蛋白质免疫印迹技术及常见问题ppt课件

免疫印迹技术的基础-免疫反应,免疫测定(immunoassay) 利用抗原抗体 反应来测定标本中抗原或抗体的方法 检测对象：具体免疫活性的物质 反应特性：高度的特异性和敏感性,Western Blot原理简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析,内容概要,在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。,Western Blot 原理,目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析,Western Blot 的应用,Western Blot原理简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析,内容概要,蛋白样品的定量,Bradford法 考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。 TIANGEN产品 Bradford蛋白质定量试剂盒,不连续的电泳缓冲体系。 SDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶成分,N,N-亚甲双丙烯酰胺和丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液,凝胶浓度与蛋白分离范围,转膜,湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。 半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转1030min。,转膜方法,丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。,转膜后检测,转膜后的封闭,脱脂奶粉 BSA Western Blot 膜封闭液 （生物试剂公司提供）,把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入封闭剂，摇床上平缓摇动，于室温温育1-2小时。倒掉缓冲液，立即加入一抗溶液与滤膜温育。,一抗用量也根据0.1ml/cm2来计算，室温1-2小时。 倒掉一抗溶液，用250ml PBS漂洗液滤膜3次，每次 10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温温育 1-2小时。,一抗、二抗孵育,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法 碱性磷酸酶法 化学发光显色法,AntiHis,应用举例：用Western blot检测患者 血清中的HIV病毒抗体,Step1：经电泳将HIV混合抗原按分子量大小分离,Step2：印迹转移已分离的抗原至硝酸纤维膜上，封闭,Step3：加入待检病人血清，漂洗,Step4：加入合适的、标记的二抗（HRP或AP），漂洗,Step5：加入显色底物（或放射自显影），显色检测,Western Blot原理简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析,内容概要,Western blot常见问题SDS-PAGE电泳,胶不平？ 凝胶漏液？,胶板洗刷干净 加入AP和TEMED的量要合适 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 两块玻璃板底部要对齐,Q,A,条带比正常的窄？ “微笑”或“倒微笑”条带？,凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适,Western blot常见问题SDS-PAGE电泳,Q,A,凝胶肿胀或卷曲？ 条带歪斜或漂移？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的纸片 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温,Western blot常见问题转膜及抗体检测,Q,A,蛋白分子量 10KD 蛋白的等电点=8 SDS浓度不合适 凝胶太厚,蛋白分子量10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜 更换高pH值Buffer 在阴极buffer中加入0.005 - 0.01% SDS 可提高转膜效率 延长转膜时间,Western blot常见问题蛋白转膜效率低,A,R,Western blot常见问题显色背景高,一抗不是唯一特异的 二抗出现非特异结合,制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点 设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合,A,R,Western blot常见问题显现非特异性条带,分子量Marker：确定蛋白条带的分子量 已知量标准产物的正对照 空白载体对照：如果是表达蛋白需要做表达前的 内参：看家基因编码表达的蛋白,参照体系,TIANGEN产品结构底物显色液,HRP-DAB