(5ml rtridgecat)4、移去注射器并填满清澈的菌液。菌液流速要求与步骤3相同5、用一个新的注射器和相同的流速（步骤3、4），10倍体积的Buffer NPI-20（天然条件）或Buffer C（变性条件）冲洗（Wash）cartridge。6、用Buffer-NPI 250（天然条件）或Buffer E（变性条件）填满注射器，使用推荐的流速从cartridge洗脱（Elute）蛋白。蛋白一般会被5-10倍柱体积液体洗脱说明书：使用自动层析系统纯化6XHis-tagged蛋白说明书适用于液体层析系统（如AKAT货FPLC系统）。在平衡，装载，冲洗，洗脱过程中的背景压力一般会由系统产生。不要让压力超过5Bar（0.5MPa）材料和仪器包含6XHis-tagged蛋白的清澈的细胞液。使用柱子之前，滤膜过滤（0.2或0345m）或离心菌液(大于10000Xg)保证无杂质。Buffer NPI-10，NPI-20，NPI-250（天然条件）或BufferB、C、E（变性条件）。所有的Buffe字使用前都因该过滤（0.2或0345m）。连接适配器。步骤;1、 用BufferNPI-10（天然条件）或Buffer B（变性条件）吸满系统泵，cartridge连接泵的出口，小心操作，不要让气体进入系统。2、 移去cartridge出口的塞子，连在系统的管子上3、10倍体积Buffer平衡cartridge 1ml/min（1ml cartridge）和5ml/min(5ml rtridgecat)4、 使用系统泵或superloop载入清澈的细胞液进入cartridge。保证目标蛋白吸附在Ni-NTA基质上，保留流出的部分作为SDS-PAGE分析5、用Buffer-NPI 20（天然条件）或Buffer C（变性条件）填满系统泵，冲洗（Wash）cartridge直至A280回到基础值 保留洗液用于SDS-PAGE分析6、用Buffer-NPI 250（天然条件）或Buffer E（变性条件）从cartridge洗脱（Elute）蛋白蛋白一般会被5-10倍柱体积液体洗脱。用超过20倍体积的平缓的线性梯度洗液有助于分离蛋白。问题解决方法背景压力超过5Bar（0.5MPa）a) 柱子阻塞 实施定位清洗（附录B） cartridge吸附的菌液可能含有碎片。上柱前滤膜过滤或离心b) 使用了高粘性 Buffer 有机溶剂或稳定装置例如甘油会导致背景压力的增大，降低流速 蛋白未被吸附a）6XHis tag没有出现 检查表达载体的结构。保证阅读框的准确性 检查可能的转移起始端（N末端 tag）或者未成熟的终止端( C末端)b) 6XHis tag量很少 变性条件下纯化。把标签转移到蛋白相反的末端c）6XHis tag降解 检查6XHis tag是否与蛋白相连接D）吸附条件不正确 检查Buffer的PH。尿素的裂解经常导致PH的不稳定。在使用前应该检查PH蛋白洗脱在wash BufferA）6XHis tag部分被隐藏 变性条件纯化B）Buffer成分不正确 检查变性Wash Buffer的PH纯化过程蛋白突然沉淀A） 温度太低 室温下进行纯化操作B） 蛋白形成聚合体加入促溶试剂如0.1% Triton X-100或Tween-20，20mM-ME，2M NaCl，或稳定辅助因子如Mg离子。这些都是Buffer 必须的，能保持蛋白的溶解性蛋白未被洗脱（Elute）A） 蛋白在cartridge中沉淀变性条件洗脱B） 蛋白仍然吸附在cartridge上检查变性溶液的PH。如果需要调整到4.5蛋白洗脱包含污染物 污染物是切去标签的蛋白 检查可能的转移起始端（N末端 tag）或者未成熟的终止端( C末端) 纯化过程阻止蛋白的降解，4度操作并使用蛋白抑制剂附录A：Buffer 成分NPI-10（天然条件Binding/Lysis Buffer，1L）50mM NaH2PO4 6.90g NaH2PO4H2O(MW 137.99g/mol) 300mM NaCl 17.54g NaCl(MW68.08g/mol) 10mM imidazole 0.68g咪唑(MW68.8g/mol) NaOH调整PH至8.0，滤膜过滤当从昆虫细胞或动物细胞制备清澈的菌液时，1%lgepal CA-630(Nonidet P40)应该加入到LysisBuffer中NPI-20(天然条件Wash Buffer，1L )50mM NaH2PO4 6.90g NaH2PO4H2O(MW 137.99g/mol) 300mM NaCl 17.54g NaCl(MW68.08g/mol) 20mM imidazole 1.36g咪唑(MW68.8g/mol) NaOH调整PH至8.0，滤膜过滤NPI-250（天然条件Elution Buffer.，1L）50mM NaH2PO4 6.90g NaH2PO4H2O(MW 137.99g/mol) 300mM NaCl 17.54g NaCl(MW68.08g/mol) 250mM imidazole 17.0g咪唑(MW68.8g/mol) NaOH调整PH至8.0，滤膜过滤BufferB（变性条件Lysis/Binding Buffer，1L）8M 尿素 480.50g尿素（60.06g/mol）100mM NaH2PO4 13.80g NaH2PO4H2O(MW 137.99g/mol) 100mM TrisCl 12.10g Tris(MW121.1g/mol)HCl调整PH至8.0，滤膜过滤BufferB/7M尿素（变性条件Lysis/Binding Buffer，1L）7M 尿素 394.20g尿素（60.06g/mol）100mM NaH2PO4 13.80g NaH2PO4H2O(MW 137.99g/mol) 100mM TrisCl 12.10g Tris(MW121.1g/mol)HCl调整PH至8.0，滤膜过滤BufferC（变性条件Wash Buffer，1L）8M 尿素 480.50g尿素（60.06g/mol）100mM NaH2PO4 13.80g NaH2PO4H2O(MW 137.99g/mol) 100mM TrisCl 12.10g Tris(MW121.1g/mol)HCl调整PH至6.3，滤膜过滤BufferE（变性条件Elution Buffer，1L）8M 尿素 480.50g尿素（60.06g/mol）100mM NaH2PO4 13.80g NaH2PO4H2